大連理工大學博士學位論文 摘要 由于鋅離子在生命過程中起著許多重要作用，分析和檢測細胞中的鋅離 子成為近年來的研究熱點。但普通的分析方法，如紫外一可見光譜、核磁共振 光譜、電子順磁共振光譜等都不能用于檢測這種生物體系中特殊的金屬離子。 熒光分子探針檢測法不僅簡便，而且靈敏度、選擇性、時間分辨、實時原位 檢測方亟均有突出優(yōu)點。因此，應用熒光探針體系在一個比較寬的濃度范圍 內(nèi)定量檢測和反映z n 2 + 的流量和水平，對進一步了解z n 2 十在生物體系內(nèi)的作 用具有重要意義。 基于碳酸酐酶( c a ) 芳香磺酰胺抑制劑相互作用的原理，設計合成了3 個化合物d l 、d 2 和d 3 。其中，在生理條件下( p h7 4 ) ，d 2 與z n 2 + 結(jié)合后， 九。從5 4 0 n m 藍移到5 2 0 n m ，熒光強度增大近4 倍。表觀解離常數(shù)( k d ) 在納 摩爾范圍內(nèi)，在生物應用中具有足夠的敏感性。另外，多種生物體中重要的 金屬離子( 如c a 2 + 、m 9 2 + ) 等對d 2 的熒光沒有影響。 基于p e t 原理，設計合成了以4 一氨基1 ，8 - 萘酰亞胺為熒光圈的化合物 n 1 、n 2 和n 3 。在t r i s h c i 中性緩沖溶液中，n 2 的最大吸收和發(fā)射波長都在 可見光區(qū)，加入z n 2 + 后，熒光強度增大5 倍，翰為0 8 n m ，活細胞中的顯微 成像表明，n 2 能夠很好地進入細胞中并對z n 2 + 表現(xiàn)出熒光增強。 設計合成了三個以酰胺n 原子為反應位點的1 ，8 萘酰亞胺化合物n 4 、 n 5 和n 6 。水溶液中p h7 4 時，n 4 和n 5 的熒光量子產(chǎn)率均為0 0 0 4 ，加入飽 和z n 2 + 后，m 分別增大4 3 和2 3 倍；p h5 時，加入z n ”后，m 分別增大3 0 和 1 0 倍。這樣，n 4 和n 5 相對h + ，對z n 2 + 表現(xiàn)出良好的選擇性熒光增強。理論 計算表明，分子內(nèi)氫鍵可抑制h + 對熒光強度的影響，這為p e t 探針克服h + 的影響提供了一個全新的思路。 基于p e t 原理，設計合成了l ，3 ，5 ，7 一四甲基8 苯基化硼為熒光基團、d p a 為識別基團的z n 2 + 熒光分子探針b 1 。中間體2 分子模型的二吡咯甲基硼是平 面結(jié)構(gòu)，而b l 的這部分結(jié)構(gòu)表現(xiàn)彎曲的構(gòu)型。加入z n ”前后的熒光量子產(chǎn)率 增大1 1 倍，達到o 8 5 7 。p k 。低至2 1 ，是目前發(fā)現(xiàn)p k a 最低的z n ”熒光探 針。b 1 z n 2 + 絡合物的熒光強度在p h 寬達3 1 0 范圍內(nèi)不受h + 的影響。活細 胞內(nèi)熒光顯微成像表明該探針能夠穿透細胞并反映細胞內(nèi)z n ”的分布狀況。 關鍵詞：熒光，熒光分子探針，光誘導電子轉(zhuǎn)移，z n ”，二( 2 一吡啶甲基) 胺 氫質(zhì)子 二( 2 一吡啶甲基) 胺為識別基團z n2 + 熒光分子探針的研究 a b s t r a c t a n a l y s i sa n dd e t e c t i o no fz n 2 + i nc e l l s i s v e r ys i g n i f i c a n ta s i th a sm u l t i p l ea n d i m p o r t a n tr o l e si nl i v i n gp r o c e s s b u tm a n yn o r m a la n a l y s i st e c h n i q u e s ，f o re x a m p l e s ， u v - v i ss p e c t r u m ，n m ra n de p rc a n n o tb eu s e dt od e t e c tt h es p e c i a lm e t a li o n si n l i v i n gt h i n g s t h ef l u o r e s c e n c em e t h o di s n o to n l ys i m p l eb u ta l s oe x c e l l e n ti nr e a l s p a c e ，r e a lt i m e ，h i g hs e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t y t h e r e i s i m p o r t a n ts i g n i f i c a n c et o u n d e r s t a n dt h em u l t i p l er o l e so fz i n cw i t ha v a i l a b i l i t yo ff l u o r e s c e n tp r o b es y s t e m s p e r m i t t i n gq u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o na n di m a g i n go fz i n cf l u x e sa n dl e v e l so v e ra b r o a dc o n c e n t r a t i o nr a n g e b a s e d0 1 1c a r b o n i ca n h y d r a s e ( c a ) - s