氣道炎癥中p38MAPK及核因子B對(duì)一氧化氮合酶的調(diào)控田偉千，傅誠章，朱敏敏（南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，江蘇 南京 210029）摘 要 氣道炎癥性疾病是由多種細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)性疾病，一氧化氮（NO）作為生物體內(nèi)一個(gè)重要的信使分子和效應(yīng)分子,參與許多生理和病理過程，大量的NO可引起氣道炎癥和肺損傷等不良反應(yīng)。p38蛋白激酶(p38 MAPK)可能與氣道炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，且能調(diào)控誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA 的表達(dá)及NO 的產(chǎn)生。同時(shí)，p38MAPK 還是NF-B的重要上游調(diào)控因子。作為一種多極性基因調(diào)控蛋白, 核因子B(NF-B)能從基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控iNOS的合成,因而對(duì)NO具有重要的調(diào)節(jié)作用。NO對(duì)p38MAPK和NF-B也有一定的反饋調(diào)節(jié)作用。關(guān)鍵詞 氣道炎癥；p38MAPK；NF-B；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；一氧化氮P38 Mitogen activated Protein Kinase and Nuclear Factor-B Modulate the inducible Nitric oxide Synthase in airway inflammationTian Weiqian , Fu Chengzhang, Zhu Minmin . Department of Anesthesiology ,the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University , Nanjing 210029 CHINAAbstract Airway inflammatory disease is characterized by allergic airway inflammation,which is mediated by various cytokines and inflammatory mediators. As an important signaling and potent molecule, NO is involved in numerous pathophysiological processes in creature bodies. Excessive production of endogenous NO in airway inflammatory disease may contribute to many adverse responses ,such as airway inflammation and lung injury etc. P38 Mitogen activated Protein Kinase ,which is likely to correlate closely with the pathogenesis of airway inflammatory disease,could Modulate iNOS mRNA expression and NO production, and p38MAPK is also an important upstream regulating factor. As a multipolar gene modulin,NF-B can modulate the biosynthesis of inducible nitric oxide synthase at the level of nuclear transcription,thereby it is a critical factor in regulating NO production.However, No also shows a feedback regulation effect on p38MAPK and NF-B.Key words airway inflammation; P38 mitogen activated protein kinase; nuclear factor-B; inducible nitric oxide synthase; nitric oxide一氧化氮(NO) 是一種活躍的信號(hào)小分子,參與機(jī)體多種生理和病理過程。當(dāng)它作為一種炎性介質(zhì)時(shí),主要由誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS) 催化底物左旋精氨酸而生成。氣道炎癥中, NO 的大量生成與iNOS 的異常表達(dá)有關(guān)，目前已明確iNOS的調(diào)控主要取決于基因表達(dá)的調(diào)控。但iNOS 表達(dá)的具體調(diào)控機(jī)制尚未完全明確。近年來研究表明核因子B(NF-B) 是炎癥性疾病的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控著多種炎癥基因的表達(dá)。