1 第一章 研究綜述 狀腺髓樣癌 狀腺髓樣癌的起源 甲狀腺癌是最常見的頭頸部惡性腫瘤，也是近年來發(fā)病率增加最快的惡性腫瘤之一 1。主要有甲狀腺乳頭狀癌、 甲狀腺 濾泡狀癌、 甲狀腺 髓樣癌和未分化 型甲狀腺 癌四種病理類型。甲狀腺髓樣癌 （ 一種起源于分泌降鈣素（ 甲狀腺濾泡旁 C 細(xì)胞的較少見的神經(jīng)內(nèi)分泌瘤，雖然其占全部甲狀腺惡性病的比例小于 10%，2。降鈣素可作為 斷和術(shù) 后療效判斷的指標(biāo)，因?yàn)槠涫?異性的腫瘤標(biāo)志物， 1959 年首次描述了 組織學(xué)表現(xiàn)，認(rèn)為它是一種獨(dú)立病理類型的甲狀腺腫瘤。 1906 年本病被首次報(bào)到， 其稱為 “伴淀粉樣變的惡性結(jié)節(jié)性甲狀腺腫 ”。由于起源于屬神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的甲狀腺 C 細(xì)胞，并且與甲狀腺濾泡細(xì)胞無關(guān)，故病理學(xué)家將它歸為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤或 狀腺髓樣癌的特征 臨床上分為散發(fā)性甲狀腺髓樣癌 (家族性 甲狀腺髓樣癌 ( 以 見 ， 占 75%3,4。 據(jù)其遺傳特點(diǎn)可分為多發(fā)性內(nèi)分泌瘤 2A 型 (A， 多發(fā)性內(nèi)分泌瘤 2B 型（ ）和無 族型 5。其發(fā)病通常是多病灶性和雙側(cè)性的。是一種由 癌基因的種系突變引起的常染色體顯性綜合征 6對(duì) 族性髓樣癌的突變分析表明有超過 30 個(gè)不同的錯(cuò)義突變。許多錯(cuò)義的 因突變可導(dǎo)致 學(xué)者提出這些錯(cuò)義的突變與遺傳性的 3 種不同的表型相互對(duì)應(yīng) 9。目前已知這種種系 癌基因位于染色體 ，并且該原癌基因的點(diǎn)突變就能導(dǎo)致甲狀腺 C 細(xì)胞的增生 10 約 80%的遺傳性髓樣癌是以 的形式存在的 12。系 1961 年 次描述此綜合征，以 主要臨床表現(xiàn)，約50伴有嗜鉻細(xì)胞瘤 ( 30 有甲狀旁腺增生或腺瘤 (13。伴有先天性巨結(jié)腸癌和皮膚淀粉樣變苔蘚 11。巨結(jié)腸癌是由于在大腸缺乏了自主交感神經(jīng)，導(dǎo)致結(jié)腸擴(kuò)張 、 便秘 、 梗阻所致。皮膚淀粉樣變苔蘚在肩 2 上會(huì)有瘙癢的皮疹 12。 與 相比較少見，約只占 的 5%，兩者在臨床上有很大的區(qū)別。在 1966 年 次報(bào)道了 的特點(diǎn)有 膜多發(fā)性神經(jīng)瘤、 時(shí)伴有類馬凡（ 合征，并且少數(shù)患者常伴有多發(fā)性胃腸道神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤，角膜神經(jīng)粗大，骨骼發(fā)育異常及發(fā)育延緩等，但無甲狀旁腺疾病 。不同的粘膜神經(jīng)瘤存在于末梢的舌、唇粘膜和結(jié)膜下區(qū)域 11。 占遺傳性 5%是以在家族中存在四個(gè)或以上受牽連的 員，并患有腎上腺髓質(zhì)或甲狀旁腺參與缺失來定義的。肉眼下癌組織呈實(shí)體狀 ， 切面灰白 ， 無明顯包膜 ， 在甲狀腺組織中呈多中心性生長。病理組織學(xué)特征為 ： 細(xì)胞呈梭形或紡錘形 ， 淀粉染色陽性，這類淀粉物質(zhì)實(shí)質(zhì)上是 C 細(xì)胞分泌的降鈣素和其它多肽類激素。 臨床表現(xiàn)與其它類型的 本相似，主要表現(xiàn)為緩慢生長的頸前腫塊，伴有或不伴有頸部淋巴結(jié)腫大或腹瀉。不同的是發(fā)病年齡偏小，病程 進(jìn)展相對(duì)緩慢 。 多表現(xiàn)為雙側(cè)甲狀腺腫塊，這與 C 細(xì)胞在甲狀腺內(nèi)分布的組織學(xué)特性有關(guān)，其在甲狀腺組織中成多中心集簇狀分布。所以有人認(rèn)為對(duì) 病人主張行全甲狀腺切除術(shù)或保留部分甲狀腺下極的近全甲狀腺切除 14。 預(yù)后好于其它類型的 甲狀腺髓樣癌 癌基因編碼一種屬于酪氨酸激酶受體蛋白家族中的成員。該受體的細(xì)胞外部分連接特殊配體 ， 連接配體后 ， 是受體間聚合及激活的過程。一旦受體被激活 ,就會(huì)發(fā)生信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大 ， 所有信號(hào)都可以通過特殊底物磷酸化而被傳遞 15。激活 的 變在遺傳性的 占到了 95%，約 20%為散發(fā)性的。一些與腫瘤發(fā)生有關(guān)的 因的突變位點(diǎn)已經(jīng)被證實(shí)。除了 癌基因與 發(fā)病有關(guān)。甲狀腺細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)與 突變導(dǎo)致 調(diào) 16。約 98的 、 95的 和 88的 由 癌基因突變所致 17，有人認(rèn)為幾乎所有的 均是由 癌基因突變引起的，迄今為止尚未發(fā)現(xiàn) 中除 外的基因突變 13。