u l f o n a m i d ei n h i b i t i o n ，t h r e ef l u o r e s c e n tp r o b e s d 1 ，d 2a n dd 3w e r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d ，u n d e rp h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n s ，t h e e m i s s i o nm a x i m u mw a v e l e n g t ho fd 2w a sb l u es h i f t e df r o m5 4 0 n mt o5 2 0 n m u p o n a d d i t i o no fz n ”，a n dt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ye n h a n c e dn e a r l y4 - f o l d t h ea p p a r e n t d i s s o c i a t i o nc o n s t a n t ( k d ) i si nt h es u b n m r a n g e ，a n d i t sf l u o r e s c e n e ew a sn o t i n d u c e d b y o t h e r b i o l o g i c a l l yi m p o r t a n t c a t i o n ss u c ha sc a 2 + a n dm 9 2 + u n d e r p h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n s t h r e e c o m p o u n d sn 1 ，n 2 a n dn 3b a s e do n 4 - a m i n o 1 ，8 - n a p h t h a l i m i d e w e r e d e s i g n e d a n d s y n t h e s i z e d i n t r i s - h c ln e u t r a l b u f f e r s ，b o t ht h ea b s o r p t i o n a n d e m i s s i o nm a x i m u mw a v e l e n g t ho fn 2a r ei nt h ev i s i b l er a n g e u p o na d d i t i o nz n ”， t h ef l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n ti s5 - f o l da n d k d i s 0 8 n m u s i n g f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y ，t h ep r o b ei ss h o w n t ob ec a p a b l eo f i m a g i n gi n t r a c e l l u l a rz n ”c h a n g e s as e r i e so ff l u o r e s c e n tp r o b e sn 4 ，n 5a n dn 6b a s e do np e tw e r ed e s i g n e da n d s y n t h e s i z e dw i t hi m i d ea sr e a c t i o np o s i t i o no f1 ，8 - n a p h t h a l i m i d e i np h 7 4a q u e o u s s o l u t i o n ，b o t hq u a n t u my i e l d so fn 4a n dn 5a r e0 ，0 0 4 ，u p o na d d i t i o no fs a t u r a t i n g z n ”，t h eq u a n t u my i e l d si n c r e a s e d4 3a n d2 3 一f o l d ，r e s p e c t i v e l y a tp h5 ，t h e ya r e3 0 a n d10 - f o l d ，r e s p e c t i v e l y s o ，c o m p a r e dt o h + ，t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y c a nb e e n h a n c e d s e l e c t i v e l yb y z n ”t h e o r e t i c a lc a l c u l a t i o n ss h o wt h a ti n t r a m o l e c u l a r h y d r o g e nb o n d i n g c a ni n h i b i tt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y ，w h i c hp r o v i d e san e wi d e at o a v o i dt h ea f f e c t so fh + f o rp e tf l u o r e s c e n tp r o b e s ap e tf l u o r e s c e n c e p r o b