它在一系列由細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)及蛋白酶類參與的疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。作為MAPKs 家族成員之一, P38MAPK參與了炎癥、應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控密切相關(guān)，被認(rèn)為是細(xì)胞信息傳遞的交匯點(diǎn)，能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性及細(xì)胞因子的合成，對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控有著關(guān)鍵性的作用1。本文就氣道炎癥中p38MAPK及NFB對(duì)iNOS及NO的調(diào)控機(jī)制作一綜述。1 NO及其合酶的生物學(xué)特征NO 是一個(gè)具有自由基性質(zhì)的生物信息分子和效應(yīng)分子,它可參與體內(nèi)多種生理和病理反應(yīng)過程。NO是由NOS作用下合成的。根據(jù)功能的不同，一氧化氮合酶分為兩型，即原生型一氧化氮合酶（cNOS）和iNOS，其中cNOS 包括內(nèi)皮型NOS(eNOS) 和神經(jīng)元型NOS(nNOS) , cNOS主要調(diào)節(jié)生理功能，iNOS在病理狀態(tài)下產(chǎn)生，在疾病的發(fā)生和病理過程中起著重要而復(fù)雜的作用2。在正常生理狀態(tài)下，cNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生低濃度的NO對(duì)氣道平滑肌具有直接的舒張作用，氣道非腎上腺能、非膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)以NO為介質(zhì)亦可增強(qiáng)支氣管擴(kuò)張。作為血管舒張因子,NO參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),具有舒張動(dòng)脈、降低血小板黏滯性、減少血小板聚集、抑制粒細(xì)胞的移位和聚集,減少黏附分子的表達(dá)3，故適量的NO 對(duì)機(jī)體有保護(hù)作用。在哮喘狀態(tài)下，過敏原及IFN-、IL-1、TNF-等細(xì)胞因子誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞中iNOS 表達(dá)增加，由iNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的NO4。過量的NO不僅可直接造成細(xì)胞損傷，還可與同時(shí)產(chǎn)生的超氧陰離子生成許多衍生物。這些物質(zhì)多為氧自由基，能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，形成脂質(zhì)過氧化物，如醛基(MDA) 、酮基以及新的氧自由基，引起細(xì)胞損傷5。此外，NO 極易與氧自由基反應(yīng)產(chǎn)生過氧亞硝基陰離子，它具有比NO 和氧自由基更強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用。近年來的研究證實(shí)，NO 這一高效而多樣性的生物調(diào)節(jié)分子可直接參與細(xì)胞因子特別是與炎癥有關(guān)的細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。此外,還可能通過NO 的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)作用直接作用于核因子NF-B 等，影響不同細(xì)胞因子的合成6。Takano等7認(rèn)為，NO可能直接參與了哮喘炎癥過程的調(diào)控。2 NF-B的生物學(xué)特征2. 1 NF-B 的結(jié)構(gòu)與活性調(diào)節(jié)NF -B是一類能與多種基因啟動(dòng)子部位的B位點(diǎn)特異性結(jié)合并促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)的總稱。具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，參與多種與免疫和炎癥反應(yīng)有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在一系列由細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)及蛋白酶類等參與的疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。幾乎存在于所有的細(xì)胞中,對(duì)細(xì)胞的生長、分化、黏附、凋亡及炎癥反應(yīng)等具有重要的調(diào)節(jié)作用。典型的NF-B由兩個(gè)亞單位P50、P65/ c-Rel 組成。