聚L-精氨酸修飾CNTs-殼聚糖電極的制備及對(duì)尿酸的檢測(cè)武懷娣摘要 用循環(huán)伏安法制備了聚L-精氨酸修飾CNTs-殼聚糖玻碳電極，研究了尿酸在修飾電極上電化學(xué)行為。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在=4mm的玻碳電極表面滴CNTs濃度為1mg/mL的殼聚糖溶液5L形成的膜最好，且電流響應(yīng)最靈敏。聚合L-精氨酸時(shí)選pH=6.0的磷酸鹽緩沖溶液，濃度為2.510-3mol/L，掃描范圍-0.72.5V，聚合時(shí)間為5周時(shí)聚合效果最優(yōu)。研究了尿酸在該修飾電極上的電化學(xué)行為，結(jié)果顯示，在pH=6.5的BR緩沖溶液中，掃描速率為200mV/s，電位范圍在-0.1V1.0V時(shí)，尿酸在修飾電極上于0.395V處產(chǎn)生一個(gè)靈敏的氧化峰。 關(guān)鍵詞 L-精氨酸；尿酸；碳納米管；玻碳電極中圖分類號(hào)：O657.1Prepare poly(L-argenine)-modified CNTs-chitosan membrane glassy carbon electrode and detect the uric acidWu huaidiAbstract：Poly(L-argenine)-modified CNTs-chitosan membrane glassy carbon electrode (ACCGCE) was prepared by cyclic voltammetry. In a phosphate buffer solution of pH=7.0 and 2.510-3mol/L of L-argenine with a scan range of -0.7V2.5V. The electrochemical behavior of uric acid at this electrode was studied. A novel method was proposed for the determination of uric acid. In a BR buffer solution of pH=6.5, at a scan rate of 200mV/s, a sensitive oxidation peak was observed at Epa=0.395V.Keywords： L-argenine，uric acid, Carbon nanotubes, glassy carbon electrode1引言尿酸(UA)是人體內(nèi)嘌呤核苷酸分解代謝過(guò)程的產(chǎn)物。過(guò)量的尿酸是許多疾病的征兆,如痛風(fēng)、腎功能衰竭及先天性高尿酸血癥等,血液中尿酸濃度過(guò)高還會(huì)導(dǎo)致腎臟受損及心血管疾病 1, 2 。因此,研究尿酸的測(cè)定方法在藥物控制、臨床醫(yī)學(xué)診斷及實(shí)現(xiàn)對(duì)生物分子的在體測(cè)定具有重大意義。檢測(cè)尿酸的方法有光譜法 3 、液相色譜法 4 、酶分析法 5 和電化學(xué)法 6 等。由于光譜法易受樣品中存在的其它發(fā)色基團(tuán)的干擾,高效液相色譜法需要多步的樣品預(yù)處理過(guò)程,且儀器昂貴,操作麻煩,并且常使用有毒試劑等,限制了方法的實(shí)用性。由于聚合物修飾電極的特殊三維空間結(jié)構(gòu)及聚合膜對(duì)化學(xué)功能團(tuán)的選擇性響應(yīng),使測(cè)定的靈敏度和選擇性大大提高,且操作簡(jiǎn)單 7, 8 。目前用聚合物修飾電極測(cè)定UA的研究已有報(bào)道 9, 10 ,研制了用聚L -精氨酸修飾鉑碳電極并用于尿酸的測(cè)定11。本文研究了聚L -精氨酸修飾CNTs-殼聚糖電極的制備及UA在修飾電極上的電化學(xué)行為，與聚L -精氨酸修飾玻碳電極相比，聚L -精氨酸修飾CNTs-殼聚糖玻碳電極的膜的牢固性大大提高，從而提高了電極的使用壽命。