除 ，在腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤中 達(dá)水平較 高 15, 這就提示 甲狀腺 C 細(xì)胞和腎上腺嗜鉻細(xì)胞的分化中起作用。至于在 達(dá)與甲狀旁腺增生之間有無關(guān)聯(lián)還未見報(bào)道。 狀腺濾泡旁細(xì)胞的定位與特征 甲狀腺濾泡旁細(xì)胞是具有形態(tài)和功能各異的細(xì)胞群。在正常條件下 ， 大多數(shù)濾泡旁細(xì)胞合成分泌降鈣素。然而，屬于 統(tǒng) 的濾泡旁細(xì)胞通過旁分泌和 /或自分泌分泌多種調(diào)節(jié)肽 ， 調(diào)節(jié)甲狀腺局部的生長和分泌過程也是其重要的 3 作用。來源于神經(jīng)嵴的濾泡旁細(xì)胞彌散于整個(gè)甲狀腺內(nèi) ， 并且能夠分泌多種調(diào)節(jié)肽。在哺乳動(dòng)物濾泡旁細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)肽有降鈣素 、生長抑素、胃泌素、促甲狀腺激素釋放激素 ( 羧基端多肽 I 和 18。而降鈣素基因相關(guān)肽 (神經(jīng)介素 U、膽囊收縮素、分泌肽 I 在濾泡旁細(xì)胞和支配甲狀腺神經(jīng)纖維中均有分布 18。 P 物質(zhì) (血管活性腸肽 (神經(jīng)肽 (組異肽 (丙甘肽 (僅存在于甲狀腺神經(jīng)纖維中。丙甘肽往往與 存 19。研究人員通過電鏡觀察證實(shí) 20，濾泡旁細(xì)胞主要位于濾泡細(xì)胞之間 ， 細(xì)胞常插入上皮細(xì)胞之間 ， 而頂部往往被相鄰濾泡上皮細(xì)胞形成的拱狀突起 所覆蓋 ， 不直接與 濾泡腔接觸。濾泡旁細(xì)胞與濾泡細(xì)胞之間存在特殊的連接復(fù)合體 ， 使它們緊密連接起來 ， 這一形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)支持了濾泡旁細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)肽對(duì)甲狀腺激素的分泌起旁分泌作用的觀點(diǎn)。長期以來人們知道 ， 當(dāng)機(jī)體對(duì)甲狀腺激素的需要量減少時(shí) ， 便可在腺體周邊濾泡腔內(nèi)看到大量含高濃度 縮的膠體聚集。在哺乳動(dòng)物中這一區(qū)域很難發(fā)現(xiàn)濾泡旁細(xì)胞 ， 但其卻出現(xiàn)在無大量膠體聚集的區(qū)域。這種甲狀腺結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)說明 ， 濾泡細(xì)胞分泌甲狀腺激素時(shí)需要濾泡旁細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)肽的調(diào)節(jié)機(jī)制參與。調(diào)節(jié)肽經(jīng)常是經(jīng)旁分泌作用附近有其受體的濾泡旁細(xì)胞。同時(shí) ， 當(dāng)濾泡旁細(xì)胞 和濾泡細(xì)胞胞膜上有其受體時(shí)調(diào)節(jié)肽可經(jīng)過自分泌起調(diào)節(jié)作用。此外 ， 濾泡旁細(xì)胞在區(qū)域內(nèi)不均勻分布的自然傾向 ， 對(duì)這一區(qū)域發(fā)生病變有重要意義 ， 這一現(xiàn)象在人類較常見 21。濾泡旁細(xì)胞也可通過分泌 55影響濾泡細(xì)胞的功能。根據(jù)最近研究 225為一種細(xì)胞之間信號(hào)分子經(jīng)旁分泌途徑從濾泡旁細(xì)胞到濾泡細(xì)胞 ， 并通過自分泌對(duì)濾泡旁細(xì)胞起刺激作用。 狀腺髓樣癌的診斷 診起來很困難，因?yàn)槠涑藘H表現(xiàn)為甲狀腺內(nèi)的結(jié)節(jié)外，無任何特殊的癥狀同時(shí)也缺乏特異性表現(xiàn)。只有當(dāng)腫瘤侵犯到包膜外界和 周圍的組織時(shí)才可以出現(xiàn)相應(yīng)的癥狀，如聲音嘶啞、氣道受壓等，也有部分患者有頑固性腹瀉。具特征的臨床指標(biāo)是血清學(xué)檢查，降鈣素與 顯升高，降鈣素異常升高是 異性和敏感性的腫瘤標(biāo)志物。通常遺傳性 發(fā)病是雙側(cè)性和多病灶性的 ， 且約 95% 發(fā)生在年輕人身上。在 病人中還可有并發(fā)癥，其中大約 42%為腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤、 25%伴發(fā)甲狀旁腺功能亢進(jìn) ，同時(shí)還可伴發(fā) ，此病是由胃腸道末梢神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失引起的。的病人發(fā)病時(shí)期較早，通常在嬰兒期或兒童期 就可發(fā)病 ， 它是遺傳性惡性程度最高的一種類型 ， 該型病人可伴發(fā)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤 ， 另外還可伴發(fā)黏膜神經(jīng)瘤 ， 胃腸道彌漫性神經(jīng)節(jié)瘤以及馬凡 (合征。