密級(jí) 論文編號(hào)： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士研究生學(xué)位論文 番茄抗灰霉病和晚疫病基因的分子遺傳分析與多基因輔助選育技術(shù) o.: I 中 文 摘 要 番茄晚疫病和灰霉病是世界性周年頻發(fā)的重要病害，特別是在設(shè)施栽培條件下，嚴(yán)重影響番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前我國還未有抗病品種選育成功的報(bào)道，而且相關(guān)研究工作始終處于相對(duì)滯后的地位。就普通栽培種番茄而言，對(duì)晚疫病和灰霉病通常表現(xiàn)感病，雖然野生資源是番茄抗病育種的寶貴材料庫 ，但對(duì)灰霉病還尚未有較好的抗源材料。因此，篩選抗晚疫病和灰霉病的抗病新材料，并應(yīng)用常規(guī)育種與分子生物學(xué)相結(jié)合的手段，深入挖掘抗病資源材料，是解決目前生產(chǎn)中亟待解決問題的有效途徑。本研究針對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐需要，結(jié)合番茄已有研究結(jié)果，對(duì)抗晚疫病和灰霉病的材料進(jìn)行了鑒定篩選，并利用現(xiàn)代生物學(xué)的技術(shù)對(duì)抗病基因進(jìn)行了研究，旨在為抗病育種奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下： 1對(duì)來自番茄 8 個(gè)種的 22 份野生資源材料進(jìn)行了苗期人工接種抗病性鑒定，篩選出 多毛番茄番茄茄 7 份抗灰霉病資源材料。上述材料人工接種 7 天后，病斑占葉面積的比例少于 5%。綜合國內(nèi)外研究結(jié)果初步認(rèn)為，野生資源材料中的部分多毛番茄和類番茄茄可作為番茄抗灰霉病的資源材料。 2篩選出一些高抗我國番茄晚疫病的資源材料，包括兼抗目前我國 8 個(gè)不同生理小種的多毛番茄 合胚培養(yǎng)對(duì)上述材料進(jìn)行了初步轉(zhuǎn)育。利用近等基因系，明確了含抗晚疫病基因 番茄材料，苗期呈現(xiàn)明顯的株齡抗性，即幼苗期隨株齡的增加，對(duì)晚疫病的抗性呈現(xiàn)明顯的 增強(qiáng)趨勢(shì)。 3利用抗灰霉病的多毛番茄 優(yōu)良品系 99165建的 200 個(gè) 離群體，結(jié)合記，構(gòu)建了長度為 801含 13 個(gè)連鎖群的番茄分子遺傳連鎖圖譜，并對(duì)控制番茄灰霉病的基因進(jìn)行了定位。鑒定出影響 番茄葉部對(duì)灰霉病抗性的 2 個(gè) 中一個(gè)位于番茄第 2 條染色體上，為抗病 59記連鎖， 為 獻(xiàn)率為 效應(yīng)值為 翼標(biāo)記為 61 間為 一個(gè)位于番茄第 3 條染色體的末 端，為感病 鎖， 為 獻(xiàn)率為 效應(yīng)值為 定出番茄果實(shí)抗灰霉病的 1 個(gè) 為 獻(xiàn)率為 效應(yīng)值為 翼標(biāo)記為 59 間為 于番茄第 2 條染色體上。 4利用以栽培種為遺傳背景，來自抗灰霉病的多毛番茄 93 個(gè)和類番茄茄 8 個(gè)漸滲系群體，對(duì)抗灰霉病的 行了定位。發(fā)現(xiàn)來自多毛番茄 灰霉病的位點(diǎn)分布在第 1、 2、 3、 4、 6、 7、 8、 10、 12 等 9 條染色體上，其中來自 4 條染色體末端，介于 記間的位點(diǎn)，命名為 番茄抗灰霉病貢獻(xiàn)率較大，葉片病斑面積較普通栽培種 少了 而來自類番茄茄 抗病 、 2、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 11、 12 等 10 條染色體上，其中來自 7 條染色體，介于 記的位點(diǎn)，命名為 病效應(yīng)最好，病斑面積較少了 通過對(duì)上述不同群體抗灰霉病位點(diǎn)比較分析發(fā)現(xiàn)，來自 來自 別位于染色體 1、 2、 4、 8 的 5 個(gè)抗病 位。