密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文 利 用酵母雙雜交 系統(tǒng) 研究感病番茄品種中與 作 的 基因 to to 要 番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病是一種嚴(yán)重影響番茄質(zhì)量和產(chǎn)量的世界性細(xì)菌病害，是由丁香假單胞桿菌番茄致病變種 起的。番茄中的 抗病基因 病原菌的無毒基因 作是研究植物與病原物互作的典型模式系統(tǒng)。本文利用酵母雙雜交系統(tǒng) ，從 感病番茄品種“中蔬四號(hào)”中 篩選 與 作的基因。 我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn) ， 感番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病的番茄 品種 “中蔬四號(hào)”中存在與 探討感病品種有抗病基因而不抗病的原因進(jìn)行了本試驗(yàn)。一方面能初步了解感病信號(hào)傳導(dǎo)途徑，另一方面也能 了解植物 病原物互作的機(jī)理 ， 進(jìn)一步 闡明抗感病機(jī)制。 本文（ 1）根據(jù)已知的蕃茄細(xì)菌性抗病基因 因序列，合成了上下游引物，通過 ， 將 獲得 的 目的片 段構(gòu)建酵母誘餌表達(dá)載體 從而 在酵母雙雜交 系統(tǒng) 中表達(dá)誘餌融合蛋白。 （ 2）合成了感細(xì)菌性斑點(diǎn)病番茄 品種 “中蔬四號(hào)”誘導(dǎo)表達(dá)的 ds 以 表達(dá)獵物文庫的融合蛋白。（ 3）將誘餌載體、 ds 獵物載體 轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的酵母細(xì)胞中， 進(jìn)行酵母雙雜交篩選， 初步篩選到與 作的陽性克隆 36 個(gè)，根據(jù)測序結(jié)果將其 分為 16 類，有 8 類與植物中的相應(yīng)基因序列同源性較高，另外 8 類在沒有找到與其同源的序列，為未知功能基因。 對所測序列的結(jié)構(gòu)域及 行 析， 發(fā)現(xiàn) 在這 些克隆中有 含有 類結(jié)構(gòu)域 ；所測序列中 5 類含有 （ 4）通過分析，沒有發(fā)現(xiàn)在抗病品種中與 接互作的 蛋白，另 外有一 陽性 克隆 45C， 與 其同源 性較高的 蛋白對 導(dǎo)的抗病 信號(hào)傳導(dǎo)途徑 起抑制作用 。 推測這可能是感病品種中存在抗病基因而不起作用的原因。（ 5） 建 立 了 號(hào)傳導(dǎo)途徑模型假說 。 關(guān)鍵詞 蕃茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病， 中蔬四號(hào) ，酵母雙雜交 933, 978) is a of to 993 is a . to is a of to on on to by we to in in By to in a we in to CR CR a NA to A S4 we We 6 we 6 of in of to a . 錄 第一章 引言 . 5 . 5 . 1 . 1 . 1 . 2 . 3 . 4 . 4 . 5 . 6 . 6 . 7 第二章 誘餌載體 . 8 . 8 菌株和質(zhì)粒 . 8 . 8 . 8 . 8 . 9 . 9 . 11 . 13 果與分析 . 14 . 14 體酶切 . 14 建誘餌載體酶切 . 15 . 15 . 16 第三章 制備感病番茄品種中蔬四號(hào)的 ds . 17 . 17 . 17 . 17 茄 ds 成 . 18 . 18 . 18 . 20 . 22 第四章 酵母雙雜交篩選與 . 23 . 23 . 23 法及技術(shù)路線 . 28 . 29 . 32 . 33 . 33 . 34 . 35 . 37 . 37 . 37 . 37 . 38 V . 38 . 39 . 43 第五章 結(jié)論與討論 . 44 參考文獻(xiàn) . 46 致謝 . 52 作者簡介 . 53 第一章 引言 茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病概述 番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病 ， 亦稱番茄細(xì)菌性葉斑病或斑疹病，是由丁香假單胞桿菌番茄致病變種 簡稱 起的 (趙廷昌等， 2001)，能夠危害番茄的葉、莖、花、葉柄和果實(shí)（ 趙廷昌等， 2001；時(shí)濤等， 2003）。在番茄的苗期至收獲期的整個(gè)生長季節(jié)造成危害，使番茄 產(chǎn)量受到損失 ， 在果實(shí)上的病斑還嚴(yán)重降低了番茄的商品價(jià)值。 自 1933 年報(bào)道已來，已在美國、意大利、南非、澳大利亞等二十多個(gè)國 家和地區(qū)發(fā)生，該病 在 15 80%以上的相對濕度下發(fā)病， 可造成 5 的產(chǎn)量損失（ et 1980）。在我國 1998 1999 年吉林 省 長春市番茄大棚內(nèi)發(fā)現(xiàn)該病，現(xiàn)已漫延到黑龍江和遼寧省以及甘肅、山西、天津等地 的番茄產(chǎn)區(qū) （劉秋等 ， 2002； 時(shí)濤等 ，2003），危害日益嚴(yán)重，因此如何經(jīng)濟(jì)有效的防治這種病害的問題 有 待解決。