家族性無甲狀腺髓樣癌病人不伴發(fā)其他任何的內(nèi)分泌腫瘤 ， 其發(fā)病年齡也比 4 的病人要大 ， 并且其病程進(jìn)展也相對(duì)較緩。 狀腺髓樣癌的治療 由于 于甲狀腺濾泡旁細(xì)胞，不具有依賴 生物學(xué)特性，也不具備攝碘功能，因此內(nèi)分泌治療和 131I 治療均無效。所以目前手術(shù)切除仍是首選的根治方式。其惡性程度介于分化型與未分化甲狀腺癌之間， 多數(shù)患者療效欠佳13,23。目前認(rèn)為 了外科手術(shù)，其它治療方法基本無效 24。放療、化療僅作為一種姑息治療方法，生物治療在晚期 初步開始應(yīng)用，但大多還處于臨床研究階段，真正用于臨床還有距離 25。經(jīng)手術(shù)治療的 者，如果血清降鈣素水平降到正常值就說明腫瘤被完整切除了。術(shù)后若血清降鈣素水平升高，表明手術(shù)切除不徹底或疾病又復(fù)發(fā)了。對(duì) 治療也以手術(shù)為主，對(duì)同時(shí)患有腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤者，應(yīng)先行嗜鉻細(xì)胞瘤切除術(shù)。因?yàn)槿粝刃屑谞钕偎铇影┦中g(shù)，有誘發(fā)高血壓危象或心衰發(fā)生的可能。 因 因突變是 病的分子學(xué)基礎(chǔ)，所以對(duì)于有關(guān)的 各種生物免疫治療，大多數(shù)是基于 因，同時(shí)， 源于甲狀腺濾泡旁細(xì)胞，組織中表達(dá)的降鈣素，降鈣素基因相關(guān)肽等在其他組織中很少表達(dá)或不表達(dá)，對(duì)其啟動(dòng)子調(diào)控可以解決載體的甲狀腺靶向性問題。因此分子靶向藥物、腫瘤疫苗、單克隆抗體、自殺基因或免疫基因等已經(jīng)在臨床使用或臨床前試驗(yàn)中取得了令人鼓舞的前景 23。在 胞系實(shí)驗(yàn)中，證實(shí)此類型重組腺病毒載體可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞生長 24。隨著對(duì)甲狀腺癌生物知識(shí)的了解，已確定了一些生物靶向治 療因子。凡德他尼（ 顯著延緩局部晚期或轉(zhuǎn)移性甲狀腺髓樣癌發(fā)生和進(jìn)展的時(shí)間 26。從上述這些分子靶向治療藥物對(duì) 治療原理來看，其顯示出了誘人的應(yīng)用前景。 在問題及展望 甲狀腺癌根治術(shù)后影響生存率因素有很多，主要為手術(shù)根治程度、患者的年齡及腫瘤的臨床分期。其中對(duì)甲狀腺原發(fā)灶手術(shù)方式的選擇仍存在分歧，然而生率低，臨床表現(xiàn)多樣性，預(yù)后影響因素文獻(xiàn)報(bào)道不盡相同 25。且術(shù)后甲狀腺功能不足和甲狀旁腺功能不足等并發(fā)癥的危險(xiǎn)明顯增加。由于甲狀腺髓樣癌具有早期轉(zhuǎn)移的特性， 多數(shù)患者術(shù)后可發(fā)現(xiàn)腫瘤殘存，所以，很有必要對(duì)甲狀腺髓樣癌進(jìn)行更多的研究，為尋找新的有效的治療方法提供理論基礎(chǔ)。 盡管對(duì) 在認(rèn)識(shí) 發(fā)病機(jī)制和相關(guān)性方面已取得進(jìn)展，然而，在對(duì)此疾病的某些方面，如個(gè)體有相同的突變但在臨床上存在異質(zhì)性方面，還沒有很好的答案， 因的多態(tài)性與 關(guān)性可能解釋這一現(xiàn)象。從臨床獲得的資料 5 經(jīng)研究證實(shí) 多態(tài)性在散發(fā)性的 起著重要的作用。然而，一些資料未能證實(shí)這些 變種與 發(fā)生或疾病的進(jìn) 展有任何的關(guān)系 27。也許不同的人種背景和研究方法的缺陷是得到上述不同結(jié)果的潛在原因，在這些方面都存在爭議 27。 生物學(xué)行為可通過分子診斷來指導(dǎo)臨床實(shí)踐 ， 變測試提高了 早期診斷率，并可減少不必要的早期及過度的預(yù)防性手術(shù)切除，提高了總體生存率 27。同時(shí)對(duì) 不同臨床表現(xiàn)的分子機(jī)制方面的研究進(jìn)展，可進(jìn)一步細(xì)化基因型 而進(jìn)一步適應(yīng)治療。 分子靶向治療藥物雖然顯示出誘人的前景，但也存在一些問題。 主要是靶向治療是一個(gè)長期、緩慢的治療過程，見效比較慢，藥物在肝 、 腎臟的 網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)沉積是否會(huì)引起患者中毒或栓塞，對(duì)其臨床試用的給藥有效性進(jìn)行合理的評(píng)價(jià)尚存在一定的困難，因此其臨床用藥的最佳劑量和用藥時(shí)間還存在一定的問題。隨著臨床試驗(yàn)的開展，出現(xiàn)了一些對(duì)靶向藥物耐藥性的報(bào)道，同時(shí)不同的靶向藥物對(duì) 者療效差異較大，用藥方案應(yīng)根據(jù)患者 變的不同位點(diǎn)或表達(dá)水平等制定，藥物選擇的適應(yīng)癥較強(qiáng)，臨床普及困難。 于其獨(dú)特的分子病因?qū)W基礎(chǔ)， 已 顯示出生物治療的廣闊前景。