來自 條染色體上， 記附近的 位。上述定位的抗灰霉病 番茄抗灰霉病育種奠定了扎實(shí)的基礎(chǔ)，尤其是來自多毛番茄 于染色體 2 和來自類番茄茄 的抗病 應(yīng)較大，可直接應(yīng)用于轉(zhuǎn)育。 5對(duì)多毛番茄 93 個(gè)漸滲系，分別接種我國晚疫病 、 ,4 等生理小種，鑒定出位于番茄染色體 1，與 鎖，抗 小種 的 點(diǎn)；位于染色體 9，介于小種 的位點(diǎn) 于染色體 11，均介于 小種 1,2 的位點(diǎn) 時(shí)還鑒定出，分別位于染色體 2、 3、 4、 5、 8 上，對(duì) 個(gè)位點(diǎn)；分別位于染色體 4、 8 上，對(duì) 小種感病的 3 個(gè)位點(diǎn)；分別位于 12 條染色體上對(duì) ,4 感病的 22 個(gè)感病位點(diǎn)。 6鑒定出 3 個(gè)品系，不僅對(duì)晚疫病而且對(duì)灰霉病均表現(xiàn)一定程度的抗性，其中 系與栽培種 二者的抗性差異均達(dá)到了顯著差異，即抗晚疫病的 抗灰霉病的 位，位于染色體 1，這些品系可以作為兼抗兩種病害的抗源材料。 7針對(duì)目前番茄生產(chǎn)中的一些主要病害，包括番茄灰霉病、番茄根結(jié)線蟲、番茄花葉病毒病、番茄斑點(diǎn)萎凋病毒病，首先利用近等基因系獲得了與來自 病 密連鎖的 記，結(jié)合國內(nèi)外研究結(jié)果還開發(fā)了可以對(duì)抗根結(jié)線蟲的 番茄花葉病毒的 番茄斑點(diǎn)萎凋病毒的 2 個(gè)抗病基因同時(shí)鑒定篩選的多重 系。該體系的建立，為苗期早期快速輔助選育提供了可能。 關(guān)鍵詞： 番茄；灰霉病；晚疫??； L. be a to no to to of to of at to of of of as a of to is of of of to or or In in to to of on so to in in as 1. 22 of by . L. of % of to we . . to 2. . of as a . as a of a of of 3. A 3 SR 00 C1 9165. of 01to in TL to in on 40/of 4.3 cM 40/TL on of of in of OD TL on of .0 cM 32/ . In to in to on 38 3 . . . 6203 on , 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 12. on of a of 6203. on 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12. TL on of of on ,4,8. in a to 5. 93 6203 to to 1, 1,2,4 of on to 1,2. on to 1,2. on 1 to of 1 1,2. 6 on 3, 4, 5, 8, 3 on , 8 2 2 to or 1, 1,2,4 of 6. 3 to to . 6203. to to on be a to of in 7. on , a in a CR be to of to Mi to be as an by at V 目 錄 第一章 緒論 . 1 1 番茄灰霉病及其抗病育種 . 2 茄灰霉病的危害及小種分化 . 