目前 選育與推廣 抗病品種是防治此病害最經(jīng)濟(jì)有效的措施。 體短桿狀，直或稍彎，單細(xì)胞，大小為 4 1 微米， 革蘭氏陰性，在含有蔗糖的培養(yǎng)基上能產(chǎn)生 綠色熒光，菌株超過 41則不能生長（趙廷昌， 2001）。 在著生理小種的分化，現(xiàn)已鑒定出 兩個(gè)生理小種，即生理小種 0 號(hào)和生理小種 1 號(hào)。 術(shù)不能區(qū)分 兩個(gè)生理小種。病菌分血清學(xué)和血清學(xué)菌系。菌株的致病性、碳水化合物的利用、噬菌體敏感性和質(zhì)粒情況具有多樣性。菌株的總可溶性蛋中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 引言 1 白電泳圖譜也存在很大差異（ et 1996)。 關(guān)于該病抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研究，目前主要是針對克隆的抗病基因及其下游的信號(hào)傳導(dǎo)途徑展開的（ B, et 1999） ?？共』?別 病原菌的無毒基因后，在其下游一系列的信號(hào)傳導(dǎo)元件的參與下產(chǎn)生抗病性反應(yīng)。因此 ,對抗病基因的研究將會(huì)進(jìn)一步明確抗病反應(yīng)如何發(fā)生，進(jìn)而能充分利用抗性資源，有效的防治該病。 茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研究進(jìn)展 茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗病基因 茄抗細(xì)菌斑點(diǎn)病基因 從野生的番茄品種 引進(jìn)到栽培品種中的，為單基因半顯性遺傳，位于第五條染色體上的 間（ et 1984）。 番茄中的抗病基因 病原菌的無毒基因 作是研究植物與病原物互作的典型模式系統(tǒng)。 1993 年 ， 圖位克隆的方法克隆了番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病的抗性基因 因 是符合基因?qū)驅(qū)W說而克隆的第一個(gè)植物抗病基因（ et 1993） 。該基因的克隆使得寄主與病原物互作的分子機(jī)理研究得到迅速的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)該基因編碼一個(gè) 具有 321 個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，主要能形成帶有絲氨酸 蘇氨酸激酶催化域，并且位于細(xì)胞質(zhì)中（ et 1999； et 1989；張祥喜等， 2003）。 在細(xì)胞質(zhì)中， 夠識(shí)別通過型分泌系統(tǒng)分泌到細(xì)胞質(zhì)中的無毒蛋白 激活了對侵入的不同病原物的不同防御反應(yīng)。也就是說 ， 即使在對沒有 且增加 言之 ， 增加 而增加了植物細(xì)胞中受到帶有無毒基因 量（ et 1999)。 研究發(fā)現(xiàn) ， 因?qū)儆诔纱氐幕蚣易逯械囊粋€(gè)成員 （ 董繼新等 2001； et 1997） 。在 6R 品種中 因位點(diǎn)由 因和六個(gè) 的 括 因 （ et 1994） 。研究表明 因位點(diǎn)是組成型的，在抗病品種和感病品種中都存在 （ et 1993） ，并且都能發(fā)生轉(zhuǎn)錄，到目前為止 ， 還沒有實(shí)驗(yàn)證明它是由病原物的侵入誘導(dǎo)而產(chǎn)生的 （ et 1997； et 2001； et 2002； et 2003） 。 因是 因介導(dǎo)的產(chǎn)生對細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性和對倍硫磷敏感性所必需的 (et 1994,1996)。該基因位于 因簇內(nèi)，具有保守性。主要在 徑的早期起作用（ et 2003）。 因是對倍硫磷敏感的基因，緊挨著位于第五條染色體上的 因 ，并與之發(fā)生共分離。它編碼的蛋白質(zhì)有 80%與 因編碼的蛋白質(zhì)相同（ et 1999）。 原物的無毒基因 般來說 ， 植物的抗性蛋白與病原物的無毒蛋白發(fā)生特異性互作是產(chǎn)生抗病性所必 需的，并且這種抗病反應(yīng)大多與過敏性壞死反應(yīng)（ 聯(lián)系 （ et 1996）?？辜?xì)菌性斑點(diǎn)病的番茄中，抗性蛋白 過識(shí)別病原菌的無毒蛋白 產(chǎn)生對細(xì)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 引言 2 菌性斑點(diǎn)病的抗性。在酵母雙雜交 實(shí)驗(yàn) 中，番茄的 抗性蛋白 毒蛋白 中 在與 作過程中 ， 酶的第 204 位點(diǎn)上的蘇氨酸起了一個(gè)關(guān)鍵性的作用 (et 1998)，而第 129et 1996)。另外 ， 還發(fā)現(xiàn) 由無毒的 0 號(hào)小種的菌株產(chǎn)生的 （ et 1992） ，因此表達(dá) 因的番茄對 0 號(hào)小種的病原菌產(chǎn)生抗性。