雖然目前多數(shù)研究還局限于體外細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，即使應(yīng)用于臨床治療規(guī)模也較小，但隨著分子生物學(xué) 的進(jìn)展和基因工程技術(shù)的完善，生物治療在 綜合治療中必將發(fā)揮更加重要的作用。但在實(shí)際應(yīng)用中，仍存在一些問題有待解決。 狀旁腺素（ 狀旁腺素的特點(diǎn)及定位 甲狀旁腺素是甲狀旁腺主細(xì)胞分泌的堿性單鏈多肽類激素，由 84個(gè)氨基酸組成 ，其 15個(gè)氨基酸殘基的前甲狀旁腺激素原，分泌過程中它首先在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜周質(zhì)腔中被信號(hào)肽酶切除 5個(gè)氨基酸的信號(hào)肽部分成為甲狀旁腺激素原，然后在高爾基體中被切掉 6個(gè)氨基酸的前體部分成為 84肽成熟激素 28。 84肽在體內(nèi)可降解成 活性片斷，由于 有 此， 端 29。以后這一前身物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)裂解成為含 90個(gè)氨基酸的第二前身物質(zhì)甲狀旁腺激素原，后者進(jìn)而在細(xì)胞內(nèi)裂解成為含 84個(gè)氨基酸的多肽，即 在血鈣降低的情況下釋放到血液中。 酸，堿性氨基酸的含量比較豐富。各種哺乳動(dòng)物，如牛、豬、狗、鼠 以及禽類如雞等的 魚類的 垂體中也發(fā)現(xiàn)有 6 該基因定位于人第 12號(hào)染色體 5744，基因全長133123屬于人類，是人類大規(guī)模測序所獲得的具有完整 過對(duì)非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的檢索，發(fā)現(xiàn)該蛋白在多個(gè)物種中具有高相似性的蛋白質(zhì)，其相似性分別為獼猴 穴兔 豬 馬 牛 大鼠 小鼠 原雞 斑馬魚 30。 理化性質(zhì)和親水性預(yù)測結(jié)果表明該蛋 白預(yù)測分子量為 論等電點(diǎn)為 堿性蛋白質(zhì)。 狀旁腺素的生理功能與作用原理 在哺乳動(dòng)物中， 節(jié)鈣和磷的代謝，促使血鈣水平升高，血磷水平下降。 血鈣時(shí)， 合于腎和骨靶細(xì)胞上的 通過對(duì)靶細(xì)胞直接或間接的作用幫助血鈣維持在一定范圍。在腎臟中， 1- 羥化酶的活性，增加腸 內(nèi) 1， 253介導(dǎo)的鈣吸收；在骨骼中， 能通過直接作用于成骨細(xì)胞和間接作用于破骨細(xì)胞維持鈣代謝的長期穩(wěn)定。另外， 可通過抑制腎近端小管和遠(yuǎn)端小管對(duì)磷的重吸收 使血磷濃度維持在正常范圍 31 。 生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究表明， 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。其中參與磷脂酶 蛋白激酶 C (號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的是高親和度受體，而參與腺苷酸環(huán)化酶 (號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的是低親和度受體 。 a+換，是 白激酶 刺激新的葡萄糖生成和鈣三元醇的合成、抑制 K+目前尚未找到其作用的靶蛋白。另外， 介導(dǎo)的雙重作用 (增加上皮電位差和打開細(xì)胞表面的離子通道 )刺激對(duì)二價(jià)陽離子的重吸收；而 括頂膜鈣通道嵌入膜中、基側(cè)氯通道打開引起細(xì)胞超極化以及調(diào)節(jié) 種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑都參與該過程，但其靶分子尚未確證 32。 一般認(rèn)為 端，但是其 端的另一些生物活性可能是必需的。另有研究表明， 9別是 69和 84位的氨基酸，對(duì) 端和成骨細(xì)胞的特異性結(jié)合起到很重要的作用 33。 端，其 1留了 7 受體結(jié)合和生物 活性所需結(jié)構(gòu)為 端的兩個(gè) 端 15端的高親和力作用 (這對(duì)受體的結(jié)合起決定性作用 )以及 端 1這與受體的激活密切相關(guān) )，而 159位的氨基酸殘基可影響 端與受體近膜區(qū)的結(jié)合能力 34 。 26、 27位的 參與受體結(jié)合，對(duì)活性不重要，因此分別對(duì)其進(jìn)行生物素化 (和生物素結(jié)合 )，不影響活性；但同時(shí) 生物素化后，活性丟失，可能是因?yàn)榈入婞c(diǎn)、疏水性和空間結(jié)構(gòu)均發(fā)生了改變 35。20位 它被編碼氨基酸取代，則肽的腺苷酸環(huán)化酶 (活作用失去；而當(dāng)它被非編碼氨基酸取代后，肽的 0。特異的 水側(cè)鏈、 0位 37。另外， 15位 3位 使肽以適當(dāng)?shù)目臻g構(gòu)象與受體結(jié)合 31。 