2 霉病病菌與寄主的互作機(jī)制 . 4 茄抗灰霉病育種 . 6 2 番茄晚疫病及其抗病育種 . 7 茄晚疫病的危害及其小種分化 . 7 疫病病菌與寄主互作機(jī)制 . 8 茄抗晚疫病 育種 . 9 3 番茄分子連鎖圖譜及抗病基因的定位與克隆 . 9 茄遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建 . 9 科比較圖譜 . 11 茄漸滲系群體的建立及應(yīng)用 . 11 茄抗病蟲基因定位 . 12 茄抗病基因的克隆 . 14 物抗病 深入開發(fā) . 14 4 植物株齡相關(guān)的抗性及機(jī)理 . 15 物株齡相關(guān)的抗性 . 15 物株齡相關(guān)抗性機(jī)理 . 16 5 復(fù)合 系及其應(yīng)用 . 16 6 論文研究的目的和主要技術(shù)路線 . 16 究目的和意義 . 16 術(shù)路線 . 17 第二章 番茄抗灰霉病基因的遺傳分析與 位 . 19 1 材料與方法 . 20 料 . 20 法 . 22 2 結(jié)果與分析 . 25 茄抗灰霉病資源材料的篩選鑒定 . 25 茄 譜的構(gòu)建 . 29 茄抗灰霉病 定 位與分析 . 33 番茄不同部位抗病相關(guān)性分析 . 41 茄抗灰霉病 種間比較分析 . 41 3 討論 . 41 茄抗灰霉病資源材料 . 41 工接種抗灰霉病方法 . 42 茄 傳連鎖圖譜 . 42 茄抗灰霉病 位 . 43 第三章 番茄抗晚疫病材料的鑒定、轉(zhuǎn)育及 位 . 46 1 材料與方法 . 47 料 . 47 法 . 47 2 結(jié)果與分析 . 48 生資源材料抗晚疫病的鑒定及轉(zhuǎn)育 . 48 茄抗晚疫病 位 . 51 制番茄抗晚疫病位點(diǎn)的比較 . 56 茄不同株齡幼苗的抗性 . 56 3 討論 . 58 茄抗晚疫病資源材料及 位 . 58 茄對(duì)晚疫病的株齡抗性分析 . 60 第四章 多基因 記輔助選育番茄多抗育種 . 61 1 材料與方法 . 61 茄材料 . 61 法 . 62 2 結(jié)果與分析 . 64 抗灰霉病 密連瑣 記的獲 得 . 64 因緊密連瑣特異標(biāo)記的獲得 . 65 基因體系的建立 . 68 3 討論 . 70 第五章 結(jié)論 . 72 參考文獻(xiàn) . 74 致 謝 . 88 作者簡歷 . 89 附 錄 . 90 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒論 番茄（ L. 泛栽培于世界各地，是人類日常生活中不可缺少的主要蔬菜之一，不僅可用于鮮食，而且可加工成不同類型的罐裝食品，包括番茄醬、番茄沙司、番茄丁、番茄汁等，已成為重要的功能食品 （ ， 2002； ， 2003； 005） 。我國目前的番茄栽培面積已達(dá) 100 多萬公頃，保護(hù)地約 30 多萬公頃（范小建等， 2000），其中用于加工的番茄約 15 萬公頃，已成為世界重要的鮮食和加工番茄生產(chǎn)基地。然而，隨著栽培歷史的延伸，番茄的病害也越來越嚴(yán)重。番茄抗病育種一直是國內(nèi)外研究的重點(diǎn)，我國雖然 一直 將 抗番茄花葉病毒病 (根結(jié)線蟲（ 枯萎病（ f. 、葉霉?。?、黃瓜花葉病毒病 (抗病育種列為“六五”到“十五”國家重點(diǎn)科技攻關(guān)（李樹德， 1995）或國家高新技術(shù)“ 863”項(xiàng)目的重要內(nèi)容，取得了不少結(jié)果，但是對(duì)于近年來發(fā)生猖獗的番茄晚疫病 （ 和灰霉病 (病育種，卻始終處于相對(duì)滯后或空白的局面。 