而有毒的 1 號(hào)小種的菌株不能夠產(chǎn)生被 因識(shí)別的無毒基因而發(fā)病。 實(shí)驗(yàn)表明 ， 因編碼一個(gè)小的親水蛋白質(zhì)（ 這個(gè)蛋白對沒有 抗病基因植物具有毒性。當(dāng)帶有 菌株侵染一個(gè)不具有 植物時(shí)，細(xì)菌的生長加快（ et 2000； et 2000） ?？寺?因，并對 端的氨基酸殘基進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn) 能攻擊植物的細(xì)胞膜 （ et 1999） 。 另外 ， 通過酵母雙雜交系統(tǒng)，從 株中篩選出與 作的另一個(gè)蛋白質(zhì)et 2002） 。它通過 產(chǎn)生 細(xì)胞程序性壞死的抑制子，來提高細(xì)菌毒性，增加植物感病性 (et 2003 )。在番茄中 能激起 導(dǎo)的防御反應(yīng)僅有的無毒基因。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)還表明， 表達(dá) 番茄中表現(xiàn)出過多的無毒活性，而在感病品種中具有累加 的毒力活性 (et 2005)。 茄中與 作蛋白的研究 植物的抗病反應(yīng)是在許多其它元件共同參與下完成的，因此 ， 在對番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病的抗性反應(yīng)的研究中，與 作的蛋白質(zhì)的研究也成為必不可少的一部分。用酵母雙雜交的方法，以 為誘餌蛋白，以番茄的 庫作為獵物，篩選在番茄中參與 導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白 ， 結(jié)果有 149 個(gè)克隆 能 與 生 互作。 根據(jù)它們的核苷酸序列將其分為 10類 （ et 1998） ，其中有四類研究得比較深入，一類是蛋白質(zhì)磷酸化激酶 外三 類 是與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的因子 ） 。 因 編碼一個(gè)胞質(zhì)的蛋白質(zhì)激酶，在體外通過分子內(nèi)機(jī)制在絲氨酸 /蘇氨酸殘基上發(fā)生自動(dòng)磷酸化 （ et 1995） 。 為 一個(gè)特殊的底物，是 導(dǎo)的級(jí)聯(lián)磷酸化的一個(gè)下游元件，直接被 酸化，并且能加強(qiáng)對表達(dá) 原細(xì)菌的識(shí)別，最終產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)和誘導(dǎo)防御基因的表達(dá) （ et 1998） 。當(dāng)轉(zhuǎn) 因的煙草受到表達(dá) 侵染 時(shí)，過敏性壞死反應(yīng)加強(qiáng)，這能有利地說明 病害反應(yīng)所起的作用 (et 1997； et 1995） 。 類 蛋白質(zhì)分別含有 234， 168， 248 個(gè)氨基酸殘基 ， 編碼它們的基因本身具有轉(zhuǎn)錄活性的結(jié)構(gòu)域。通過序列分析，發(fā)現(xiàn) （ 合蛋白的序列具有同源性，位于細(xì)胞核內(nèi) （ et 1997； et 2000） ，并且含有一個(gè)與 作的高度保守的 合域 (et 1997） 。實(shí)驗(yàn)表明 別， 與其互作的 （ et 1997） ，在植物與病原物不親和互作的過程中調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)， 使植物 獲得系統(tǒng)抗性 （ et 1991） 。另外 （ et 1997）。當(dāng)番茄受到 染和用不同的信號(hào)分子處理后 ，在不同的番茄組織中 因的表達(dá)不同，說明它們 在植物中所起的作用不同（ et 2000）。這些試驗(yàn) ， 在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 引言 3 抗病基因和特異的激活植物防御反應(yīng)基因間建立了直接的聯(lián)系。 導(dǎo)的番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑 植物 抗性基因的產(chǎn)物 識(shí)別 病原物 無毒基因產(chǎn)物后 ，進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)可能產(chǎn)生 防御基因的表達(dá)，有時(shí)這兩種途徑可以交叉進(jìn)行 （ et 1997） 。 在 因介導(dǎo)的抗性反應(yīng)過程中，也存在 防御基因表達(dá)這兩種途徑。首先 ， 丁香假單胞菌通過型分泌系統(tǒng)將 入到植物細(xì)胞中 （ et 1996； et 1996） , 互作使帶有 因的植物對帶有 因的假單胞菌產(chǎn)生識(shí)別。這種識(shí)別可能有 參與，使 酶磷酸化，激活在抗病性反應(yīng)中起作用的下游靶蛋白。然后可能發(fā)生抗性反應(yīng)的兩種途徑，一種是下游的 酸化產(chǎn)生 一種是 ，誘導(dǎo)防御基因的表達(dá) （ et 1998） 。 