第一章 前言 1 研究背景 泌尿系結(jié)石是一種 常見病， 它在發(fā)病率方面 僅次于泌尿系感染和前列腺疾病， 其中草酸鈣結(jié)石約占了 80%1。 隨著 人們生活條件的提高，以及全球飲食文化向發(fā)達(dá)國(guó)家靠攏，上尿路結(jié)石發(fā)病率明顯高于下尿路。隨著泌尿系腔鏡和微創(chuàng)手術(shù)的快速開 展如 及 新 技術(shù) 在 臨床 上 廣泛的應(yīng)用 ， 泌尿系結(jié)石的治療取得突 破性的進(jìn)展 。 經(jīng)皮腎鏡 取石術(shù)、 體外沖擊波碎石術(shù)（ 鈥激光碎石 、 經(jīng)輸尿管鏡取石 碎石術(shù) 等 等能夠給予 絕大多數(shù)患者得到 微創(chuàng) 而有效的治療 結(jié)果 。不僅避免 了 一系列 由于 結(jié)石長(zhǎng)期存在造成的 臨床癥狀 ，例 如 感染、血尿 、 疼痛 ， 而且也 避免了 由于結(jié)石長(zhǎng)期刺激引起的 鱗狀上皮 癌。然而在臨床 醫(yī)療 實(shí)踐 過(guò)程 中， 這些微創(chuàng)技術(shù)也存在它們的不足和禁忌癥，例如反復(fù) 的 進(jìn)行 療 極有可能 能會(huì)引起腎 功能 損傷， 嚴(yán)重 患 者甚至 出現(xiàn)腎功能 衰竭 和尿毒癥。 長(zhǎng)期的 遺 留 的 結(jié) 石碎片會(huì) 促使并發(fā)癥的發(fā)生，例如 泌尿系 感染和結(jié)石 進(jìn)一步復(fù)發(fā) 。此外，經(jīng)皮腎鏡 、 鈥激光 碎石 也 伴隨 有很多 嚴(yán)重 手術(shù)的并發(fā)癥 ，例如 輸尿管 急性 穿孔 、 狹窄、 結(jié)石 遺留、腎乳頭 大 出血 等 等 。 相關(guān) 資料表明 ，如果 在 后有采取 相關(guān)的進(jìn)一步 治療 措施， 泌尿結(jié)石的治愈率會(huì)明顯的升高 ，包 括一些腎盞內(nèi)有高難度的結(jié)石也可以達(dá)到清除治愈的效果。 然而 雖然各個(gè)部位泌尿系的結(jié)石均可以得到很好的治療 效果，但是我們知道無(wú)論何種 結(jié)石的復(fù)發(fā)率是很高的，如果結(jié)石復(fù)發(fā)，不僅會(huì)給患者帶來(lái) 心里和生理上的痛苦，還會(huì)室再次 手術(shù)的難度 大大增加 。泌尿系畸形、 感染 、結(jié)石 家族史 、年輕 的 結(jié)石 發(fā)病年齡 、 代謝紊亂性疾病 都 與結(jié)石的復(fù)發(fā)有 相關(guān)性 。 因此看來(lái)無(wú)論是 微創(chuàng)手術(shù)的治療還是傳統(tǒng)手術(shù)的治療都不能徹底消除它的根源和復(fù)發(fā)，所以要想從根本上治愈泌尿系結(jié)石，還是要從泌尿系結(jié)石的發(fā)病機(jī)制入手，徹底治療泌尿系結(jié)石使其被扼殺在初始狀態(tài)。 2 腎結(jié)石形成機(jī)理 石物質(zhì)的過(guò)飽和 高草酸尿：對(duì)于草酸鈣結(jié)石形成 的影響 ，最危險(xiǎn)因素之一 是高草酸尿 。因?yàn)槟?草酸濃度與 草酸鈣結(jié)晶的形成有 最 直接 的 關(guān)系，尿液草酸濃度 的提高 相對(duì)其他成石 物質(zhì)的過(guò)飽和 對(duì)腎結(jié)石形成作用要大的多。另外高 草 酸可以誘使 腎臟 細(xì)胞產(chǎn)生活化氧，過(guò) 量活化氧便會(huì)導(dǎo)致腎小管上皮的損傷， 引起上皮細(xì)胞的壞死， 為結(jié)晶的粘附 和生長(zhǎng) 提供了位 點(diǎn) 支持 2。 高鈣尿癥 ： 大約三分之一 到二分之一 的草酸鈣尿路結(jié)石患者 中 伴有高鈣尿癥。 鈣能增加很多離子的活性，以及草酸鈣和磷酸鈣晶體的過(guò)飽和濃度 ,但是增加到一定程度后 速度則會(huì)變緩，如果濃度繼續(xù)增加，相反的效應(yīng)就產(chǎn)生了。 這是由于尿鈣過(guò)多 的 時(shí) 候則 會(huì)形成螯合物， 這 表明鈣在成石方面的作用 要小于草酸 。另外鈣可以與 尿路結(jié)石抑石物質(zhì)相 結(jié)合，促使結(jié)石的 進(jìn)一步 形成。 