當(dāng)細(xì)胞未受到適當(dāng)刺激時(shí),細(xì)胞中的NF-B 處于未活化狀態(tài),不具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的能力,此時(shí)NF-B 與一類被稱作I-B 的抑制蛋白結(jié)合在一起,位于細(xì)胞質(zhì)中,并且其P65 被封閉,不能被抗P65 抗體識(shí)別。當(dāng)細(xì)胞受到LPS 等胞外信號(hào)刺激時(shí), I-B 發(fā)生磷酸化降解,NF-B與I-B 發(fā)生解離,NF-B 迅速從細(xì)胞質(zhì)移位到細(xì)胞核,在核內(nèi)與目的基因上的B 位點(diǎn)特異性結(jié)合,從而促進(jìn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,NF -B 可以調(diào)節(jié)多種炎癥基因如TNF-、IL- 6、IL- 8 和iNOS 的表達(dá), 而這些炎癥基因的活化可能參與了肺部炎癥。I-B 基因的啟動(dòng)子中含有3 個(gè)B 結(jié)合位點(diǎn),NF-B 活化后可上調(diào)I-B 的基因表達(dá),新合成的I-B 進(jìn)入細(xì)胞核與NF-B 結(jié)合,使NF-B 從其結(jié)合的DNAB 位點(diǎn)上脫離并重新轉(zhuǎn)位入細(xì)胞漿,NF-B 的激活被終止,此為負(fù)反饋調(diào)節(jié)形式。但NF-B 許多調(diào)控基因的表達(dá)產(chǎn)物(如TNF-、IL-1等) 同時(shí)又是NF-B 的激活物,參與了NF-B 的正反饋調(diào)節(jié)形式。2. 2 NF-B對(duì)iNOS的調(diào)控作用受NF-B 調(diào)控的基因表達(dá)產(chǎn)物囊括了大多數(shù)參與氣道炎癥形成的主要細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì),提示NF-B在氣道炎癥的發(fā)病中起重要作用。前炎癥細(xì)胞因子如TNF-,IL-1或氧化物均可明顯激活人外周血單核細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞及肺組織細(xì)胞內(nèi)NF-B。在氣道炎癥的形成過程中,NF-B 的激活起一定作用。NF-B 進(jìn)入核內(nèi)后,與其靶基因中啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的B 基序結(jié)合,從而誘導(dǎo)許多因子的轉(zhuǎn)錄。研究8顯示大鼠iNOS 基因啟動(dòng)子區(qū)域含有兩個(gè)B 調(diào)節(jié)區(qū), 分別位于-48bp-209bp 和-913bp-1029bp , 是NF-B 依賴性基因。Matsumura 等9亦證實(shí)iNOS 基因表達(dá)依賴于NF-B 的活化。有學(xué)者10在大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中證實(shí)了NF-B 可通過與編碼iNOS 基因上的B 位點(diǎn)結(jié)合,從而促進(jìn)iNOS 轉(zhuǎn)錄,iNOS 生成增加。核因子-B 活化后iNOS 表達(dá)增高,引起大量的NO 產(chǎn)生, iNOS 的表達(dá)受到NF-B 活化的調(diào)節(jié)，抑制NF -B 活化，則iNOS 的表達(dá)下降。NF -B 活化在氣道炎癥發(fā)生機(jī)制中起作用,并通過抑制iNOS 的表達(dá)來抑制NO 的過量產(chǎn)生。這樣, 從NF-B 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)水平進(jìn)行干預(yù), 可能為適度調(diào)節(jié)體內(nèi)NO 的誘生開辟新的途徑。由于iNOS、TNF-、IL-1、IL-6等細(xì)胞因子基因啟動(dòng)子上均存在NF-B 的結(jié)合位點(diǎn), 抑制NF-B 通路活化一方面阻止iNOS 轉(zhuǎn)錄及NO 的過度產(chǎn)生, 另一方面可減少TNF-、IL-1、IL-6 等炎性介質(zhì)的合成與釋放, 從而減輕肺組織炎癥反應(yīng), 對(duì)器官功能起到保護(hù)的作用。2.3 NO對(duì)NF-B的反饋調(diào)節(jié)作用通過外源性NO干預(yù)內(nèi)毒素(LPS)誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）,觀察到NF-B活性降低,說明NO 在炎癥因子產(chǎn)生中起負(fù)反饋?zhàn)饔? 而NO 在此過程中能降低前炎癥介質(zhì)TNF-的機(jī)制可能是通過抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)的NF-B活性, 從而減少TNF-的基因轉(zhuǎn)錄,精氨酸是內(nèi)源性NO 的前體,精氨酸缺乏將導(dǎo)致NO 不足, 引發(fā)炎癥失控11。有研究12認(rèn)為外源性NO 通過抑制內(nèi)源性NO釋放,不僅能從基因表達(dá)水平上抑制炎癥反應(yīng), 同時(shí)對(duì)炎癥反應(yīng)也有抑制作用。NO對(duì)NF -B的負(fù)反饋?zhàn)饔每赡苁荖O 對(duì)機(jī)體保護(hù)作用的主要機(jī)制。