2 實(shí)驗(yàn)部分2.1 儀器微機(jī)電化學(xué)分析系統(tǒng)（LK2005型電化學(xué)工作站；天津市蘭力克化學(xué)電子高技術(shù)有限公司），CLJ2000磁力攪拌器（天津市蘭力克化學(xué)電子高技術(shù)有限公司）；0.5-10L微量加液器（Brand, Gevmany）;20-100L微量加液器(Gilson, France)；100-1000L微量加液器(Gilson, France)；石英亞沸高純水蒸餾器（江蘇丹陽(yáng)門石英玻璃廠），pHS-3B精密pH計(jì)，三電極系統(tǒng)：碳納米管及聚L-精氨酸修飾的電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為對(duì)電極，測(cè)量均在室溫下進(jìn)行。2.2試劑尿酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），聚L-精氨酸（分析純。Sigma），磷酸二氫鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），磷酸氫二鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），碳酸鈉（分析純，天津市科盟化工工貿(mào)有限公司），冰醋酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），磷酸分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），硼酸（分析純，佳木斯化學(xué)試劑廠），氫氧化鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）多壁碳納米管（LMWNT-10，主要直徑范圍10nm, CNTs純度95%,長(zhǎng)度為515m，灰分0.2wt%,比表面積：40300m2/g.深圳納米港有限公司，用前濃HNO3加熱回流6h，并洗至中性，80干燥）；殼聚糖,L-精氨酸2.3實(shí)驗(yàn)所用溶液及其配制方法1）不同濃度的CNTs-殼聚糖聚合溶液的配制：稱取10mg酸處理的CNTs與研缽中磨碎成粉末，在1.5mL的離心管中用二次水配成10mg/mL的溶液，在超聲儀中超聲兩小時(shí)。在0.5mL的離心管中配制100L的不同濃度的溶液。表1 不同濃度的CNTs-殼聚糖聚合溶液的配制CNTS（mg/mL）0.00.20.51.03.05.07.0CNTS（L）0.02.05.010.030.050.070.0殼聚糖（L）1009895907050302） 50mL8mg/mL的殼聚糖溶液的配制：用40mL0.05mol/L的HCl溶解400mg殼聚糖，因粘度很高，要不停的快速攪拌。用1.0mol/L的NaOH在精密pH計(jì)上調(diào)其pH穩(wěn)定。調(diào)節(jié)過(guò)程中會(huì)有白色絮狀物質(zhì)生成，pH變化緩慢。約兩小時(shí)后達(dá)到穩(wěn)定，實(shí)際NaOH用量約10L。3） 不同PH的PBS緩沖液的配制：先配置500mLpH=7的0.2mol/L的PBS緩沖液，準(zhǔn)確稱取NaH2PO46.08g，Na2HPO421.84g?；旌虾笥枚嗡芙?。在500mL容量瓶中定容。用0.1mol/LNaOH在精密pH計(jì)上調(diào)節(jié)不同的pH值。4） 不同pH的BR緩沖溶液的配制：A液，3.92g H3PO4(2.71mL85%正磷酸)，2.47g H3BO4, 2.40g乙酸（2.36mL冰醋酸）用二次水配成1000mL的溶液。B液，8.0g/L的NaOH溶液1000 mL。按表2配制。表2 配制不同pH的BR緩沖溶液的方法A液 25mLB液(mL)1.53.54.55.256.07.258.759.510.511.513.15pH值2.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.0A液 25mLB液(mL)15.2516.017.018.519.520.2521.022.2525.0pH值8.08.59.09.510.010.511.011.512.05)100mL2.510-3mol/L L-精氨酸溶液的配制方法：準(zhǔn)確稱取7.16g Na2HPO4于潔凈干燥的燒杯中，加入80mL水溶解，用濃NaOH調(diào)pH=10.5，將其定容于100mL的容量瓶搖勻后，準(zhǔn)確稱取0.0435g L-精氨酸，溶于上述PBS緩沖溶液中，并用其定容于100mL容量瓶中，搖勻備用。