狀旁腺素受體 在 胞上目前發(fā)現(xiàn)三種甲狀旁腺激素受體，其中可與 可通過 經(jīng) 和 高細(xì)胞內(nèi) 濃度，從而發(fā)揮作用。 目前研究較多的 1% 的同源性，能選擇性結(jié)合 不能結(jié)合 31，這主要與相關(guān)蛋白的 5位 36。目前，對(duì) 對(duì) 個(gè)跨膜螺旋區(qū)和一個(gè)由 150個(gè)氨基酸組成的巨大的 外區(qū)含 6個(gè)保守的 有一些保守氨基酸分散于 膜螺旋和連接跨膜螺旋的環(huán)中 31。 端 端發(fā)生結(jié)合，稱為 端 為 中 蛋白的活化相關(guān) 38。 降鈣素受體的特點(diǎn)及分布 體內(nèi)鈣代謝雖然受多種激素的影響，但是調(diào)節(jié)細(xì)胞外液中鈣離子濃度的兩種 8 主要激素是 鈣素是由甲狀腺濾泡旁細(xì)胞分泌的一種肽類激素，可以降低血鈣水平 39。降鈣素與 其作用正好相反。從表面看，這兩種激素起拮抗作用，但實(shí)質(zhì)上是相輔相成的，也正是這兩種激素的共同作用，維持著血鈣 水平的相對(duì)恒定。調(diào)節(jié)降鈣素分泌的主要生理因素也是血漿 度。當(dāng)血漿 度高于 9毫克 /100毫升水平時(shí)，降鈣素的分泌隨血鈣濃度增加而增加。當(dāng)血鈣濃度降至 9毫克 /100毫升水平以下時(shí)，血中降鈣素水平不可測出 40?？梢?，在血鈣的生理濃度范圍內(nèi)，血鈣水平同時(shí)受到 而使調(diào)節(jié)更為精細(xì) 41。 蛋白耦聯(lián)的細(xì)胞膜受體超家族，這類受體的共同特點(diǎn)是氨基酸的組成相似，有 7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，受體 中 8個(gè)半胱氨酸可能對(duì)維持受體的空 間構(gòu)象有關(guān) 42。 胞膜，分子量為 85000氨基酸序列形成 7個(gè)跨膜區(qū)及連接這些跨膜區(qū)的 4個(gè)細(xì)胞外功能區(qū)（ 4個(gè)細(xì)胞內(nèi)功能區(qū)（ 其氨基端位于細(xì)胞外，羧基端位于細(xì)胞內(nèi)，已經(jīng)證明氨基端功能區(qū)和 3、第 6跨膜區(qū)是受體激活的關(guān)鍵部位 41。人 號(hào)和第 9號(hào)染色體。 抑制 K+波狀緣的伸展活動(dòng)受限，導(dǎo)致 外還可抑制碳酸酐酶，減少酸的 分泌； 而增強(qiáng) 發(fā)現(xiàn) 逃逸 ”現(xiàn)象后，人們曾把這一現(xiàn)象歸咎于繼發(fā)性甲旁抗和 42。但后來的研究發(fā)現(xiàn)， 體外培養(yǎng)的 逃逸 ”現(xiàn)象，因而推測蛋白激酶 體的磷酸化可能降低它與 降低 內(nèi)所有調(diào)節(jié) 要是全身性的激素調(diào)節(jié)，如對(duì)體內(nèi)鈣平衡的激素，包括甲狀旁腺素、活性 維生素激素等的調(diào)節(jié) 43。它們與 們主要是通過影響 T，因此對(duì) 甲狀旁腺素受體單抗 在 中可與 可通過 經(jīng) 和 高細(xì)胞內(nèi) 濃度，從而發(fā)揮作用。 9 抗甲狀旁腺素受體的抗體是 性是由 要通過以下途徑來調(diào)控甲狀腺濾泡旁細(xì)胞的生理反應(yīng) ： l）腺苷酸環(huán)化酶 (徑 ： 體 G 蛋白 調(diào)控基因表達(dá)，該途徑主要調(diào)節(jié)一些蛋白的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控甲狀腺激素的分泌和甲狀旁腺細(xì)胞的增殖。 2）三磷酸肌醇 (徑 ： 體 G 蛋白 磷脂酶 C磷脂酰肌醇二磷酸 ( 二酰基甘油（ +即此時(shí)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生兩個(gè)第二信使， 過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的 道結(jié)合，使 放入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，升高的度刺激 釋放，從而促進(jìn)甲狀腺激素的合成。 體與甲狀腺髓樣癌細(xì)胞株 狀腺髓樣癌細(xì)胞株的研究進(jìn)展 T 細(xì)胞株的建立 及特征 甲狀腺髓樣癌細(xì)胞株是 1981 年由 建立，其來自一位 77 歲白人女性的穿刺活檢標(biāo)本，取自甲狀腺髓樣癌組織，通過單細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法，傳 代培養(yǎng) 24，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，也叫甲狀腺導(dǎo)管癌細(xì)胞株（ 胞株）。 胞可持續(xù)產(chǎn)生高水平的降鈣素和癌胚抗原 （ 細(xì)胞形狀大多為梭形，少數(shù)為不規(guī)則形。