導(dǎo)的抗性反應(yīng)中心內(nèi)容為 力攻擊的目標(biāo)， 有識(shí)別 ，才能互 相結(jié)合，激活下游的一系列信號(hào)傳導(dǎo)元件，產(chǎn)生相應(yīng)的抗病性反應(yīng) （ et 2004； 韓俊德等 ， 2005） 。 關(guān)于 導(dǎo)的抗病反應(yīng)的模型目前主要有兩種假說（見圖 1一種是親和力加強(qiáng)模型。提出植物的細(xì)胞中存在一定比例的 基本防衛(wèi)反應(yīng)中發(fā)揮 作用 。這個(gè)復(fù)合物與 結(jié)合 ， 激活了 酶的活性 ， 或是增強(qiáng)了這個(gè)復(fù)合物的穩(wěn)定性，從而使其在細(xì)胞中的含量增加，進(jìn)而加強(qiáng)了基本的防御反應(yīng)。所以 ， 提出 增強(qiáng)并穩(wěn)定已存在的 合物，最終激起 抗病性反應(yīng) (et 1998)。其中 ， 有試驗(yàn)闡明了激酶的活性是產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)所必須的 （ et 1999； et 2000） 。 含 病原物產(chǎn)生抗性 ， 需要 有 與其互作的蛋白質(zhì) 與 ，但它們不是產(chǎn)生基因?qū)驅(qū)W說抗性所必 需 的。 第二個(gè)模型是防衛(wèi)反應(yīng)模型，即 基本的防衛(wèi)反應(yīng)發(fā)揮作用（ et 1998； et 2001） 。 結(jié)合干擾了 活性，破壞了它的功能，使得病原菌無致病性。這個(gè)模型的中心內(nèi)容 為 力的攻擊目標(biāo) ， 為檢測病原菌入侵的一個(gè)信號(hào)，監(jiān)測 互作 （ et 1996； et 1998； et 2000） 。這種防衛(wèi)反應(yīng)在寄主中都存在，但是 個(gè)現(xiàn)象也是這個(gè)模型無法解釋的。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 引言 4 圖 1 導(dǎo)的抗病性反應(yīng)模型 綠色的箭頭表示與誘導(dǎo)過程相關(guān)的基因，紅色的箭頭表示受 到抑制的基因，黑色的箭頭表示信號(hào)傳導(dǎo)過程中可能的途徑。 in of a ,K ),or 母雙雜交系統(tǒng) 母雙雜交系統(tǒng)簡介 酵母雙雜交系統(tǒng)（ (et 2004； et 2001；et 2000； et 2000） 是 1989 年 立的，用來研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的簡便而有效的方法 (et 1989)。近幾年發(fā)展的 新系統(tǒng)主要對報(bào)告基因、 誘餌 表達(dá)載體以及 獵物 表達(dá)載體等做了一些改進(jìn) 而 得到了廣泛運(yùn)用 (敖光明等，2001)。酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母中進(jìn)行的，研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，對蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能夠通過報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物敏感地檢測得到，它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)。大量的研究表明，酵母雙雜交技術(shù)既可以用來研究哺乳動(dòng)物基因組 編碼的蛋白質(zhì)之間的互作，也可以用來研究高等植物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的互作 (朱金鑫等 2004；王關(guān)林等， 2002）。 酵母雙雜交系統(tǒng) 用來研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的互作 。 目前 ， 主要應(yīng)用于以下四個(gè)方面：發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能；在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用；篩選藥物的作用位點(diǎn)以及藥物對蛋白質(zhì)之間相互作用的影響；建立基因組蛋白連鎖圖（ 吳乃虎 ,1998)。其中 ， 最主要的應(yīng)用是快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用及分離新的與已知蛋白作用的配體及其編碼基 因。 酵母雙雜交系統(tǒng)檢測蛋白之間的相互作用 ， 具有以下優(yōu)點(diǎn) (et 1995)： (1)作用信中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 引言 5 號(hào)是在融合基因表達(dá)后，在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用，省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。 (2)檢測在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，可以在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況 。（ 3） 檢測的結(jié)果可以是基因表達(dá)產(chǎn)物的積累效應(yīng)，因而可檢測存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時(shí)的相互作用。 （ 4） 酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細(xì)胞類型和分化時(shí)期材料構(gòu)建 庫，能分析細(xì)胞漿、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細(xì)胞部位及功能的蛋白 。 母 雙雜交系統(tǒng)原理 酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是以真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)構(gòu)和活性為基礎(chǔ)的（楊齊衡，1999）。細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與，真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)構(gòu)基本相似，往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上結(jié)構(gòu)上可以分開、功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中有合功能域 (轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（ 這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在它們分開時(shí)仍分別具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)被分開的兩者通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時(shí)，才能重新呈 現(xiàn)完整的 錄因子活性，并可激活上游激活序列（ 的下游啟動(dòng)子，使啟動(dòng)子下游基因得到轉(zhuǎn)錄 （ 吳乃虎等， 1998；宮明等 2000） 。根據(jù)這個(gè)特性，分別構(gòu)建含 將 融合，構(gòu)建出 庫，基因片段或基因突變體（以 Y 表示）融合，構(gòu)建出 粒載體。兩個(gè)穿梭質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)化至酵母體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。該酵母菌株含有特定報(bào)告基因（如 ） ，并且本身無報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性。 因此，酵母在缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基上無法正常生長。 蛋白質(zhì) X 和 Y 的相互作用導(dǎo)致了 空間上的接近，從而激活 游啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的報(bào)告基因的表達(dá)，使轉(zhuǎn)化體由于 達(dá)而 能夠 在特定的 營養(yǎng) 缺陷培養(yǎng)基上生長。 從而通過功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到菌落。將陽性反應(yīng)的酵母菌落 中的 體提取分離出來，從而對載體中插入的文庫基因進(jìn)行測序和分析工作 (et 原理如圖 1 動(dòng) 子 告基因 Y 動(dòng) 子 告基因 D 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 引言 6 圖 1母雙雜交原理圖 of 本實(shí)驗(yàn)所用的酵母雙雜交系統(tǒng)特點(diǎn) 本試驗(yàn)所用的試劑盒 成技術(shù)統(tǒng)一起來，使得用來構(gòu)建酵母雙雜交的 庫大大簡化。在這個(gè) 試劑盒中，誘餌基因與 體 合表達(dá)，而另一個(gè)基因或 庫與 體 行融合表達(dá)。當(dāng)誘餌和文庫的融合蛋白在酵母的報(bào)告菌株 發(fā)生互作時(shí)能夠激活報(bào)告基因 轉(zhuǎn)錄。原理如圖 1 圖 1D 理 D 用這個(gè)試劑盒進(jìn)行雙雜交篩選時(shí)，把 合成的 ds 隆到 體 將該克隆在體外共轉(zhuǎn)化。這個(gè)過程在酵母中利用高效的重組系統(tǒng)， ds 適當(dāng)?shù)腄 質(zhì)粒相融合。使文庫的構(gòu)建和篩選能夠很快的完成，而不用經(jīng)過細(xì)菌的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增步驟。 