Connelly等13研究認(rèn)為NO對(duì)鼠巨噬細(xì)胞中NF-B活性具有雙向調(diào)節(jié)作用，并和NO的局部濃度密切相關(guān)。研究中發(fā)現(xiàn)30nM3mM的NO對(duì)NF-B的活性有促進(jìn)作用，30mM300mM的NO對(duì)NF-B有抑制作用。通過對(duì)NF-B的雙向調(diào)節(jié)作用，不同濃度的NO可以上調(diào)或下調(diào)iNOS、環(huán)氧化酶-2以及IL-6的基因表達(dá)。這一機(jī)制至少部分解釋了過去的報(bào)導(dǎo)中關(guān)于NO不僅具有促炎作用，還有抗炎作用的說法。研究14還發(fā)現(xiàn)，NO 對(duì)Th1 型細(xì)胞因子IFN-和Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5 的表達(dá)具有調(diào)控作用。該調(diào)控作用部分地依賴于NF-B , 即NO-NF-B 信號(hào)通路在Th細(xì)胞因子的表達(dá)中也具有一定的調(diào)控作用。3 p38MAPK的生物學(xué)特征3.1 p38MAPK的結(jié)構(gòu)與活性調(diào)節(jié)p38 MAPK是新近發(fā)現(xiàn)的與炎癥、應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)的蛋白激酶,參與了肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的定位遷移和淋巴細(xì)胞的發(fā)育、分化、成熟和活化的全過程,提示p38 MAPK可能與支氣管哮喘的氣道炎癥機(jī)制相關(guān)。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase , MAPK) 是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白激酶。由于其性質(zhì)的保守性和分布的廣泛性, MAPKs 信號(hào)途徑在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有重要作用, 是真核細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞外刺激到細(xì)胞內(nèi)引起細(xì)胞反應(yīng)的四大信號(hào)系統(tǒng)之一15。作為MAPKs 家族成員之一, p38MAPK是1993 年發(fā)現(xiàn)的一類新的MAPK 通路。p38MAPK能促進(jìn)白細(xì)胞的聚集和活化16，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性及細(xì)胞因子的合成17，對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控有著關(guān)鍵性的作用。p38MAPK是由360 個(gè)氨基酸組成、分子量為38 000B酪氨酸磷酸化蛋白激酶, 屬應(yīng)激激活的蛋白激酶, 能被促炎因子、應(yīng)激刺激、L PS和G+ 細(xì)菌胞壁成分所激活。研究18證實(shí)該激酶在LPS 誘導(dǎo)細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中有重要作用，當(dāng)細(xì)胞外刺激作用于細(xì)胞, 即可引起胞質(zhì)p38MAPK磷酸化, 磷酸化的p38MAPK隨即轉(zhuǎn)位到胞核, 激活轉(zhuǎn)錄因子Elk-1 、ATF2 和AP-1 等, 啟動(dòng)相關(guān)細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的基因表達(dá)。炎癥刺激，如LPS、TNF、IL-1等，均可介導(dǎo)單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等先天性免疫細(xì)胞中p38MAPK的激活3.2 P38MAPK對(duì)iNOS的調(diào)控作用 p38 蛋白激酶(p38 MAPK)可能與氣道炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，且能調(diào)控誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA 的表達(dá)及NO 的產(chǎn)生19。Lu 等20在肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)中證明了p38MAPK對(duì)PAM分泌NO的作用。LPS 刺激PAM 引起胞核提取物p38MAPK表達(dá)增強(qiáng), iNOS mRNA 表達(dá)以及細(xì)胞培養(yǎng)上清NO 代謝產(chǎn)物均顯著增加; 應(yīng)用特異性p38MAPK抑制劑SB203580 發(fā)現(xiàn), 抑制p38MAPK的活性能顯著降低iNOS mRNA 的表達(dá)及NO 的產(chǎn)生, 提示LPS刺激p38MAPK活化參與了PAM 的激活以及炎性介質(zhì)釋放的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。