e b 1f o rz n 2 + t h a tu t i l i z e s 1 ，3 ，5 ，7 一t e t r a m e t h y l 一8 一p h e r t y l - b o r o nd i p y r r o m e t h e n e a sa r e p o r t i n gg r o u p a n d d i ( 2 一p i c o l y l ) a m i n e a s ac h e l a t e rf o rz n ”w a s s y n t h e s i z e d a n dc h a r a c t e r i z e d i i 大連理_ 大學博= e 學位論文 m o l e c u l a rm o d e lo fi n t e r m e d i a t e2 g i v e s a p l a n a rc o n f o r m a t i o n o ft h e b o r o n d i p y r r o m e t h e n em o i e t y ，w h i l et h a t o fb 1e x h i b i t sac u r v e d c o n f o r m a t i o n u p o n a d d i t i o no fs a t u r a t i n gz n ”，t h eq u a n t u my i e l do fb 1i n c r e a s e d11 一f o l d a n du pt o o 8 5 7 w i t hp k ao f 2 1 ，u pt on o w ，b 1h a st h el o w e s tp k l ai na nt h ez n ”p r o b e st h e f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo f b 1 一z n 2 + c o m p l e x i sp h i n d e p e n d e n ti nt h er a n g eo f p h 3 - 10 u s i n gf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ，t h ep r o b ei ss h o w nt ob ec a p a b l eo fp e n e t r a t i n gi n t o l i v i n gc e l l sa n di m a g i n gi n t r a c e l l u l a rz n ”d i s t r i b u t i o n k e y w o r d s ：f l u o r e s c e n c e ， f l u o r e s c e n t p r o b e s ，p h o t o i n d u c e d e l e c t r o nt r a n s f e r ( p e t ) ，z n “，b i s ( 2 p i c o l y l ) a m i n e ，p r o t o n i i i 獨創(chuàng)性說明 作者鄭重聲明：本博士學位論文是我個人在導師指導下進行的研 究工作及取得研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的 地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫的研究成果，也不包含 為獲得大連理工大學或其他單位的學位或證書所使用過的材料。與我 一同工作的同志對本研究所做的貢獻均己在論文中做了明確的說明并 表示了謝意。 作者簽名：日期： 大連理工大學博士學位論文 1 。1 概述 第一章前言 化學、生物學和材料科學中至關重要的識別事件往往發(fā)生在一個為人們 所不熟知的微觀世界里。但這些識別事件的信號可以通過建立具有特殊目的 的分子器件以光的形式表達出來。所以，人們設計、合成了大量能夠?qū)⒎肿?識別事件通過分子的熒光信號來有效表達的復雜熒光分子，這些分子也就是 所謂的熒光分子探針【1 1 。 熒光分子探針( f l u o r e s c e n tm o l e c u l a rp r o b e ) 、熒光分子開關( f l u o r e s c e n t m o l e c u l a rs w i t c h ) 和熒光分子傳感器( f l u o r e s c e n tm o l e c u l a rs e n s o r ) 是在熒光 分子識別( f l u o r e s c e n tm o l e c u l a rr e c o g n i t i o n ) 中經(jīng)常使用的概念。熒光分子 探針是其中內(nèi)涵最廣的一個概念，一般說來，凡是在一定體系內(nèi)，當某種物 質(zhì)或體系的某一物理性質(zhì)發(fā)生變化時，該分子的熒光信號能發(fā)生相應的改變， 這種分子就可稱為某一物質(zhì)或物理性質(zhì)的熒光分子探針；熒光分子開關是指 在識別過程中熒光信號有明顯強弱變化的熒光分子探針；熒光分予傳感器是 指在識別過程中分子熒光信號能夠快速、可逆響應的熒光分子探針。所謂分 子識別是指分子之間( 主體與客體或稱之為受體與底物) 選擇性地結(jié)合并產(chǎn) 生某種特定功能的過程。單純的結(jié)合不是識別，識別是有目標的結(jié)合，它是 通過一系列結(jié)構(gòu)確定的分子間相互作用而組成的模式識別過程。結(jié)合形成的 識剮體系的穩(wěn)定性和選擇性，是由形成過程中的能量和信息量來表征的膽一j 。 