過(guò)飽和的 普遍性：在結(jié)石患者的尿液 分析 中，草酸鈣濃度 要略 高于非結(jié)石患者，但是成石物質(zhì)濃度在尿液中是隨時(shí)可變 化 的。很多 正常人尿液中也會(huì)出現(xiàn) 草酸鈣過(guò)飽和的 不正常 現(xiàn)象 ，但是并沒有出現(xiàn) 結(jié)石 。因此，草酸鈣過(guò)飽和只是結(jié)石形成的一個(gè)充分條件而非必要條件。 制成石物質(zhì)的減少 / 促進(jìn)物質(zhì)的增多 小分子抑制物的減少：研究發(fā)現(xiàn) 枸櫞酸可以抑制 草酸鈣成核，聚集，大部分腎結(jié)石患者尿中枸櫞酸 濃度 降低。 它的 主要抑石機(jī)理包括三個(gè)方面：與鈣結(jié)合，使鈣濃度下降；草酸鈣的成核過(guò)程直接 受到 枸櫞酸鉀抑制，防止其生長(zhǎng)并抑制已形成的草酸鈣晶體 的 聚集；使尿 促使尿中其他抑制物活性加強(qiáng) 3。另外 4。并且多次 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明鎂可以抑制草酸鈣結(jié)石的發(fā)展過(guò)程 。 大分子抑制物的減少 ： 骨橋蛋白 ： 體外研究顯示骨橋蛋白可抑制一水草酸鈣結(jié)晶的形成和聚集、促進(jìn) 上皮細(xì)胞的黏附能力大于 而發(fā)揮抑制結(jié)石形成的效應(yīng) 。并且研究發(fā)現(xiàn) 骨橋蛋白 可抑制 腎上皮細(xì)胞黏附。 被證實(shí) 是正常人尿液中含量最多的蛋白。 由腎臟亨利袢升支粗段 上皮 分泌，從尿液中排出?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為 雙重性的 。 用，用 映人體形成草酸鈣結(jié)石的危險(xiǎn)系數(shù) 。當(dāng) 1時(shí)，結(jié)石發(fā)生率高 5，反之亦然。 尿 凝血酶原片段1( 1991年 發(fā)現(xiàn) 立方上皮細(xì)胞、亨利氏袢升支粗段的 產(chǎn)生，分子量 約 30幾 對(duì) 面的粘附 與這些谷氨酸的 7一羧基化程度有 一定關(guān)聯(lián) 。其 在 參與蛋白質(zhì)結(jié)合 生物礦化過(guò)程中起重要 的 作用。尿中 同， 從尿中提取的 1進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩者電泳結(jié)果特征 有較明顯的差別 ，提示 并非來(lái)源于血漿凝血酶原片段 6。 它 腎結(jié)石形成中的作用： 形成 主要在 于兩個(gè)因素： 能。 度，另一方面也受 以看出腎 內(nèi)合成的 能使其 氨酸羧化 ，從 而發(fā)揮抑制草酸鈣結(jié)晶 形成 的能力。關(guān)鍵酶，在泌尿系結(jié)石中其表達(dá)明顯增加 ，在結(jié)石的形成過(guò)程中起 到 重要作用。 腎鈣蛋白 ( 一般特征： 而等電點(diǎn)不同的一 組蛋白質(zhì) 混合物。從 動(dòng)物尿中分離得到的種異構(gòu)體 ，它 腎結(jié)石形成中的作用：正常人體尿液中， 度約為 16 ，他 能抑制 集 生長(zhǎng)，而在結(jié)石患者尿 液 中， 少。在體內(nèi) 長(zhǎng)、 聚集 等過(guò)程 。正常人尿液中， 抑制性很 強(qiáng)，其次 便 是結(jié)石中的 石病人的 。 成 是 在高濃度下， 皮細(xì)胞表面有較強(qiáng)的結(jié)合 力 。 促進(jìn)物質(zhì)：促進(jìn) 物的概念是相對(duì)的 ，有些物質(zhì)可以在結(jié)石的形成 發(fā)展 過(guò)程中促進(jìn)結(jié)石的形成，但在另外一些方面 則 又可以抑 制結(jié)石的形成，現(xiàn)在公認(rèn)的促進(jìn)物包括微量元素、壞死的細(xì)胞、細(xì)菌等 。 小管上皮細(xì)胞受損和有限的抑石能力 上皮細(xì)胞吞噬晶體能力下降：當(dāng)晶體黏附后 ， 腎臟上皮細(xì)胞 也會(huì)吞噬晶體，用來(lái) 除細(xì)胞表面潛在的晶體生長(zhǎng)點(diǎn)，保護(hù)了上皮細(xì)胞 ，形成了防御結(jié)石的機(jī)制 。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，在光鏡，電鏡，聚焦顯微鏡可觀察到上皮細(xì)胞對(duì)晶體的 吞噬和 攝取 7。