6) 不同濃度的50mLpH=6.0（PBS緩沖液）的L-精氨酸溶液的配制（見表3）。表3不同濃度的50mLpH=6.0（PBS緩沖液）的L-精氨酸溶液的配制方法L-精氨酸溶液(mol/L)1.010-32.510-33.010-35.010-3L-精氨酸質(zhì)量（g）0.00870.02170.02610.04357)100mL1.010-3mol/L尿酸溶液的配制方法：準(zhǔn)確稱取1.32gNa2CO3于潔凈干燥的少杯中，加入二次水溶解，將其定容于200mL的容量瓶搖勻制得0.01mol/L的Na2CO3。準(zhǔn)確稱取0.0168g尿酸，用0.01mol溶液溶解，將其定容于100mL的容量瓶中，搖勻備用。8）不同pH的2.510-4mol/L的尿酸溶液的配置：取上述1.010-3mol/L尿酸溶液12.5 mL于50 mL容量瓶中，用不同pH的BR緩沖液定容。2.4 CNTs-殼聚糖電極的制備及聚L-精氨酸修飾CNTs -殼聚糖電極的制備 2.4.1 CNTs-殼聚糖電極的制備將玻碳電極在濕潤(rùn)的金相砂紙上磨光，然后用Al2O3（0.05m）懸乳液拋光成鏡面，依次用VHNO3：VH2O=1：1混合液，無(wú)水乙醇和二次水超聲清洗5min。再用二次水沖洗晾干后，以CNTs濃度為1mg/mL的殼聚糖混合液5L滴至電極表面，放陰涼處陰干。2.4.2 聚L-精氨酸修飾CNTs-殼聚糖電極(ACCGCE)的制備 以CNTs-殼聚糖電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，在濃度為2.510-3mol/LL-精氨酸的pH=6.0的PBS緩沖液中，電位范圍為-0.72.5V，以60mV/s的掃描速率循環(huán)掃描五周。取出用二次水淋洗電極表面，晾干。即制得聚L-精氨酸修飾CNTs-殼聚糖電極。2.5實(shí)驗(yàn)方法 在10ml 的電解池中，倒入2.510-4mol/L 的由BR緩沖液配制的不同PH的UA溶液。采用三電極體系，以聚L-精氨酸修飾CNTs-殼聚糖電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，靜置時(shí)間為1s，以200mV/s的掃描速率向正電位方向掃描。記錄-0.1V1.0V的線性掃描伏安圖上的峰電流和峰電位。每次掃描結(jié)束后，用二次水沖洗，濾紙吸干后，即可進(jìn)行下一次測(cè)定。3 結(jié)果與討論3.1電極表面CNTs-殼聚糖聚合條件殼聚糖與CNTs溶液以不同比例混合后，滴在電極表面成膜后，再制成L-精氨酸修飾電極，研究了該電極對(duì)UA的響應(yīng)，結(jié)果見圖1。由圖1可知，當(dāng)CNTs濃度為1mg/mL，對(duì)尿酸測(cè)定最靈敏。制得的修飾電極對(duì)UA的電化學(xué)響應(yīng)在0.368V處產(chǎn)生一個(gè)靈敏的氧化峰。（見圖2）ip/A圖1 不同濃度CNTs修飾的ACCGCE對(duì)尿酸的響應(yīng)電聚合條件：2.510-3mol/L L-精氨酸；pH=6.0 PBS溶液；掃描范圍：-0.72.5V；掃速：60mV/s。測(cè)定條件：2.510-4mol/L UA ；pH=6.5 BR溶液；掃速：200mV/s。ip/A圖2 2.510-4mol/L UA在ACCGCE上的循環(huán)伏安曲線條件如圖13.2電化學(xué)聚合條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著L-精氨酸溶液pH值的升高,制得的修飾電極對(duì)UA的響應(yīng)電流先增大后減小再增大,在pH= 6.0，pH=10.5時(shí),響應(yīng)電流出現(xiàn)兩個(gè)頂峰。但pH= 6.0處，峰電流高且峰形好（如圖3）。固定負(fù)電位為- 0.7V,正電位在1.02.5V范圍內(nèi),峰電流隨電位增加而增加,大于2.5V時(shí),峰電流開始減小。固定正電位為2.5V,負(fù)電位在- 0.7 V時(shí),制得的修飾電極對(duì)UA的響應(yīng)電流最大,且峰形最好。