熒光分子探針的設計在分析化學、i 臨床生物化學、醫(yī)學以及環(huán)境科學等 眾多學科中都占有重要的地位。很多化學和生物化學領域的被分析物都可以 用熒光方法測得，如陽離子( h + 、l i + 、n a + 、k + 、c a 2 + 、m 9 2 + 、z n 2 + 、p b ”、 a 1 ”和c d 2 + 等) ，陰離子( 鹵離子、檸檬酸根、羧酸根、磷酸根和a t p 等) ， 中性分子( 糖類) 和氣體( 0 2 、c 0 2 ，和n o 等) 4 1 。本論文主要研究的是陽離 子( 過渡金屬離子z n 2 十、重金屬離子以及氫離子) 的熒光探針，所以本章主 要介紹熒光分子探針的作用原理以及近年來報道的過渡余屬、重金屬和z n ” 二( 2 一吡啶甲基) 胺為識別基團z n 2 + 熒光分子探針的研究 熒光分子探針取得的最新進展。 k ，r u r a e k 對已有的過渡金屬及重金屬離子絡合促進的熒光發(fā)射探針的原 理進行了如下描述”j ：在過去的幾年中，利用熒光分子傳感器，實時、原位 分析過渡金屬和重金屬離子的研究受到了廣泛的關注。由于這類盒屬離子多 數(shù)都對有機染料分子的熒光具有內(nèi)在的淬滅作用，最近的許多研究多致力于 設計具有金屬絡合誘導熒光增強的探針分子。這種探針在增強選擇性和敏感 性方面被寄予厚望。然而，到目前為止，雖然在這個研究領域中利用了多種 多樣的光物理和光化學機理以及傳感器分子的化學結(jié)構(gòu)，但很少有關于建立 理性分子探針設計基本觀念的嘗試。e k i m u r a 認為理想的傳感器分子應具有 以下特征：熒光探針分子自身穩(wěn)定，對某種金屬離子高選擇性、高敏感性、 快速可逆響應( 實時) 、微米水平上原位響應并易于操作 6 ，”。熒光分子探針 的主要應用領域是生物、醫(yī)學和環(huán)境監(jiān)測，所以在水溶液中的識別更具有潛 在的廣泛應用價值。另外，許多探針分子的熒光性質(zhì)會受質(zhì)子的影響，在水 溶液中可通過緩沖溶液控制穩(wěn)定的p h 值，使識別研究的結(jié)果更可靠。但由于 水分子對金屬離子較強的水合作用以及水分子和探針分子識別基團較強的結(jié) 合能力，使水溶液中的金屬離子識別比有機溶劑中具有更大的難度 8 】。 綜上所述，通常評價熒光分子探針的性能應主要考慮其靈敏性、選擇性、 實時性和原位檢測性能等四方面因素。其中，影響靈敏性的因素有許多：首 先，探針分子與被檢測物的結(jié)合強度是識別靈敏性的前提；其次，識別信息 的熒光信號轉(zhuǎn)換效率同樣影響識別靈敏性，熒光增強的探針一般會比熒光淬 滅的探針靈敏性高；另外，熒光團的發(fā)射波長、量子產(chǎn)率、斯托克斯位移、 背景熒光干擾等也會影響探針的檢測靈敏性；靈敏性還與儀器陛能有關。而 選擇性則主要取決于探針與被檢測物特異性的結(jié)合；有時某些被結(jié)合的客體 可直接影響熒光團的發(fā)射性能，這種情況下識別選擇性還與被結(jié)合的客體性 質(zhì)有關；專一選擇性是最好的。實時性主要包括識別響應的速度和可逆性兩 方面，如果可逆響應的速度快于或與被檢測客體的變化速度相匹配，則可稱 之為實時響應探針；原位檢測性能主要取決于探針分子與被檢測體系的相溶 性，探針能以獨立的分子狀態(tài)分散于被檢測體系并發(fā)出識別信號；從目前的 大連理工大學博士學位論文 實際情況來看，水溶性探針比非水溶性探針好；在一定限度內(nèi)，熒光探針檢 測的空間分辨率取決于儀器t 9 。 1 2 熒光分子探針識別原理 1 21 光誘導電子轉(zhuǎn)移1 ，1 o ，1 13 ( p e t ，p h o t o i n d u c e d e l e c t r o nt r a n s f e r ) u 腑十一 u 。洲。 _ 滯一啪 l 啊帕 h o 嘲o 器溜品稚斌器晶 禮責蒜蕊熊 卜t i o o 黜r m 憫土m 黼 ?？軣?、 圖1 1p e t 熒光分子探鐘識別金屬離子的理論示意蹦 在各種陽離子熒光分子探針中以p e t 為設計原理的熒光分子探針是人們 最為廣泛研究的。如圖卜1 所示，典型的p e t 體系是由包含電子給體的受體 部分r e c e p t o r ，通過間隔基s p a c e r ( 如一c h 2 c h 2 ) 和熒光團f l u o r o p h o r e 相連 而構(gòu)成的。其中熒光團部分是光能吸收和熒光發(fā)射的場所，受體部分則結(jié)合 客體，這兩部分被間隔基隔開，又靠間隔基相連而成一個分子，構(gòu)成了一個 在選擇性識別客體的同時又給出光信號變化的分子體系。p e t 熒光分子探針 中，熒光團與受體單元之間存在著光誘導電子轉(zhuǎn)移，對熒光有非常強的淬滅 作用。因此在未結(jié)合客體之前，探針分子不發(fā)射熒光或熒光很弱。一旦受體 與客體相結(jié)合，光誘導電子轉(zhuǎn)移作用受到抑制，甚至被完全阻斷，熒光團就 會發(fā)射熒光。由于與客體結(jié)合前后的熒光強度差別很大，呈明顯的“關”、“開” 狀態(tài)，這類探針又被稱作熒光分子開關p e t 分子探針設計原理明確，特別 是對于堿金屬、堿土金屬和氫離子，、通常都可獲得熒光增強效果。p e t 熒光 二( 2 一吡啶甲恭) 胺為識別基團z n2 + 熒光分于探針的研究 分子探針的作用機制可由前線軌道能量來說明( 圖1 1 ) ，具體工作過程如下： 激發(fā)熒光團，具有電子給予能力的識別基團能夠?qū)⑵涮幱谧罡吣芗壍碾娮愚D(zhuǎn) 入激發(fā)態(tài)熒光團因電子激發(fā)而空出的電子軌道，使被光激發(fā)的電子無法直接 躍遷回原基態(tài)軌道，導致熒光團熒光淬滅。