然而這種抑石作用是有限的，當(dāng)成石物質(zhì)過(guò)多時(shí)超出上 皮細(xì)胞的分解結(jié)晶的能力時(shí)，則會(huì)損傷上皮細(xì)胞進(jìn)一步導(dǎo)致結(jié)石的形成 8。 腎小管上皮細(xì)胞受損：高草酸及其他有害因素可 以 傷 及腎臟上皮 ，進(jìn)一步引起炎性反應(yīng) ，可能會(huì) 導(dǎo)致上皮細(xì)胞的脫落，使基底膜暴露，為晶體的黏附生長(zhǎng)提供了 便 利 的 條件。并且壞死的上皮細(xì)胞 ， 可以成為成核聚集的基礎(chǔ) 9 德爾斑與尿路結(jié)石 發(fā)現(xiàn) 1000例人腎發(fā)現(xiàn)約有 20%的存在上皮下鈣化斑，命名為 他 最早提出腎乳頭炎癥、壞死、 纖維化、 代謝障礙等因素均可以引 起上皮下鈣化，逐漸發(fā)展為 為結(jié)石的形成提供了粘附位點(diǎn) ，一旦上皮脫落 下來(lái)，與尿接觸即可作為核團(tuán) 長(zhǎng)大成 大結(jié) 石。 要 原因 之一 ， 有人把它看做是首要原因。 反過(guò)來(lái)，結(jié)石、梗阻、感染、毒素 等外源刺激又容易導(dǎo)致腎乳頭鈣斑的形成 。 這是一個(gè)惡性過(guò)程，最近幾年， 斑和腎組織結(jié)合點(diǎn)進(jìn)行活檢，確定了結(jié)晶形成的部位和起始成分 10。 在伴高 鈣尿癥草酸鈣結(jié)石患者中，結(jié)晶的起始部位是髓袢細(xì)支上皮基底膜，成分是 磷灰石，結(jié)晶體還逐漸延伸至 終未集合管周圍間質(zhì)組織中。在大多數(shù)研究中，結(jié)晶最后出現(xiàn)在腎乳頭。結(jié)晶從腎乳頭處脫落 后進(jìn)入尿路內(nèi)， 由于尿路中的草酸鈣濃度呈過(guò)飽和的狀態(tài)， 導(dǎo)致了結(jié)石的形成。 然而 ,對(duì)于蘭德爾斑在腎結(jié)石發(fā)病機(jī)制中的作用 研究并沒有很大的進(jìn)展。原因 可能是雙重的。 1)小的蘭德爾斑 已在非結(jié)石人群中發(fā)現(xiàn) 。 因此 ,2)最基本的缺陷是 研究者 嘗試把所有結(jié)石的形成與這一假說(shuō)相匹配。 蘭德爾斑 的來(lái)源和 意義仍然 不清楚 。 他使用高分辨率射線對(duì)腎臟進(jìn)行造影 ,結(jié)果 顯示 一個(gè)位置 發(fā)展 到相關(guān)的乳頭腎小管和乳頭狀血管 11。 內(nèi)窺鏡映射的研究顯示斑塊常出現(xiàn) 在草酸鈣石和高鈣尿患者中。 埃文 等人 已經(jīng) 設(shè)計(jì) 出一組實(shí)驗(yàn)來(lái)描述 蘭德爾斑的起源和意義。 這種研究為我們理解 的發(fā)病機(jī)理 中的作用提供了重要的依據(jù) 。 對(duì) 特發(fā)性草酸鈣石的患者 進(jìn)行術(shù)中乳頭狀活檢， 發(fā)現(xiàn)腎結(jié)石可能與肥胖有關(guān)， 并且 顯示 生物磷灰石 (鈣 磷酸鹽 )是蘭德爾班的 主要成分 ， 它 起源于享勒襻的基底膜。 蘭德爾斑 已被證實(shí) 是 人類腎結(jié)石的 形路徑成是廣泛的。郭等人用映射內(nèi)鏡研究發(fā)現(xiàn) 塊覆蓋率 顯著高于對(duì)照 組的 (,斑塊豐富度與 尿中尿鈣排泄是正相關(guān)的，與尿量 利用 數(shù)字視頻記錄 ,微型計(jì)算機(jī)斷層掃描和乳頭狀活檢 ,發(fā)現(xiàn)結(jié)石 粘附率至少在 75%以上 ,支持蘭德爾斑的是 石機(jī)制 。 除了這些 代謝和 臨床數(shù)據(jù) ,埃文等人研究蘭德爾斑粘附部分的超微結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)一旦乳頭狀上皮受損，尿液蛋白質(zhì)如 骨橋蛋白和 會(huì)粘附受損上皮。 磷灰石晶體 進(jìn)一步覆蓋 ,最后草酸鈣積累形成一塊石頭。草酸鈣積累形成一塊石頭。 沒有一個(gè)發(fā)病機(jī)理可以正確地解釋所有人 的腎臟結(jié)石。然而 , 研究者 在理解蘭德爾斑在結(jié)石的發(fā)病機(jī)理 中作 用已經(jīng) 取得了 重大進(jìn)展。尋找一個(gè)合適的蘭德爾斑動(dòng)物模型仍然在繼續(xù) 。 