此細(xì)胞培養(yǎng)于含 15%胎牛血清的 養(yǎng)基中，于 37 養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 胞株是高度分化的 胞株中的一種，代表了少數(shù)幾個(gè)人類上皮細(xì)胞中能分泌多肽激素的一類細(xì)胞，這些細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的特征包括成熟的糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、顯著的高爾基體和一些數(shù)量可觀的分泌顆粒。通過免疫組織化學(xué)已證實(shí) 了在 胞中有許多的激素，降鈣素（ 降鈣素基因相關(guān)肽（ 它們是相同基因的產(chǎn)物，但不同的是在 因轉(zhuǎn)錄時(shí)的 選擇性剪切中 40。 胞不但分泌一些激素：如 神經(jīng)降壓素 、 腦啡肽 、 泌素釋放肽 (、 5且也可產(chǎn)生嗜鉻粒蛋白家族的功能蛋白，如突觸小泡蛋白、 結(jié)合蛋白和酪氨酸羥化酶等 45。 胞株與構(gòu)建的其它的甲狀腺髓樣癌細(xì)胞株相比，是目前為止最可信賴的人類濾泡旁細(xì)胞的模型系統(tǒng)。 1932 年， 一次提出了甲狀腺濾泡旁細(xì)胞 ，命名為哺乳動(dòng)物甲狀腺特定地內(nèi)分泌非濾泡細(xì)胞 46。 1967 年 過免疫熒光法成功地證實(shí)了在濾泡旁細(xì)胞中存在著降鈣素，促進(jìn)了對(duì)甲狀腺濾泡旁細(xì)胞的研究。同時(shí)也提出它們是由甲狀腺濾泡旁細(xì)胞特異性分泌的，因?yàn)樗鼈兤鹪从邛w后體， 10 為它們應(yīng)該被叫做 C 細(xì)胞。因此， C 細(xì)胞和濾泡旁細(xì)胞被用來描述相同類型的，能分泌降鈣素的甲狀腺細(xì)胞。目前在文獻(xiàn)中這兩種名稱通用。甲狀腺髓樣癌（ 源于濾泡旁細(xì)胞，是由濾泡旁 成的。 1959 年以前， 未分化型甲狀腺癌沒有區(qū)別開來。因?yàn)樗徽剂怂屑谞钕侔┑?10%，且只發(fā)生在年輕個(gè)體中。大約 25%的 多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤綜合癥（ 關(guān)。研究發(fā)現(xiàn) 產(chǎn)生降鈣素，認(rèn)為其為 標(biāo)志物。濾泡旁細(xì)胞產(chǎn)生的降鈣素和其它的典型物質(zhì)在早期的 斷中是很有價(jià)值的，尤其是在五肽促胃酸激素刺激后篩查潛在的 族成員中。一些濾泡旁細(xì)胞非典型的物質(zhì)如 神經(jīng)降壓素 、腦啡肽 、 5前已建成了起源于 不同的細(xì)胞株。 1974 年， 第一次描述了 保持了原始腫瘤的一些形態(tài)學(xué)和功能特征 46。另一個(gè)起源于鼠 細(xì)胞株是 44胞株，它是在 1987 年由 描述的，此細(xì)胞可合成和分泌神經(jīng)降壓素，降鈣素，胃泌素釋放肽。 1983 年， 將鼠 胞株成功地用于濾泡旁細(xì)胞的模式系統(tǒng)。此細(xì)胞表達(dá)降鈣素，降鈣素基因相關(guān)肽和縮膽囊肽。 起源于人甲狀腺髓樣癌的 胞株是目前的最穩(wěn)定的細(xì)胞株。 胞與正常的甲狀腺濾泡細(xì)胞相比，表達(dá)較低量的分泌顆粒。雖然在人類和大多數(shù)哺乳動(dòng)物包括 小鼠中，發(fā)現(xiàn) 胞可以產(chǎn)生一些激素和功能蛋白標(biāo)志物，但第一次免疫組化證明的一些激素為僅為 5 余的激素的 通過細(xì)胞雜交化學(xué)法檢測到的，間接的證實(shí)了其的存在 47。通過放射免疫法測定培養(yǎng)基中的激素，或通過免疫細(xì)胞化學(xué)法研究培養(yǎng)的 胞，已證實(shí)在細(xì)胞中存在的蛋白與分泌顆粒有關(guān)。這些蛋白包括嗜咯粒蛋白 A，突觸小泡蛋白。一個(gè)非常重要的發(fā)現(xiàn)是在 胞中檢測到了 經(jīng)元特異性烯醇化酶）， 含量 隨著 泌物而改變，內(nèi)染色的強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi) 量相反，與培養(yǎng)基中 水平有直接的關(guān)系。因此， 可能被用來估計(jì) 胞的功能特征。 1985 年 過免疫細(xì)胞化學(xué)法在研究髓樣癌時(shí)明確了 細(xì)胞骨架蛋白的重要特征。 1995 年在酶參與的氨基酸生成 實(shí)驗(yàn) 中，在 胞中發(fā)現(xiàn)了胸腺肽縮化酶。在胞液 ，發(fā)現(xiàn)了鈣結(jié)合蛋白和酪氨酸羥化酶。一些標(biāo)志蛋白已經(jīng)在胞液和細(xì)胞骨架中檢測到，代表性的分別有 胞角蛋白。 胞株生物學(xué)特性的研究 胞分 泌物的調(diào)節(jié)機(jī)制是其生物學(xué)特性研究的熱點(diǎn)。通過對(duì) 胞超微結(jié)構(gòu)觀察和細(xì)胞免疫化學(xué)法染色發(fā)現(xiàn)： 胞與正常的甲狀腺濾泡旁細(xì)胞和大多數(shù)髓樣癌細(xì)胞很相似，所以 用此細(xì)胞株來研究甲狀腺髓樣癌細(xì)胞的分泌和調(diào) 11 節(jié)功能以及用于臨床研究較為合適。大多數(shù)研究 胞分泌功能的調(diào)節(jié)涉及到 過雜交細(xì)胞化學(xué)法和免疫超微研究證實(shí) 胞可以產(chǎn)生兩種 兩種激素（ 決定是產(chǎn)生是 由 錄為 的選擇性剪切決定的。