識別基團結(jié)合金屬離子后，其氧 化還原電位升高致使相應的最高能級能量低于熒光團，也就降低了識別基團 的給電子能力，p e t 過程被減弱或不能發(fā)生，熒光團的熒光恢復。 很多研究小組包括c z a r n i k 1 2 , 1 3 l ，f a b b r i z z i 1 4 16 1 ，t s i e n l l 7 ，18 1 ，k u h n 1 9 1 ： d e s v e r g n e 和b o u a s l a u r e n t 2 。，2 ，s h i n k a i 2 2 , 2 3 】以及d es i l v a l l ，2 4 。2 6 1 等對p e t 熒 光探針的研究都作出了貢獻。己報道的p e t 熒光開關分子中，多數(shù)是以脂肪 氨或氮雜冠醚作為受體單元。式1 1 中所示的四個分子都是以蒽作為熒光母 體，亞甲基或酰胺鍵作為間隔基連接不同的受體所構(gòu)成的p e t 熒光分子探針。 1 在甲醇中和k + 絡合后，熒光量子產(chǎn)率從o 0 0 3 增加至0 1 4 2 ?；衔? 能 和c u 2 + 及n i 2 + 絡合，并把它們從二價氧化到三價，葸熒光的淬滅是由于一個 電子從還原態(tài)的二價金屬轉(zhuǎn)移到葸上【2 8 1 。d es i l v a 利用類似e d t a 結(jié)構(gòu)的氮 羧酸基設計的化合物3 1 2 9 】是一種螯合型的p e t 探針分子，識別基羧酸基團形 成的空穴可以有效地螫合堿土金屬c a ”和m g ”。 1 23 4 式1 - 1p e t 熒光探針 sc he m e1 1f o u rp e tf lr i or c s c e b c tpr o b e s 大多數(shù)p e t 熒光探針分子的設計是基于受體與客體的結(jié)合，使光誘導電 4 大連理工大學博士學位論文 子轉(zhuǎn)移受到抑制，熒光團熒光恢復的原理設計的( 圖1 1 ) ( “o f f o i l ”開關) ， 但對于過渡金屬，其它的p e t 機理也可能起作用。由于過渡金屬離子的3 d 電子的氧化還原行為，可以發(fā)生從熒光團到鍵合的過渡金屬的電子轉(zhuǎn)移，或 者從過渡金屬向熒光團的電子轉(zhuǎn)移，因此可以通過無輻射能螢轉(zhuǎn)移導致熒光 淬滅?；衔? t 3 0 l 的受體為硫雜冠醚。雖然硫雜冠醚與c u 2 + 之間有很強的親 和能力，該分子的設計也是基于p e t 過程，但不同的是，與c u ”配位后，產(chǎn) 生了從熒光團到金屬離子的p e t 過程，導致熒光淬滅。這也是d es i l v a 所介 紹的p e t 過程的另一種表現(xiàn)形式，“o n o f f ”開關。值得注意的是，4 與2 在 和c u 2 + 絡合后，都是發(fā)生熒光淬滅，它們淬滅的機理就是上述所描述的兩種 反p e t 行為。 p e t 探針不僅可以識別陽離子，也越來越多地用來識別中性分子。n a g a n o 等設計了識別單線態(tài)氧及n o 的p e t 熒光分子探針。d a m b o ph 【引1 熒光量子 產(chǎn)率是o 0 0 2 ，這是由于光激發(fā)后，電子從氨基轉(zhuǎn)移到毗咯環(huán)，熒光淬滅。當 d a m b o p ”和n o 反應后，光誘導電子轉(zhuǎn)移不能發(fā)生，熒光恢復，d a m b o p h t 的熒光量子產(chǎn)率達到0 7 4 。 、擴矽 r 奄將印旨螺一“ d a m b o p h a l m o s t1 1 0 1 1 - f l u o r e s c e n t d a m b o p h t h i g h l yf l u o r e s c e n t 式1 - 2 識別n o 的p e t 熒光探針 s c h e n l e1 - 2p e tf l u or e s c c n tpr o b ef o rn o 二( 2 毗碇甲基) 胺為識別基團z n2 + 熒光分予探針的研究 1 2 2 分子內(nèi)共軛電荷轉(zhuǎn)移1 1 ，1o ，川( i c t ，i n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r ) 文獻中將這一原理也稱為光誘導電荷轉(zhuǎn)移( p c tp h o t o i n d u c e dc h a r g e t r a n s f e r ) 。典型的i c t 熒光分子探針是由熒光團與識別基團直接相連構(gòu)成。在 熒光團的兩邊分別連有吸電子基團( 電子受體) 與供電子基團( 電子給體) ， 并且供電子基或吸電子基本身又充當識別基團或識別基團的部分。當熒光 團被光激發(fā)后，會進一步增加分子內(nèi)從電子給體到電子受體的電荷轉(zhuǎn)移。當 識別基團與客體結(jié)合后，會對熒光團的推拉電子體系產(chǎn)生影響( 增強或減弱 電荷轉(zhuǎn)移) 。隨之發(fā)生的熒光團偶極距的變化，會導致熒光光譜的變化，主要 表現(xiàn)為熒光光譜紅移或藍移( 如圖1 2 所示) 。一般情況下，i c t 熒光分子探 針對熒光強度的影響不如p e t 探針那么顯著。 