3 鈣敏感受體在泌尿系結(jié)石中的作用研究 鈣敏感受體（ 1993 年由 2首先在牛甲狀旁腺中發(fā)現(xiàn)。人 一種 G 蛋白耦聯(lián)受體由三個(gè)部分組成 13:（ 1）位于細(xì)胞外的由 612 個(gè)氨基酸組成的親水末端；（ 2）由 250 個(gè)氨基酸構(gòu)成的 7 次跨膜結(jié)構(gòu)；（ 3）由 217 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的細(xì)胞內(nèi) C 末端。 它主要存在于腎臟和甲狀旁腺等臟器中。在腎臟中，它廣泛分布在腎單位的各個(gè)部分，尤其是在遠(yuǎn)曲小管14，對(duì)調(diào)節(jié)水和電解質(zhì)的排泄有重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)在遠(yuǎn)曲小管 以減少鈣離子的重吸收，在集合管可以減少水和 質(zhì)子的的重吸收 15。并且 因的多態(tài)性和含鈣結(jié)石有密切的關(guān)系 16。在甲狀旁腺中，血清鈣濃度升高時(shí)可以激活 而抑制甲狀旁腺激素（ 釋放進(jìn)而調(diào)節(jié)骨組織和腎臟內(nèi)鈣的代謝。 理狀態(tài)下 功能 免疫組化結(jié)果研究證實(shí)， 胞內(nèi)的 近端小管和髓質(zhì)集合管， 布在它的頂部；皮質(zhì)集合管的 可見分布于基底外側(cè)；而在遠(yuǎn)曲小管和連接管，則可能存在有種族差異性，不同的種族可分別表達(dá)在基底外側(cè)或細(xì)胞內(nèi) ，頂部 17. 當(dāng)甲狀旁腺細(xì)胞內(nèi)環(huán)境 的鈣離子濃度升高時(shí)， 、 3、 4、 三磷酸肌醇和 進(jìn)胞內(nèi)的鈣離子動(dòng)員、 胞外的鈣離子內(nèi)流，致使細(xì)胞內(nèi)的鈣離子 濃度 迅速升高，導(dǎo)致抑制 血液內(nèi)的 使 溶骨作用下降，血漿鈣離子下降；反之，當(dāng)細(xì)胞外的鈣離子下降時(shí)， 胞鈣離子內(nèi)流減少，使 骨作用加強(qiáng)，血鈣升高，從目前的的研究看來(lái)，它的作用主要是防止人體細(xì)胞外的 鈣 過(guò)度存在 18。 對(duì) 細(xì)胞分泌 降鈣素 有明顯 調(diào)控 作用。 脂酶 放非特異性離子通道 (、 胞膜去極化，電壓依賴性鈣通道 (開放，促使 19。 對(duì) 維生素 在腎臟，當(dāng)細(xì)胞外游離的 會(huì)與腎細(xì)胞膜 制 生素 17。 現(xiàn)，細(xì)胞外生理水平的高鈣能直接誘導(dǎo) 腎近端小管維生素 達(dá)升高，這一誘導(dǎo)機(jī)制需要 20。 理狀態(tài)下 機(jī)體的作用 相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)， 其是單核苷酸多態(tài)性的研究 會(huì)導(dǎo)致體 內(nèi)鈣代謝平衡紊亂，例如甲狀旁腺功能亢進(jìn)、家族性良性低尿鈣高鈣血癥 (新生兒甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn) (常染色體顯性遺傳的高尿鈣低鈣血癥 ( 21。 對(duì)腎功能的影響 : 研究證實(shí)， 腎功能調(diào)節(jié)上可能起到關(guān)鍵的作用，990定 相關(guān)性 22;也有人發(fā)現(xiàn)在 986S、 990G、 和 1011結(jié)果并不是完全一致的。 人 對(duì) 一位切除了 甲狀旁腺后 ， 仍有嚴(yán)重的高鈣血癥 婦女進(jìn)行了相關(guān)研究 發(fā)現(xiàn) ， 變是其高鈣血癥的 重要因素 。即因位于 339位的密碼子 ，它 由原來(lái)的 下游的酶發(fā)生 跟隨 改變，最終導(dǎo)致 敏 感性下降，進(jìn)一步 導(dǎo)致嚴(yán)重的高鈣血癥。 組共計(jì) 12 865名個(gè)體進(jìn)行 分析，發(fā)現(xiàn)血鈣 和 3核苷酸多態(tài)性 有關(guān)，其中最相關(guān)的為個(gè) 鈣 相關(guān)性最強(qiáng)，與亞洲后裔最相關(guān)的則是3。