在- 0.72.5 V聚合電位下,循環(huán)掃描速率小,形成的膜致密,但耗費(fèi)時(shí)間多,且隨著時(shí)間的增長(zhǎng),一些干擾因素也難控制;掃描速率大,能夠節(jié)省時(shí)間,但形成的膜的表面形態(tài)不規(guī)整,影響測(cè)定的精密度。在掃速為60 mV / s時(shí),峰電流達(dá)到最大,且電極穩(wěn)定性較好。修飾電極對(duì)UA的響應(yīng)電位不隨聚合掃描次數(shù)的變化而改變,但響應(yīng)電流受掃描次數(shù)的影響較大,掃描次數(shù)較少時(shí),對(duì)UA的響應(yīng)電流小,聚合掃描5周,修飾電極對(duì)UA的響應(yīng)電流達(dá)到最大值。（如圖4）這是由于隨著掃描次數(shù)的增加,在電極表面聚合的氨基酸越多,相應(yīng)的活性中心增加,使其對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的響應(yīng)電流增大。聚合5周后,由于聚合時(shí)間長(zhǎng),膜厚增加,電子在膜中阻力變大,導(dǎo)致響應(yīng)電流略有降低。故本文選擇在pH = 6.0的PBS介質(zhì)中, - 0.72.5V電位范圍內(nèi),以掃描速率為60 mV / s聚合5周制備聚L -精氨酸修飾電極。ip/A圖3 不同pH值L-精氨酸聚合溶液制成ACCGCE對(duì)2.510-4mol/L UA的響應(yīng)。條件如圖1Ip/A掃描次數(shù)/圈圖4聚合L-精氨酸掃描次數(shù)對(duì)UA的響應(yīng)電流的影響曲線條件如圖13.3 L-精氨酸濃度的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)取L-精氨酸濃度為2.510-3mol/L時(shí)。聚合形成的膜最好(如圖5）且在對(duì)尿酸進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，制得的修飾電極對(duì)UA的電化學(xué)響應(yīng)在0.368V處產(chǎn)生一個(gè)靈敏的氧化峰(如圖2)。Ip/mA 圖5 L -精氨酸聚合過(guò)程的循環(huán)伏安曲線電聚合條件：2.510-3mol/L L-精氨酸；pH=6.0 PBS溶液；掃描范圍：-0.72.5V。3.4 尿酸檢測(cè)的最佳環(huán)境3.4.1 PH的影響測(cè)定尿酸時(shí)，底液的pH對(duì)UA的峰電位和峰電流均有影響。隨著底液的PH值的升高，氧化峰電位負(fù)移 (見表3 )。在pH=3.0時(shí)，峰電流較大，靈敏度較高。但在pH=2.02.5范圍內(nèi)。峰形較寬且電位太正（如圖6）。在pH=9.012.0之間，峰電流較?。ㄈ鐖D7）。為了檢測(cè)一些干擾因素，我們選擇接近人體的pH=6.5的弱酸環(huán)境。表4 不同pH的底液對(duì)UA檢測(cè)的氧化峰電位pH2.02.53.04.04.55.05.56.0E/V0.75910.61050.59930.55200.50470.45290.44160.4191pH6.57.07.58.08.5E/V0.39430.34030.32910.23680.2188 Ip/A圖6 在pH=2.0的BR緩沖液中ACCGCE對(duì)尿酸的循環(huán)伏安曲線條件如圖1i/A 圖7 在pH=12.0的BR緩沖液中ACCGCE對(duì)尿酸的循環(huán)伏安曲線條件如圖13.4.2掃描速率對(duì)尿酸檢測(cè)的影響隨著掃描速率的增加。尿酸的峰電流不斷增加。氧化峰電位不斷正移（如表5）。在低掃速下，響應(yīng)電流較?。ㄈ鐖D8a），在高掃速下，峰電流較大（如圖8c），但峰形變差。所以本實(shí)驗(yàn)選擇200mV/s的掃速（如圖8b）。表5 不同掃描速率下檢測(cè)尿酸的氧化峰電位和電流掃速（mV/s）0.010.020.050.10.20.250.30.35E/V0.29310.30210.31000.32230.34260.34710.35610.3628ip/A8.324410.160915