蝴t i e h i t i t 州 哪毛t 圖1 - 2 c t 熒光分子探針在金屬離子與其電子給體或電子受體結(jié)臺作削扁熒 光光譜移動方向 f i g u r e 1 - 2 s p e c t r a d i s p l a c e m e n t s o fp c ts e n s o r sr e s u l t i n gf r o mi n t e r a c t i o no fab o u n dc a t i o n w i t h8 n e l e c t r o n d o n a t i n go re l e c t r o n w i t h d r a w i n gg r o u p 6 大連理工大學博士學位論文 5 是典型的i c t 熒光探針 3 2 1 ，氮雜冠醚既是推拉電子體系中的電子給體， 又是探針分子中的識別基團。當冠醚與堿土金屬離子如c a ”絡合時，由于會 屬離子的拉電子效應，降低了氮雜冠醚中氮原子的供電子能力，因此發(fā)生熒 光藍移，并且熒光增強。識別基團是電子受體的i c t 熒光探針如化合物6 【”】， 分子中二甲氨基與氮雜冠醚均為電子給體。當冠醚與堿土金屬c a 2 + 結(jié)合后， 冠醚的拉電子能力增強，使整個體系成推一拉電子體系，因此熒光發(fā)生紅移。 化合物7 】中的苯并冠醚與香豆素之間有氧橋相連，在乙腈中與c a ”結(jié)合后吸 收光譜顯著紅移，熒光略有下降。這種現(xiàn)象可解釋為由于橋基的長度，使鍵 合后的金屬離子有可能以種更接近予羰基氧的構(gòu)型存在，促進了熒光團向 苯并冠醚的電荷轉(zhuǎn)移。多數(shù)i c t 熒光分子探針在結(jié)合金屬離子后，熒光強度 的變化不如p e t 探針分子明顯，但8 p 4 是一個特例，它與l i + 絡合后熒光強度 增大9 0 倍，而與m 9 2 + 絡舍后熒光強度增大2 2 5 0 倍。 5 6 7 8 式1 3i c t 熒光探針 s c h e m e1 - 3i c tf l u o r e s c e n tp r o b e s 在i c t 中，有一種情況被稱為扭曲的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移( t i c t ，t w i s t e d i n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r ) 。具有推一拉電子共軛體系的熒光分子中，如果 推電子基( 如二甲亞胺) 通過可旋轉(zhuǎn)的單鍵與熒光團相連，當熒光團被光激 發(fā)時，由于強烈的分子內(nèi)光誘導電荷轉(zhuǎn)移，連接電子給體與熒光團的單鍵會 二( 2 吡睫甲基) 胺為識別基團z n 2 + 熒光分子探針的研究 發(fā)生扭轉(zhuǎn)，使原來與芳環(huán)共平面的電子給體與芳環(huán)平面處于正交狀態(tài)，原來 的共軛體系被破壞，部分電荷轉(zhuǎn)移變?yōu)橥耆碾娮愚D(zhuǎn)移，形成t i c t 激發(fā)念， 原有的i c t 熒光則被淬滅。t i c t 態(tài)往往無熒光或者發(fā)射非常弱的長波長熒光， 少數(shù)情況下出現(xiàn)i c t 與t i c t 雙重熒光現(xiàn)象 3 5 , 3 6 。 c n 毒 式1 - 4t i c t 熒光探針 s e l a e m e1 4t i c tf lk 1 0 1 e s c e l l tp r o b e s c n r f l l 乙nh n h h n 化合物9 t 3 6 是典型的能夠發(fā)生雙熒光的t i c t 熒光分子探針，以該化合物 為母體的衍生物被廣泛地用于t i c t 雙熒光現(xiàn)蒙的各種研究中【”l ，多年來該 化合物一直倍受關注【38 1 ?；衔飈 o 表現(xiàn)為單重熒光 3 9 1 。化合物l l l 4 0 3 表現(xiàn)為 雙重熒光，短波發(fā)射帶是局部激發(fā)態(tài)產(chǎn)生的，長波發(fā)射帶來源于t i c t 態(tài)，與 陽離子結(jié)合后，由于氮雜冠醚與陽離子的相互作用，長波吸收帶強度下降。 化臺物1 2 4 l 表現(xiàn)出非常特殊的三重熒光。第三重熒光的產(chǎn)生取決于溶劑、p h 和鍵合陽離子的微擾作用。 1 2 3 激基締合物4 2 l ( e x c i m e r ) 當兩個相同的熒光團，如多環(huán)芳烴萘、蒽和芘等連接到一個受體分子的 合適位置時，其中一個被激發(fā)的熒光團( 單體) 會和另一個處于基態(tài)的熒光 團形成分子內(nèi)激基締臺物，它的發(fā)射光譜不同于單體，表現(xiàn)為一個新的、強 而寬、長波、無精細結(jié)構(gòu)的發(fā)射峰。由于形成這種激基締合物需要激發(fā)態(tài)分 洲杰y 八 大連理工大學博士學位論文 子與基態(tài)分子達到“碰撞”距離3 5 a 因此熒光團問的距離是激基締合物的 形成和被破壞的關鍵。所以可以利用各種分子闖作用力改變兩個熒光團之間 的距離，如用結(jié)合客體前后單體激基締合物的熒光光譜變化表達客體被識別 的信息。萘、蒽等熒光團由于具有較長的激發(fā)單線態(tài)壽命，易形成激基締合 物，常常被用于此類探針中。 1 31 4 式1 - 5 基于激基締合物原理的探針 sc h e me 1 5t h epr ob c sb a s e do nt r i o n o m er e x c i m e tm e c h a n is m 1 5 化合物1 3 43 1 具有雙芘熒光發(fā)色團氮雜冠醚絡合k + 或b a 2 + 后，熒光強 度增大，同時單體激基締合物的熒光強度比發(fā)生變化。化合物1 4 ”，通過酰 胺連接了四個蔡分子，在乙腈中以質(zhì)子化的形式存在_ 并表現(xiàn)出激基締合物熒 光光譜。