上述差異可能導(dǎo)致 導(dǎo)致血鈣水平 異常 或是調(diào)節(jié)異常 ，從而 重點(diǎn) 突出了 猜測(cè) 細(xì)胞外鈣離子的過(guò)度存在。 腎結(jié)石形成關(guān)系的關(guān)鍵結(jié)合點(diǎn) ： 研究發(fā)現(xiàn) 等位基因的多態(tài)性可以導(dǎo)致腎臟內(nèi) 達(dá)的下降， 達(dá)的下降進(jìn)一步影響腎臟內(nèi)離子的分泌及重吸收和水的代謝，從而促進(jìn)了結(jié)石的尤其是含鈣結(jié)石的形成，這些代謝紊亂可能會(huì)導(dǎo)致腎小管內(nèi)鈣磷結(jié)晶的沉淀，進(jìn)一步導(dǎo)致結(jié)石的形成 24。還 會(huì)在腎乳頭區(qū)形成鈣磷沉淀，促使蘭德爾斑的形成，蘭德爾斑的形成為含鈣的結(jié)晶的黏貼提供了粘附位點(diǎn)。并且有些研究發(fā)現(xiàn) 以抑制鈣磷鹽的沉積 25。免疫組化和果顯示 達(dá)下降 出現(xiàn) 在鈣化的動(dòng)脈中 ，因此 降也可能出現(xiàn)在鈣化的腎臟中 。在大鼠試驗(yàn)中， 促進(jìn)劑可以抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。很多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都表明 以保護(hù)人體器官免受鈣化， 前體可以檢測(cè)到周圍環(huán)境中離子強(qiáng)度的變化。 抗鈣化作用在腎臟中是非常的復(fù)雜的由于他的在腎臟內(nèi)對(duì)水和電解質(zhì)的代謝作用。 第二章 材料與方法 1 試劑 乙二醇、氯化銨、 于 司）、 10%甲醛（體積分?jǐn)?shù)）、水合氯醛、 體（購(gòu)于 司）、二步 法免疫組化檢測(cè)試劑 于中杉金橋）、濃縮型 劑盒（購(gòu)于北京中杉金橋）、 免試劑盒（購(gòu)于北京原子高科公司）。 疊氮化鈉、水合氯醛、甲醛、濃鹽酸、溴化鉀、溴水、高錳酸鉀、 30%過(guò)氧化氫、石油醚（ 90）、硫脲（ 硼沙、濃硫酸、枸櫞酸、三氯乙酸、乙醇、溴麝香酚藍(lán)、無(wú)砷鋅粒、變色酸、一水草酸鉀 。 2 儀器 恒溫水浴鍋（北京） 型低溫高速離心機(jī)（日本） 光分析天平（上海） 石蠟切片機(jī) (上海 ) 外可見分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公 司） 自動(dòng)生化分析儀（日本） 微量移液器： 2001005010法國(guó) 大鼠代謝籠 光學(xué)顯微鏡 (日本 ) 3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng) 體重 180200g 健康雄性 鼠（ ，由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）飼養(yǎng)于鼠籠中，每籠五只，飼養(yǎng)溫度 ： 202 、相對(duì)濕度為 45% 55%。光照：12h/d,常規(guī) 大鼠飼料及水 喂養(yǎng)。 4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模及分組 待大鼠適應(yīng)環(huán)境一周后給予干預(yù)因素，造模選用 1%乙二醇（體積分?jǐn)?shù)）自由飲水 +2%氯化銨 2胃。 制劑為 6,選用尾部靜脈注射的方式進(jìn)行給藥。自然喂養(yǎng) 1 周后將 鼠隨機(jī)分為 4 組每組 10 只。 A 組：空白對(duì)照組，喂養(yǎng)大鼠食料及水 ； B 組：成石對(duì)照組， 1%乙二醇自由飲水 +2%氯化銨 2 /只灌胃； C 組（低劑量 制劑干預(yù)組）：結(jié)石造模（ 1%乙二醇自由 飲水 +2%氯化銨 2 /只灌胃） +0 /天尾部靜脈注射；D 組（高劑量 制劑干預(yù)組）：（ 1%乙二醇自由 飲水 +2%氯化銨 2 /只灌胃） +0 /天尾部靜脈注射。 上述四組大鼠給予干預(yù)四周后處死。 5 尿液樣本收集及指標(biāo)分析 處死大鼠前 1 天收集 24h 尿液，用于測(cè)定 24h 尿量、尿 、尿草酸、尿鈣，磷、鎂。生化自動(dòng)分析儀測(cè)定尿鈣、磷、鎂、比色法測(cè)定尿草酸。 