Kan 等21報(bào)道在LPS 刺激后,ECV304 細(xì)胞株中iNOS的mRNA 和蛋白水平比基礎(chǔ)量均有顯著提高,p38MAPK的活性也明顯增加,在15min 時(shí)到達(dá)峰值并維持了約45 min 的平臺(tái)期,利用SB203580 可顯著抑制iNOS 的mRNA 和蛋白水平的表達(dá)。3.3 NO對(duì)p38MAPK的反饋調(diào)節(jié)作用p38MAPK是絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白激酶,依賴于酪氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化而激活, NO可引起蛋白酪氨酸殘基的磷酸化而激活p38MAPK激酶,活化的p38MAPK又可激活下游的激酶、酶或蛋白,產(chǎn)生生物學(xué)作用,因此NO可以通過相繼激活p38MAPK、caspase - 3 蛋白酶這個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡22。Browning等23研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激中性粒細(xì)胞中p38MAPK的活化，主要通過NO-cGMP途徑實(shí)現(xiàn)的，LPS刺激引起的NO的大量合成導(dǎo)致了cGMP的積聚，進(jìn)而引起了蛋白酪氨酸殘基的磷酸化而激活了p38MAPK。研究24還證實(shí)p38MAPK的抑制劑SB203580可以阻斷bax從胞質(zhì)向線粒體的轉(zhuǎn)移，而NO的供體SNP處理后，激活p38MAPK信號(hào)通路的上游激活物MKK3，進(jìn)而活化了p38MAPK，導(dǎo)致bax轉(zhuǎn)位和細(xì)胞死亡。這些說明，在NO通過刺激bax流入線粒體而導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡的過程中，p38MAPK的活化起了關(guān)鍵作用。然而，也有學(xué)者25報(bào)導(dǎo)，在支氣管哮喘患者中，內(nèi)源性NO過度增多，p38MAPK活性反而下降，從而使嗜酸粒細(xì)胞的bcl-2表達(dá)減少，細(xì)胞凋亡增多。4 p38MAPK和NF-B 之間的調(diào)控關(guān)系NF-B 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié),同時(shí)也是體內(nèi)多條信號(hào)途徑的共同交匯點(diǎn)。p38MAPK 是NF-B的重要上游激酶,可通過直接激活p38MAPK后繼而進(jìn)一步誘導(dǎo)NF-B 活化, 促進(jìn)NO的合成與釋放。Bhat等26在探討p38MAPK激活轉(zhuǎn)錄iNOS 基因的作用過程中,在證明這種激活轉(zhuǎn)錄作用的同時(shí),還發(fā)現(xiàn)這種作用中包含了轉(zhuǎn)錄因子NF-B的參與。LPS 能使PAM胞核NF-B 染色陽性細(xì)胞百分比增加, 并且與NO代謝產(chǎn)物、iNOS mRNA 及胞核p38MAPK表達(dá)均呈顯著正相關(guān)。Nick等27證實(shí)LPS刺激中性粒細(xì)胞能引起p38MAPK上游激酶MKK3的活化，從而使，p38MAPK磷酸化，最終調(diào)節(jié)細(xì)胞間粘附和NF-B的活化，并增強(qiáng)，TNF-mRNA的蛋白質(zhì)表達(dá)。同時(shí)，應(yīng)用特異性p38MAPK抑制劑SB203580 能顯著降低NF-B 的活化及iNOS mRNA、NO 的表達(dá), 提示p38MAPK可能對(duì)NF-B 具有正相調(diào)控作用。Alpert等28也發(fā)現(xiàn)p38MAPK可以抑制TNF-誘導(dǎo)的NF-B的活化，由于過去的研究29認(rèn)為p38MAPK能夠增強(qiáng)TNF-的表達(dá)，所以有理由認(rèn)為，p38MAPK可能通過抑制NF-B的活化，進(jìn)而抑制了iNOS的誘導(dǎo)。Guan及其同事30證實(shí)了p38MAPK可以抑制IL-1介導(dǎo)的iNOS誘導(dǎo)。p38MAPK對(duì)NF-B的這一雙向調(diào)控作用仍需做進(jìn)一步研究。5 結(jié)語p38MAPK通路作為將細(xì)胞外刺激信號(hào)傳遞到細(xì)胞核的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中的一條重要途徑，是參與炎癥反應(yīng)調(diào)控的重要信號(hào)系統(tǒng)。P38MAPK在炎癥因子刺激肺泡上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表達(dá)iNOS、產(chǎn)生NO 的過程中起重要作用,這一作用可能與p38MAPK調(diào)控NF-B 的活化有關(guān)。給予特異性的阻斷劑, 在信號(hào)通路水平阻斷和調(diào)控p38MAPK的表達(dá)和活性, 將可能成為氣道炎癥性疾病一條新的治療途徑。參考文獻(xiàn)1 Haddad EB,Birrell M,Cluskie KM,et al. 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