目前選擇 性剪切的機(jī)制還沒有完全澄清，此過程受包括激素在內(nèi)的若干因素的影響。在甲狀腺 C 細(xì)胞中， 主導(dǎo)地位，而 神經(jīng)組織中大量存在。然而，剪切決定不是絕對(duì)的，正常的甲狀腺 C 細(xì)胞除了可產(chǎn)生還可產(chǎn)生少量的 分泌的 培養(yǎng)的 胞的生長時(shí)期有關(guān)，分泌的最高期是在 胞生長的穩(wěn)定期，最低是在指數(shù)期 48,49。這些在培養(yǎng)的細(xì)胞中的變化有可能與 人的行為一致。通過細(xì)胞質(zhì) T 與 比率隨著 胞的增殖而變化。在 初期培養(yǎng)時(shí)， CT 水平很高， 水平相對(duì)較低，在早期的對(duì)數(shù)生長期， 水平成倍的增長，而 CT 水平變化很輕微，隨著細(xì)胞接近融合，CT 水平都增長，隨后， 水平在融合后大體上降低，而 CT 水平保持上升。通過放線菌素 D 阻止最初的轉(zhuǎn)錄表明，這些與增長有關(guān)的 率的可逆改變不是因?yàn)槎ㄐ缘淖兓?50。研究表明 胞可逆的改變 擇性剪切的模式是由于體外的生長條件， 所以在 胞快速增長時(shí) CT 平低而平高 51。 1987 年 報(bào)道 1， 25減少 胞中 因的表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)于 1988 年由 小鼠的實(shí)驗(yàn)中證實(shí) 46。 1991 年， 過免疫細(xì)胞化學(xué)法在 胞的細(xì)胞核和細(xì)胞液中證實(shí)了 1， 25體的存在。他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)將細(xì)胞培養(yǎng)于生理濃度或高 1， 25度時(shí)受體的水平增加。相似地，相同劑量的 1， 25制分泌，指出在 1， 25間存在著反饋調(diào)節(jié)。 由此推斷 1， 25用于 胞的調(diào)節(jié)機(jī)制為：鈣離子修飾 放，是以快速的方式通過濾泡旁細(xì)胞而沒有先影響 合成，因而在分泌過程中是直接的影響 46。 胞是研究甲狀腺髓樣癌最有代表性的細(xì)胞。在先前的研究中已證實(shí)生長激素抑制素獨(dú)特地結(jié)合在 胞的表面，這表明此激素的受體存在于 胞上。利用特殊的受體激動(dòng)劑和抑制劑已經(jīng)證實(shí)在 胞表面至少存在著兩種類型的生長激素抑制素的受體。已有證實(shí)奧曲肽是一種生長激素抑制素的類似物，可抑制 胞的增殖，減少 細(xì)胞中的數(shù)量，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡與壞死 52。另有研究表明，奧曲肽也影響 胞 因的表達(dá)和選擇性 12 剪切，提高了 產(chǎn)量。此影響有可能是因?yàn)?胞攜帶著生長激素抑制素受體，可自己產(chǎn)生生長激素抑制素，而生長激素抑制素以自分泌的方式不但控制著細(xì)胞的增殖也控制著其自身的表達(dá) 53。也有人認(rèn)為 胞是良性 為它們有相同的生物學(xué)性能，其等同于體內(nèi)正常的 C 細(xì)胞 54。胃泌素不僅可以誘導(dǎo) 放 可促進(jìn) 胞中 因的轉(zhuǎn)錄，伴隨地嗜鉻粒 蛋白 A 表達(dá)被促胃泌素激活 55，表明 胞對(duì)研究促胃泌素和 分泌，基因活性和增殖效應(yīng)是一個(gè)新的靶點(diǎn)。 T 細(xì)胞株的研究展望 甲狀腺髓樣癌的發(fā)病率為 8%但死亡率遠(yuǎn)高于 10%。目前手術(shù)切除是唯一可選擇的根治方式，通過體外培養(yǎng) 胞而模擬 胞體內(nèi)的生存環(huán)境，給于一些藥物干預(yù)，通過生物學(xué)方法測定細(xì)胞的生長狀況，如增殖 、 凋亡 、壞死等，來預(yù)測藥物對(duì) 作用，為藥物開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。 2011 年在 研究了三種 酶在 26 個(gè) 者組織中的表達(dá)情況并且分析了 酶的抑制劑 胞的生長及腫瘤發(fā)生學(xué)的影響 56。此研究最后得出的結(jié)論是 以抑制 胞的生長及其的腫瘤發(fā)生學(xué)，在 治療方面有潛力。 一個(gè)很重要的特征是氨酸激酶原癌的轉(zhuǎn)變， 皮生長因子受體（ 血管內(nèi)皮生長因子受體激酶的 爭性抑制劑 57。 研究了人甲狀腺髓樣癌細(xì)胞株 作用機(jī)制， 表明 胞的增殖 58。通過 擾技術(shù)敲除單個(gè)受體表明 賴于殖，在給 胞給于 理的情況下，再給于 制劑使細(xì)胞增殖。這表明在 胞中， 靶向治療藥物 一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。對(duì) 胞株基因研究的結(jié)果對(duì)人甲狀腺髓樣癌的治療有重大意義，了解不同原癌基因在人類惡性腫瘤中扮演的重要角色，為 基 因的治療提供視角。