絡臺c d 2 + 或p b 2 + 后熒光強度降低?；衔? 5 t 4 5 , 4 6 是識別，鏈 狀二銨離子的一個非常好的雙識別配體設計。當向1 5 的甲醇溶液中加入 h 3 n + ( c h 2 ) 7 n + h 3 2 c 1 后，單體熒光強度增強，激基締合物發(fā)射消失。 1 2 4 熒光共振能量轉(zhuǎn)移 4 2 , 4 7 , 4 8 ( f r e t ，f l u o r e s c e n c e r e s o n a n c e e n e r g y t r a n s f e r ) 二( 2 毗啶甲差) 胺為識別基團z n 2 + 熒光分予探針的研究 當能量給體熒光團d 與能量受體熒光團a 相隔的距離遠大于d a 的碰撞 直徑時，只要d 與a 的基態(tài)和第一激發(fā)態(tài)兩者的能級問能量差相當，或者說 d 的發(fā)射光譜與a 的吸收光譜能有效重疊，就可能發(fā)生從d 到a 的非輻射能 量轉(zhuǎn)移，又稱為長距離能量轉(zhuǎn)移( 甚至相距遠達7 0 i o o a ) 。實際上d a 發(fā)生 能量轉(zhuǎn)移時，兩者除了光譜重疊外，還必須以適當?shù)姆绞脚帕小 可以是熒 光團，也可以是熒光淬滅團。前一種情形，激發(fā)d 時，由于能量轉(zhuǎn)移，將觀 察到a 的熒光發(fā)射。而后一種情形，則只能觀察到d 的熒光變化，多用于核 酸的檢測。 脅。，、。，、，、n 1 6 0 式1 - 6 有兩種香豆素構(gòu)成的f r e t 熒光探針 s c h e m el 6af r e tf l u o r e s g e n tp r o b ew i t ht w ok i n d so fc ：o u m af i i l $ 化合物1 6 t 4 9 】由兩種香要素分子通過醚鏈連接。香豆素基團測距離較遠， 能量共振轉(zhuǎn)移效率低。當用短波激發(fā)時，只能觀察到d 香豆素的熒光，加入 p b 2 + 時，p b 2 + 與開鏈聚醚形成絡合物，拉近了d a 距離，f r e t 效率得以提高， 激發(fā)d 時，能夠觀察到較強的a 的熒光發(fā)射。 化合物1 7 5 0 】由萘酰亞胺與蒽通過烷基鏈相連，二者間距離較遠，f r e t 效率低，當用長波激發(fā)時，只能觀察到d 萘酰亞胺在5 5 0 r i m 發(fā)射的熒光。當 用短波激發(fā)時，可以同時觀察到葸在4 0 0 4 5 0n m 和萘酰亞胺在5 5 0 r i m 處兩個 熒光發(fā)射峰。隨著p h 的增加，葸的發(fā)射峰強度急劇降低，而萘酰亞胺的熒光 強度變化很小，可以用于氫質(zhì)子的識別。 舔 大連理工大學博士學位論文 1 7 n h 2 式1 7 由葸與蔡酰皿胺構(gòu)成的f r e t 熒光探針 s ch e i l le1 7af r e tf l u or e s c c n tp r o b ew i t ht w ok i r i d s0 ff l u o t c s c c r lc g r o uos f r e t 類型熒光分子探針還廣泛地應用于生物大分子的動態(tài)分析中。生 物大分子不僅結(jié)構(gòu)復雜，而且多變，用x 射線衍射法或- h n m r 法都不能滿 足生物大分子的多樣性和動態(tài)研究的要求。當生物功能大分子，比如酶，引 入d a 熒光團后，觀察二者的能量轉(zhuǎn)移可以間接檢測功能激活前后的結(jié)構(gòu)變 化f 5 ”。 1 2 5 基于其它原理的熒光分子探針 大多數(shù)金屬離子熒光分子探針是基于上述幾種原理設計合成，但有些分 子探針是按照其它原理設計，甚至是意外所得，但效果卻常常很好。 化合物1 8 的乙腈溶液中加入汞離子后熒光強度顯著增強( 3 4 倍) 并伴有光 譜紅移，用質(zhì)子檢測發(fā)現(xiàn)生成了脫硫產(chǎn)物1 9 。化合物1 8 是對汞離子有選擇性 的化學反應熒光分子探針，這類不可逆的化學計量型的識別分子也被稱為化 學計量計( c h c m d o s i m e t e r ) 1 5 2 l 。 毋。且辯弋警伊* 飛 1 8 式1 - 8 一種反應性熒光探針 1 9 二( 2 吡嚏甲基) 胺為識別基團z n 2 + 熒光分子探針的研究 化合物2 0 在乙腈溶液中對鉛離子具有選擇性熒光增強識別效果。識別過程 中熒光增強4 0 倍并伴有1 5 r i m 的熒光光譜紅移，這種識別現(xiàn)象是鉛離子配位時 影響了探針分子的光誘導分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移及分子的構(gòu)象剛性的結(jié)果1 5 3 1 。 2 0 式1 9 酮氪基香豆素熒光探針 有些熒光分子開關是通過結(jié)合某些過渡金屬離子的氧化或還原態(tài)( n i l | 1 n i “，c u “c u 。) 淬滅或恢復熒光分子的熒光。在配合物2 2 中，三價鎳離子通 過激發(fā)態(tài)丹磺酰胺熒光團向金屬離子的電子轉(zhuǎn)移將熒光淬滅；還原n i 3 + 后， 相應的二價配合物2 3 則不與熒光團間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，熒光處于“開”的狀態(tài)。 銅等金屬離子也廣泛存在這種現(xiàn)象1 5 4 1 。 4 0 0 n m ) ，以避免紫外光對生命有機體的傷害。在生物體外和生物體內(nèi) 有溶解性和細胞穿透性。另外，p h 不敏感性也是需要考慮的一個重要因素 6 1 。 