在人類栽培番茄的歷史過程中發(fā)現(xiàn)， 使用常規(guī)育種的方法對(duì)于再利用表型可判斷的有用性狀已很有限，這是因?yàn)槌Ｒ?guī)育種 群體對(duì)于番茄生產(chǎn)而言，產(chǎn)量和主要質(zhì)量性狀的提高已達(dá)到一個(gè)生理平臺(tái)水平（ ， 1999）。 （ 1999）通過在美國及以色列兩個(gè)不同地區(qū)的 20 年重復(fù)田間試驗(yàn)指出，過去美國番茄的品質(zhì)改良，主要是由于從 80 年代起雜種一代的使用及栽培條件的改善包括施肥、灌溉和病蟲防治，導(dǎo)致產(chǎn)量的增加，而可溶性固形物等沒有較大變化。番茄屬包括 6 個(gè)種，這些野生 資源材料不僅含有可用于提高品質(zhì)的寶貴基因（ 1990； ， 1995； ， 1998； 1999；余誕年等， 1999），而且在與病原菌互作過程中，進(jìn)化演生出系列栽培種所不具有的特異抗病蟲基因（ ， 2002， 2004, ， 2005；鄭光華等， 1988），如醋栗番茄（ L. 番茄萎凋病（ 葉霉?。?斑枯?。?細(xì)菌性莖腐?。?番 茄花葉病毒病（ 斑萎?。?多毛番茄（ L. 早疫病（ 斑枯病、葉霉病、番茄花葉病毒病、卷頂病毒病（ 晚疫?。?根瘤線蟲（ 多種殺蟲作用，秘魯番茄（ L. 卷頂病毒病、斑枯病、枯萎病、葉霉病、晚疫病、番茄花葉病毒病、根瘤線蟲及馬鈴薯蚜蟲，多腺番茄（ L. 葉霉病、根瘤線蟲、黃萎病，智利番茄（ L. 萎病，潘那利番茄（ L. 頂卷病毒病，類番茄茄（ S. 早疫病、枯萎病、 誕年等， 1999）。眾所周知，現(xiàn)有栽培種番茄中，相當(dāng)一部分抗病基因來源于野生資源。就晚疫病和灰霉病而言，多毛番茄、醋栗番茄等是抗晚疫病的寶貴資源材料（ ， 2004； ， 2002； ，1999），而多毛番茄、醋栗番茄及類番 茄茄還對(duì)灰霉病表現(xiàn)一定的抗性（ ， 2002； 999）。雖然野生資源囊括極具價(jià)值的基因，但野生資源的轉(zhuǎn)育利用存在一定的困難，首先野生資源材料和栽培種番茄雜交存在雜種不孕性，其次野生材料攜帶許多不良園藝性狀，如果實(shí)較小等（ ， 1999），另外通過 雜交、回交將有益基因轉(zhuǎn)入栽培種通常需要較長的時(shí)間等等。上述問題的存在，嚴(yán)重障礙了野生資源材料有用基因的有效開發(fā)與利用。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒論 2 基于 平的分子生物技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于作物遺傳改良（ ， 1988； 1991； ， 1993； ， 2004）。利用與控制不同性狀基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，早期鑒定篩選，極大地加速了作物育種進(jìn)程（ ， 1992）。番茄作為模式植物，相關(guān)研究較為深入，目前已獲得了與抗葉霉病、白粉病、番茄花葉病毒病、枯萎病、根結(jié)線蟲等多個(gè)基因緊密連鎖的不同類型的分子標(biāo)記（ ， 1994； 1994； ， 1996； 997； ， 1997； ， 1998； ， 1994）。 作物抗病通常受單基因或 于質(zhì)量抗病基因而言，開發(fā)一般較為容易，如利用建立的群體或近等基因系獲得相關(guān)標(biāo)記，直接用于后代選育；而對(duì)于受多個(gè)位點(diǎn)控制的抗病 說，通過常規(guī)轉(zhuǎn)育較為困難，基于分子標(biāo)記的 分子圖譜技術(shù)不僅可鑒定基因的主效和微效效應(yīng)，并且可揭示雜種優(yōu)勢(shì)、超親分離、基因型和環(huán)境互作等重要遺傳現(xiàn)象，從而使數(shù)量變異效應(yīng)轉(zhuǎn)化為不同染色體上的單個(gè)基因座的作用。