6 尿草酸測(cè)定原理及步驟 原理 比色法：尿草酸與硫酸鈣 和 76%乙醇溶液 于 ， 可 形成草酸鈣 的 沉淀， 然后在沸水中用鋅粒 以新生態(tài)氫還原 成乙醇酸， 后者 與變色酸在熱濃硫酸條件下作用 下 顯色。 試劑 （ 1）變色酸 在使 用前配制成 2%的水溶液。 （ 2）溴麝香草酚藍(lán)指示劑 精確稱 取溴麝香草酚藍(lán) 于 10醇中， 緩慢 加水 至 40斷振搖， 待溶液 澄清后使用。 （ 3）無(wú)砷鋅粒 約 44約 200在使 用前去除 其表面的 氧化層方法為 滴加適量硝酸 （ 10） ， 緩慢 搖 晃 ， 待其 產(chǎn)生 大量 棕紅色 的 氣體（ ， 即 刻用自來(lái)水沖洗， 瀝凈 多余的硝酸， 然后用 蒸餾水 沖洗干 凈 待用 。 （ 4） 草酸標(biāo)準(zhǔn) 貯存液的配制 用 一水草酸鉀 配制，具 體方法為： 稱取一水草酸鉀 （含 1 分子結(jié)晶水） 于水至 蒸餾水中并稀釋至 100其 含無(wú)水草酸鉀 （ 5mg/，置于 4 C 冰箱保存。 （ 5） 草酸 標(biāo)準(zhǔn) 應(yīng)用液 取草酸標(biāo)準(zhǔn)貯存液 1后用蒸餾水 精確稀釋 100倍作為應(yīng)用液，置冰 箱內(nèi)保存；應(yīng)用液欠穩(wěn)定，較長(zhǎng)時(shí)間 放置后 測(cè)得 的 光密度 會(huì)有所下降， 因此，時(shí)間較長(zhǎng)后 應(yīng)重新配制。 步驟 ： 精密吸 取酸化尿 10管中，空白管取蒸餾水 準(zhǔn)管取 草酸 標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液 蒸餾水 至 別加 入 溴麝香草酚藍(lán)指示劑 1 滴 ，用 氫氧化鈉或 鹽酸（ 酸、堿）調(diào)節(jié) 至 色為 藍(lán)綠色 ） ， 其中加入的 酸堿總量不得 超過(guò) 飽和硫酸鈣 1勻 ，再加 95%乙醇至 10口，于室溫放置 3h 以上 或 4 C 冰箱 過(guò)夜。 然后 2500r/心 10 分鐘， 小心 傾去上清液，將試管 倒置于濾紙上 數(shù)分鐘 吸凈殘液， 在沉淀物中 加入 1 入一粒鋅粒，于沸水 浴中約 30 分鐘 ， 蒸 發(fā)至剩余液體少于 出待冷，用玻匙將鋅粒移至管 口， 加 入 %變色酸洗凈 鋅粒 并盡量瀝干棄去， 加入 熱 30 分鐘。冷 卻后 ，加入 5 硫酸至 10勻，澄清后比色， 1色杯， 波長(zhǎng) 570長(zhǎng)測(cè)吸光度 。 計(jì)算 ： 尿草酸 (樣品光密度 /標(biāo)準(zhǔn)光密度 鼠血標(biāo)本的留取及相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定 10%水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射，待大鼠肌肉松弛后，腹部正中切口切開腹腔，找到下腔靜脈， 5針抽取血液約 4入無(wú)抗凝管中，依次抽取所有大鼠。 3000r/心 10抽取上清血清，全自動(dòng)生化分析儀 測(cè)定尿素氮、肌酐、鈣、磷、鎂。放免法測(cè)定甲狀旁腺素（ 8 腎臟標(biāo)本的收集及病理切片和免疫組化 完整切取雙腎用生理鹽水沖洗干凈后放入 20%福爾馬林溶液中固定，固定 3天后石蠟包埋常規(guī)做 色病理切片及免疫組化切片（ 4 m） ，免疫組化采用兩步法。光學(xué)顯微鏡下觀察蛋白的表達(dá)情況及草酸鈣結(jié)晶的形成情況。 腎結(jié)晶評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為： ( )：高倍視野中未見草酸鈣結(jié)晶； ( )：視野中少部分管腔管腔內(nèi)有結(jié)晶，有結(jié)晶的管腔占一半以下； ( )：高倍視野中一半左右的管腔內(nèi)有結(jié)晶。 ( )：幾乎每個(gè)管腔內(nèi)均有結(jié)晶，滿視野的結(jié)晶 。 9 腎組織 鈣敏感受體 免疫組織化學(xué) 試劑 (1)克隆抗體（ ; (2)二步法免疫組化檢測(cè)試劑 (中杉金橋生物技術(shù)有限公司 ); (3) 色試劑盒 (中杉金橋生物技術(shù)有限公司 ,批號(hào)： (4) 離子 防脫載玻片 (中杉金橋 ); (5) 和 ; (6) 二甲苯 ; (7) 作液 ; (8) 蘇木素 ; 試驗(yàn)方法 : (1) 取材：大鼠 一側(cè)腎臟標(biāo)本放入 20%甲醛溶液中固定 3 天 。 (2) 固定： 20 福爾馬林固定 ； (3) 切片：厚度 4 操作方法 (1) 石蠟切片脫蠟后依次至二甲苯 (35 分鐘 )， 100酒精 (35 分鐘 )70酒精 (12 分鐘 )， 50酒精 (11 分鐘 )，蒸餾水中水化 (11 分鐘 )， (1。 (2) 熱修復(fù)抗原： 將準(zhǔn)備好的 枸櫞酸鹽 加入容量瓶?jī)?nèi)并加入蒸餾水2000搖擺容量瓶使枸櫞酸鹽徹底溶解，倒入高壓鍋內(nèi) 加熱至沸騰后， 放入切片至溶液沸騰 1鐘，取下高壓鍋并冷卻至 30 攝氏度， 后 放入 (洗滌 10 分鐘。 (3) 3% 一滴 在切片上 ，在 室溫 下 5右， 阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶， 洗滌 2。 (4) 吸水紙 切片上 的 ，。每張切片滴加第一抗體（ 140:1）， 4冰箱過(guò)夜。 (5) 洗， 2 分鐘 3 次 ，滴加二抗， 37孵育 30 分鐘。 (6) 洗 ， 2 分鐘 3 次 ， 吸 去 ，每張切片滴 加現(xiàn)制備的 鐘。 (7) 蘇木素輕度復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。 對(duì)照組 的 設(shè)定 :陰性對(duì)照用 代替一抗。 陽(yáng)性結(jié)果 的 判定 :用 學(xué)顯微鏡（ 200）觀察各組免疫組化切片 ：“ +”表示腎小管上皮細(xì)胞胞 膜輕度染色 (淡黃色 )；“ +”表示腎小管胞膜中度染色 (黃色 )；“ +”表示腎小管胞膜明顯染 色 (深棕黃色 )。 10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 血尿檢驗(yàn)結(jié)果用 均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差 ( )表示，每組間的差別用單因素方差（ 驗(yàn)中的 重比較法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)； 達(dá)的情況和 結(jié)晶 形成情況 組間比較用秩和檢驗(yàn) 驗(yàn) 。計(jì)軟件進(jìn)行分析。 表 1。 表 1 各組大鼠模型尿標(biāo)本生化指標(biāo)的結(jié)果 ( ) 組別 例數(shù) 尿量 4h 4h 鎂 4h 磷 草酸 4h A 10 9 C 8 D 8 *僅擴(kuò)張的腎小管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)略有增強(qiáng)， 顏色呈黑棕黃色，我們 考慮 可能 是 擴(kuò)張的腎小管內(nèi)的 結(jié)晶誘導(dǎo)達(dá)所致 。 評(píng)分多為 。 C 組：該組與成石對(duì)照組相比 表達(dá)減弱（ 表 4 各組大鼠腎草酸鈣結(jié)晶沉積情況 組別 數(shù)量 草酸鈣結(jié)晶 成石率 + + + _ A * 10 0 0 0 10 0% B#* 9 2 2 3 2 C# 8 5 3 0 0 100% D# 8 6 2 0 0 100% 注： #與 低劑量抑制組 高劑量抑制組。 在甲狀旁腺中 ， 與結(jié)石對(duì)照組相比抑制劑干預(yù)組（尤其是高劑量干預(yù)組） 明抑制劑在甲狀旁腺中發(fā)揮了作用，抑制了 活性，從而促進(jìn)了 分泌。抑制劑干預(yù)組較成 石對(duì)照組相比尿 加，尿草酸增加，血鈣、血 高。腎臟內(nèi)草酸鈣結(jié)晶生成的量： D 組 、 C 組 B 組 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們考慮 鼠草酸鈣結(jié)晶的形成，并導(dǎo)致血尿中生化指標(biāo)的明顯變化，從而損害腎臟功能。關(guān)于 性的降低導(dǎo)致草酸鈣結(jié)石形成增加的機(jī)制結(jié)合本實(shí)驗(yàn)我們認(rèn)為主要有這幾個(gè)方面，一方面在甲狀旁腺中我們知道 當(dāng)胞外 促進(jìn)劑 作用于甲狀旁腺的細(xì)胞的 活 過(guò)特定的 G 蛋白（ 活磷脂酶 C。