z n 2 + 熒光分子探針的設計原理一般是基于光誘導電子轉(zhuǎn)移( p e t ) 或分子 內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移( i c t ) 。另外，能量共振轉(zhuǎn)移( f r e t ) 以及激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn) 移等也在近年來有所發(fā)展。本論文將按熒光團和配體分類，介紹基于不同設 計原理的z n ”熒光分子探針。 1 4 1 經(jīng)典的z n 2 + 熒光分子探針 6 甲氧基8 對甲苯磺酰胺喹啉( t s q ，2 4 ) 7 4 1 是第一例用于大腦、心 臟及其它組織切片中z n 2 + 濃度檢測的熒光分子探針。t s q 雖然可用于在生理條 件下較高濃度的c a 2 + 和m 9 2 + 存在時z n 2 + 的檢測，但t s q ，z n 2 + 絡合物的結(jié)構(gòu)和穩(wěn) 定常數(shù)尚不清楚，t s q z n 2 + 可能以1 ：1 或2 ：1 的形式絡合，并且熒光強度在不 同的介質(zhì)中變化較大，所以用t s q 進行定量分柝z n 2 還有待于迸一步研究。 z a l e w s k i d x 組在t s q 的6 位上引入酯基后生成z i n q u i n 酯( 2 5 ) 7 5 】。當2 5 滲入到 細胞膜內(nèi)后，在酶的作用下水解成羧酸根陰離子2 6 ，就可以長時間停留在細 胞內(nèi)，從而考察z n 2 + 在細胞生長規(guī)律中的作用。2 m z i n q u i n 自身的熒光非常 弱，當游離z n 2 + 的濃度達到納摩爾級后，熒光強度大大增強，當z n “達到飽和 濃度( 1 i x m ) 時，熒光強度增大2 0 倍，并且生物體中其它的重要金屬離子( 如 二( 2 一毗啶甲基) 胺為識別基團z n 2 + 熒光分子探針的研究 c a “、m g ”、c u 2 + 、f e 2 十、f e 3 + 、m n 2 + 、c 0 2 + 等) 都不會影響2 6 z n 2 + 絡合物的 熒光強度。2 6 能檢測的z n 2 + 濃度范圍在1 0 0 p m 1 0 n m 之間。但通過熒光計滴定 分析，2 6 與z n 2 + 形成1 ：l 或2 ：l 的混合絡含物，在p h7 4 時，鍵合常數(shù)分別是70 1 0 6m 。1 和1 1 7 1 0 6m 。 e t 0 2 c , , 、 i 。w “琴h n 審 s 0 2 m em e t s q 2 4 0 2 c o m e 1 ) m e m b r a n ep e r m e a b l e 2 ) h y d r o l y s i sb y i n t r a c e l l u l a re s t e r a s e s 翠? 鼴 中由 m e m ie z i n q u i n z i n q u i na c i d 2 5 2 6 式1 - 1 1 早期的z n 2 + 熒光探針 2 m e t s o 2 7 為了進一步了解t s q 類熒光探針的化學結(jié)構(gòu)，0 h a l l o r a n d 、組研究了2 甲 基一t s q ( 2 7 ) 7 6 1 ，結(jié)果表明，在中性d m $ o 水( 1 ：1 ) 的混合溶液中，2 7 z n 2 + 的2 ：1 四面體絡合物是主要存在形式。x 衍射晶體分析進一步確定了絡合物的 結(jié)構(gòu)，即脫質(zhì)子的酰亞胺n 及喹啉環(huán)上的n 原子與z n 2 + 配位。 1 4 2 由碳酸酐酶發(fā)展的z n 2 + 熒光探針 1 9 4 0 年，m a n n 和k e i l i n 報道了磺酰胺能夠抑制畬有鋅的碳酸酐酶( c a ) 的活性1 7 。1 9 6 7 年，c h e n 和k e r n o h a n 提出牛血紅細胞c a 和等摩爾的丹磺酰胺 2 8 能形成1 ：1 的絡合物，發(fā)出強烈的熒光【7 9 】。在水中，2 8 的發(fā)射波長為5 8 0n m ， 熒光量子產(chǎn)率僅為0 0 5 5 ，但結(jié)合了c a 后，2 9 的發(fā)射波長藍移到4 6 8r i m ，而量 子產(chǎn)率增大到0 8 4 。熒光光譜的大幅度藍移是由于丹磺酰胺的結(jié)合位點屏蔽性 好，疏水性強，并且磺酰胺在結(jié)合c a 時失去一個質(zhì)子( 成為s 0 2 n h 。) 。所以 丹磺酰胺被認為是一種很好的碳酸酐酶熒光探針或者c a 凋亡后游離z n ”熒光 大連理工丈學博士學位論文 探針?；酋０窡晒馑亟Y(jié)合物3 0 【7 9 1 和d a p o x y l f - 漠酰胺3 l 8 0 3 是這一類型熒光探針 的進步發(fā)展。3 0 和含有z n 2 + 的c a 絡合( 解離常數(shù)k d = 2 3 n m ) ，熒光各相異 性和絡合的z n 2 + 濃度在1 0 - 1 0 0 n m 范圍內(nèi)成比例。3 1 絡合c a 后熒光強度增大9 0 倍，光譜從6 0 5 n m 藍移到5 3 0 n m ( k a = 0 3 u m ) 。這樣就可以通過計算化合物3 1 在5 3 5 n m 年16 8 5 n m 處的熒光強度實現(xiàn)對z n 2 + 的定量檢測。 s 0 2 n h 2 d a n s y l a m i d e 2 8 h 2 n c a r b o n i ca n h y d r a s