另外，利用 圖對(duì)復(fù)雜性狀的遺傳也增加了新的認(rèn)識(shí)，從而為育種者和遺傳學(xué)家進(jìn)行品質(zhì)、抗病等性狀的遺傳育種研究提供了新方法。然而， 在實(shí)際應(yīng)用中 ， 由于 析常常受制于目的基因和兩側(cè)標(biāo)記之間發(fā)生重組 的影響， 開發(fā)也存在一定問題 。 針對(duì)受多個(gè)基因影響的性狀， 996)提出了 術(shù)，該技術(shù)能使數(shù)量性狀位點(diǎn)（ 析和育種相結(jié)合，有望將有用的 育到栽培種，從而促進(jìn)深入開發(fā)利用近緣野生種中潛在優(yōu)良性狀的可能 。就番茄而言，針對(duì)野生資源 開發(fā)， 目前已以番茄屬的 8 個(gè)種 0 個(gè)不同結(jié)構(gòu)的群體 建了較為詳細(xì)的園藝性狀的 譜，這些工作為番茄遺傳改良奠定了良好基礎(chǔ)。但是，上述圖譜的構(gòu)建均是基于 記，由于 記操作的復(fù)雜性，最近幾年，相關(guān)研究人員開發(fā)了大量的快速簡便、易于操作的 特異 記（ ， 2005； ， 2005），這些標(biāo)記圖譜的獲得將會(huì)為番茄遺傳改良 提供更為方便的技術(shù)手段。另外， 隨著擬南芥、水稻基因組測(cè)序的陸續(xù)完成，根據(jù)植物進(jìn)化理論和番茄大量的表達(dá)序列標(biāo)簽（ 至 2005 年 11 月公布 164691 個(gè) 部分基因組序列（ 6 個(gè) ， (2002)推測(cè)番茄基因組編碼大約 35000 個(gè)基因（ 2002）。人們還發(fā)現(xiàn) 不同抗病基因都具有共同的保守序列，這些抗病基因類似物 (鑒定、分離和克隆抗病基因提供了一種有效手段（ 2002）?？的藸柎髮W(xué)發(fā)起了番茄基因組測(cè)序工作現(xiàn)，由中國、美國、荷蘭、 意大利等 10 多個(gè)國家共同參與，我國承擔(dān)了第 3 條染色體的測(cè)序工作（ ， 2005）。隨著番茄測(cè)序的完成，相關(guān)功能基因的鑒定，將為番茄抗病育種提供更為方便的平臺(tái)，也會(huì)使番茄遺傳改良發(fā)生深入的變化。 1 番茄灰霉病及其抗病育種 茄灰霉病的危害及小種分化 灰霉病病菌寄主十分廣泛，約有 235 種，嚴(yán)重危害各種作物，常導(dǎo)致減產(chǎn)甚至毀滅。我國保護(hù)地近幾年發(fā)生頻繁，嚴(yán)重障礙了番茄的生產(chǎn)，帶來了不可估量的損失。 病菌可為害葉、莖、花及果實(shí)。 苗期受害可造成莖葉腐爛，呈污綠色至灰褐色，表面密生灰霉 ； 成株期發(fā)病，葉 片上形中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒論 3 成 V字形斑，淺褐色，有稀疏輪紋，邊緣變黃，潮濕時(shí)，表面生稀疏灰褐色霉層 ；也可以形成不規(guī)則形和圓形輪紋斑；葉柄折斷侵染后呈水浸狀褐色斑塊。 花受害時(shí)花瓣及柱頭腐爛脫落，受害的柱頭常使幼果果臍染病。果實(shí)受害多始于果臍或果蒂，青果受害多 ， 果面上出現(xiàn)水浸狀褪色斑，漸擴(kuò)大致全果腐爛，病部表面密生灰褐色霉層 ，失去商品價(jià)值 。 近年在發(fā)病嚴(yán)重的地塊和時(shí)期，出現(xiàn)了“花臉斑”和莖基部腐爛的現(xiàn)象（ 2002； ， 2003； ， 2004； 2004；林柏青等， 1998；李保聚等， 1999；趙統(tǒng)敏等， 1999）。 。 灰霉病病菌屬于半知菌亞門、葡萄孢屬的灰葡萄孢菌 (。病菌的孢子梗數(shù)根叢生，具隔、褐色，頂端呈1分枝，梗頂稍微膨大，呈棒頭狀，其上密生小柄并