一旦磷酸化，該酶就表現(xiàn)出酶的活性， 以特異性的水解膜成分而生成 成后仍留在質(zhì)膜上， 膜上擴(kuò)散到胞漿內(nèi)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和肌織網(wǎng)上的受體結(jié)合， 受體其實(shí)就是鈣離子通道，從而促進(jìn)這些鈣庫(kù)里鈣離子的迅速釋放，使胞漿內(nèi)的鈣離子濃度升高，抑制細(xì)胞釋放 時(shí)還促進(jìn)它在胞內(nèi)的降解 30，所以 活后，血 平迅速下降，溶骨作用下降 ，血鈣下降，尿鈣也隨之下降，當(dāng)我們加入 抑制劑 ， G 蛋白介導(dǎo)的 1， 4， 5 三磷酸肌醇 ()和二乙酰甘油 (成減少，胞漿內(nèi)鈣下降， 泌增加， 血 高后可以加強(qiáng)溶骨作用，導(dǎo)致高血鈣，尿鈣排泄增加從而和草酸結(jié)合促進(jìn)草酸鈣結(jié)石的形成。但是我們知道， 在結(jié)石患者的尿液中，草酸鈣濃度要稍高于非結(jié)石患者，但是成石物質(zhì)濃度在尿液中是隨時(shí)可變的。很多正常人尿液中也常出現(xiàn)尿液草酸鈣過(guò)飽和的現(xiàn)象。因此，草酸鈣過(guò)飽和只是結(jié)石形成的一個(gè)充分條件而非必要條件。因此我們考慮 腎臟 中 激活誘導(dǎo)尿 液 酸化和減少水的重吸收，能在一定程度上增加尿 子 排泄而并不增加腎結(jié)石形成的風(fēng)險(xiǎn) 。 在集合管中 存在可以減少水的重吸收，稀釋鈣磷鹽，這個(gè)效應(yīng)出現(xiàn)作為一個(gè)整合系統(tǒng)阻止鈣磷鹽在腎小管的沉積，從而抑制了鈣磷鹽的結(jié)石的形成。所以在本實(shí)驗(yàn)中當(dāng) 性降低時(shí) 腎小管內(nèi)尿濃縮，并且酸化溶結(jié)晶作用減弱， 促進(jìn)了結(jié)石的形成 ;之前有報(bào)道表明 性高的人可以抑制成石物質(zhì)對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的粘附，并且我們知道 機(jī)體內(nèi)是廣泛表達(dá)的，它對(duì)細(xì)胞的功能 和內(nèi)環(huán)境的維持有很重要的作用，當(dāng)它缺失或者是表達(dá)下降時(shí)可能會(huì)使細(xì)胞的功能形態(tài)發(fā)生變化，一旦細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生變化，腎小管上皮不再光滑，抑石的屏障受損，從而導(dǎo)致結(jié)石對(duì)腎小管上皮的粘附導(dǎo)致結(jié)石的形成。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)，腎小管內(nèi)的 性明顯下降， 性降低導(dǎo)致草酸鈣鈣結(jié)晶對(duì)功能受損的上皮細(xì)胞的粘附增加，為過(guò)飽和的成石物質(zhì)提供了很好的成核位點(diǎn)，進(jìn)一步激化了一系列的成石步驟，最終促進(jìn)了本實(shí)驗(yàn)中的草酸鈣結(jié)石的形成；在腎臟的髓質(zhì)性降低使鈣磷鹽沉淀從而導(dǎo)致蘭德爾斑的形成。綜合考慮我們認(rèn)為 多個(gè)方面 促進(jìn)草酸鈣結(jié)石的形成， 能像很多腎臟內(nèi)的大分子一樣可以抑石的作用。然而 草酸鈣結(jié)石的形成機(jī)理是復(fù)雜的，其明確的作用機(jī)制有待我們進(jìn)一步細(xì)致的研究。 第五章 結(jié)論 1. 大鼠腎臟內(nèi)草酸鈣結(jié)晶的形成可以誘導(dǎo) 表達(dá)， 能像其它的大分子抑石物質(zhì)一樣在結(jié)晶增多時(shí)可以相應(yīng)的表達(dá)而發(fā)揮抑石作用 。 2. 性降低時(shí)可以促使腎臟內(nèi)結(jié)晶的增加，可見 有抑石的作用 。 參考文 獻(xiàn) 1. 陳志強(qiáng) , 特發(fā)性草酸鈣結(jié)石研究現(xiàn)狀 . 臨床泌尿外科雜志 , 2005. 20(5). 2. 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