最近 胞被用 來研究 癌基因的下調(diào)表 達(dá)， 癌基因在人類腫瘤中大量的表達(dá)。 胞株是用來研究 位基因突變的生物活性和生物化學(xué)性能的合適模型，隨著（ 2導(dǎo)的 胞分化可導(dǎo)致 著對(duì) 胞結(jié)構(gòu)和功能的研究繼續(xù)，有越來越多的材料可用于支持這個(gè)理論：研究人類濾泡旁細(xì)胞這些獨(dú)特的細(xì)胞株仍是最可信賴的模型系統(tǒng)。 體對(duì) 胞株的作用機(jī)制 促甲狀腺激素（ 是腺垂體分泌的促進(jìn)甲狀腺生長的激素，主要作用于甲狀腺。 甲狀腺濾泡細(xì)胞 13 的特異 受體結(jié)合促進(jìn)甲狀腺激素的釋放，促進(jìn) 合成 59。 方面受下丘腦分泌的促甲狀腺激素釋放激素（ 促進(jìn)性影響，另一方面又受到甲狀腺分泌的 饋性的抑制性影響。 因位于染色體 14度為 6060包括 10 個(gè)外顯子和 9 個(gè)內(nèi)含子，第 1顯子編碼 N 端鏈的膜外區(qū)蛋白，第 10 外顯子編碼跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)蛋白 62,63。長 2470碼 764 個(gè)氨基酸，分子量為 85糖鏈后為 100白屬 G 蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，為一大分子糖蛋白。 甲狀腺癌的內(nèi)分泌治療是基于反饋抑制促甲狀腺激素的分泌。甲狀腺髓樣癌起源于甲狀腺濾泡旁 C 細(xì)胞，不受 影響，因此傳統(tǒng)的促甲狀腺激素抑制療法對(duì) 者無效。甲狀腺髓樣癌分泌降鈣素，而患者的血鈣濃度在正常范圍內(nèi)，其主要原因與甲狀旁腺素的調(diào)節(jié)有關(guān)，是否可以推測甲狀旁腺素在甲狀腺髓樣癌中起調(diào)節(jié)作用。已有研究證實(shí) 以抑制某些細(xì)胞株的增殖，如骨和腎細(xì)胞，但對(duì) 胞是 否也有增殖作用目前還未報(bào)道。 體可與胞內(nèi)的 合，從而使細(xì)胞內(nèi) 含量增加，此實(shí)驗(yàn)中我們以甲狀腺髓樣癌細(xì)胞株（ 研究對(duì)象，模擬 內(nèi)的生長狀態(tài)，外源性的給予 體兩種藥物，檢測細(xì)胞的生長狀況，為基礎(chǔ)研究提供一系列的證據(jù)。 驗(yàn)的目的意義 （ 1） 通過研究 體在 胞中的作用，推測其對(duì)甲狀腺髓樣癌病變的影響，初步分析甲狀腺髓樣癌的激素調(diào)控機(jī)制。 （ 2） 為甲狀腺髓樣癌治療提供新的途徑，并對(duì)臨床藥物的開發(fā) 和甲狀腺髓樣癌研究提供平臺(tái)。 （ 3）目前國內(nèi)外對(duì)此方面的報(bào)道比較少，因此，探討 體對(duì)甲狀腺髓樣癌細(xì)胞調(diào)空機(jī)制有非常重要的價(jià)值和臨床意義。 14 第二章 材料與方法 究對(duì)象 甲狀腺髓樣癌細(xì)胞株（ 胞株），此細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，來自一 位 77 歲白人女性的穿刺活檢標(biāo)本， 胞持續(xù)產(chǎn)生高水平的降鈣素和 癌胚抗原 。在更換培養(yǎng)基后 24 小時(shí)和 72 小時(shí)在培養(yǎng)基中檢測到的免疫活性的降血鈣素濃度分別為 3900萬細(xì)胞和 7700萬細(xì)胞。 72 小時(shí)后 累濃 度超過 27萬細(xì)胞。 要試劑及器材 主要試劑包括 養(yǎng)基（ 15%，美國 司） 、 胎牛血清（ 司） 、胰蛋白酶（ 1%） 、 、 青霉素（ 500U/、 鏈霉素（ 500U/、 谷氨酰胺（ ） 、 丙酮酸鈉（ ） 、 、 、 細(xì)胞 凋亡 檢測試劑盒（ 、 、一鏈 成試劑盒（上海生工 ） 、 步法 劑盒（ 。 主要設(shè)備包括 ，流式細(xì)胞儀（美國 倒置相差顯微鏡（ 艾科浦超純水系統(tǒng)（ 超凈工作臺(tái)， 養(yǎng)箱，立式壓力蒸汽滅菌器，低俗大容量多管離心機(jī)（ 液氮罐， 電腦電熱恒水槽，恒溫干燥箱，電熱恒溫培養(yǎng)箱均由國內(nèi)公司生產(chǎn)。 表 1 測的引物序列 - 3 - 3 398 - 413 15 胞的培養(yǎng) 器的清洗及消毒 使用的培養(yǎng)器皿，要嚴(yán)格進(jìn)行清洗，以去除所帶有的灰塵、鉛、砷等物質(zhì)，并消除其弱堿性，降低各種有害物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的損害。先用自來水加洗衣粉浸泡過夜，浸泡后用軟毛刷進(jìn)行刷洗，刷洗干凈后置于 烘箱烘干，然后浸入酸中過夜，酸液具有很強(qiáng)的腐蝕作用，操作過程中要戴防護(hù)用具。浸酸后的玻璃器皿先用自來水充分沖洗，至少?zèng)_洗 10 次，直至沒有任何酸浸液殘跡，然后依次用一蒸水，三蒸水漂洗 3 遍， 2 遍，要求干凈透明。置于烘箱烘干，用牛皮紙、棉布、鋁飯盒、玻璃或金屬制吸管筒、棉線繩等嚴(yán)格包裝好，以防止消毒滅菌后再次遭受污染，固體一般在 126高壓 30 分鐘。液體 121高壓 10 至 20 分鐘，將針頭插入膠塞使其透氣。 對(duì)于塑料瓶蓋或膠塞