試驗(yàn)的前期基礎(chǔ) 1998 ， 在我國的吉林省、遼寧省、黑龍江省等地的大棚番茄上發(fā)現(xiàn)了番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病，并從病斑上分離了病原菌，對病原菌進(jìn)行了鑒定，確認(rèn)該病原菌為丁香假單胞桿菌番茄致病變種（趙廷昌， 2001）。 1997)報(bào)道 ， 在感 細(xì)菌性 斑點(diǎn)病和 對 倍硫磷不敏感的番茄品種（ 存在 位基因得到分離和特性測定，發(fā)現(xiàn)其編碼活性蛋白激酶，和 基酸序列同源性為 87 (et 我們實(shí)驗(yàn)室從感病番茄品種“中蔬四號(hào)”和 “ 中分離到和抗病基因序列完全一致的克隆，表明在我國的感病番茄品種中也存在抗病基因的同源序列 (趙廷昌等， 2004） ，這一點(diǎn)也和 et 1996） 。 研究結(jié)果推測 ， 單獨(dú)的抗病基因序列是不能夠?qū)е驴共》磻?yīng) 的， 動(dòng) 子 告基因 轉(zhuǎn)錄 Y D 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 引言 7 必須和相關(guān)的一系列基因共同作用才能產(chǎn)生抗病反應(yīng)。也就是說 ， 通常所說的植物的抗病基因與病原物的無毒基因互作產(chǎn)生的，更準(zhǔn)確的說 ， 應(yīng)該是許多病原物與植物蛋白質(zhì)其同參與的 ， 基因組對基因組的互作 （ et 這 為 我們進(jìn)行抗病性的研究提供更廣闊的思路。 研究的目的與意義 番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病 （ ，是一種嚴(yán)重影響番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的世界性重要病害，并且 番茄相互作用是研究病原 物 與寄主互作的 典型 模 式 系統(tǒng)。因此對該病的研究十分關(guān)注， 尤其是 在 病原菌 與 寄主互作和抗病信號(hào)傳導(dǎo)方面的研究取得很大的進(jìn)展 。 2002 年，我們實(shí)驗(yàn)室根據(jù) 因的序列，設(shè)計(jì)引物，用 法從我國的番茄品種中分離 因的類似序列 。 結(jié)果表明有兩個(gè)抗病番茄品種帶有 因， 8個(gè)抗病品種帶有同源性最低為 91%的同源序列，有兩個(gè)感病品種也帶有與 因序列完全 一致的序列。用同樣的方法也獲得了 因的同源序列，與 源性達(dá) 98 99 ，帶有 列 (一致 )的 4個(gè)品種的 列與已經(jīng)報(bào)道的 列同源性為 98 (時(shí)濤等 ,2002）。 番茄互作的研究已經(jīng)有很多報(bào)道，抗病基因在信號(hào)傳導(dǎo)方面的研究如上所述也 取得 很多進(jìn)展，而在感病番茄品種存在的抗病基因序列為何沒有抗病作用？在感病品種中與抗病基因直接互作的基因是否與抗病品種中的相同？至今還沒有這方面的研究報(bào)道。我們擬開展感病番茄品種中與 作基因的研究，即利用酵母雙雜交技術(shù)，從感病番茄品種中篩選出與抗病基因 作的 因，然 后和在抗病品種中與 作的基因比較，以研究 因在感病番茄品種中的最初受體，從信號(hào)傳導(dǎo)方面一步一步探索尋找感病品種中有抗病 列而不起抗病作用的原因。研究結(jié)果對豐富植物的抗感病機(jī)理、抗感病信號(hào)傳導(dǎo)、指導(dǎo)抗病基因的利用具有重要的科學(xué)意義。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 院碩士學(xué)位論文 誘餌載體 構(gòu)建及驗(yàn)證 8 第二章 誘餌載體 構(gòu)建及驗(yàn)證 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)的一個(gè)關(guān)鍵步驟是構(gòu)建誘餌載體，即將已知的外源基因構(gòu)建到 結(jié)合域上，并產(chǎn)生有活力而沒有毒力的融合蛋白。本章主要是將 成誘餌載體構(gòu)建。 料 株和質(zhì)粒 實(shí)驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒如表 2 表 2菌菌株和質(zhì)粒 菌株 /質(zhì)粒 相關(guān)特征 本研究用途 來源 80 粒轉(zhuǎn)化宿主菌 中國農(nóng)大王俊果博士提供 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌 本實(shí)驗(yàn)室提供 性標(biāo)記， 養(yǎng)標(biāo)記，表達(dá) 合蛋白 構(gòu)建誘餌載體 購自 司見圖 2 培養(yǎng)基 養(yǎng)基：蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g， 0g， 10 M 餾水 1000 到 固體培養(yǎng)基中應(yīng)加入 15 g 瓊脂。 養(yǎng)液： 2 胰蛋白胨， 酵母 粉 ， 10 2.5 20 液 （ 1 M 1 M 20 萄糖（ 液和葡 萄糖要過濾 除 菌