畢 業(yè) 論 文 （本科生） 中文標題 熒光光譜法測定硫酸氫氯吡格雷含量 英文標題 of by 生姓名 李 娟 指導(dǎo)教師 王子寧 學(xué) 院 藥學(xué)院 專 業(yè) 藥 學(xué) 年 級 2008 級 蘭州大學(xué)教務(wù)處 李娟：氯吡格雷的含量測定 誠信責(zé)任書 本人鄭重聲明：本人所呈交的畢業(yè)論文（設(shè)計），是在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨立進行研究所取得的成果。畢業(yè)論文（設(shè)計） 中凡引用他人已經(jīng)發(fā)表或未發(fā)表的成果、數(shù)據(jù)、觀點等，均已明確注明出處。 除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或在網(wǎng)上發(fā)表的論文。 特此聲明。 論文作者簽名： 日 期： 李娟：氯吡格雷的含量測定 I 目 錄 中文摘要 . 1 . 2 第一節(jié) 前言 . 3 一 硫酸氫氯吡格雷 . 3 床應(yīng)用 . 3 合用藥 . 4 景展望 . 4 二 熒光光譜法 . 4 光的產(chǎn)生 . 4 響熒光強度的外部因素 . 4 量分析方法 . 5 光分析新技術(shù) . 6 三 熒光猝滅法測定藥物含量 . 7 第二節(jié) 實驗部分 . 8 1 儀器與試劑 . 8 2 實驗方法 . 8 同濃度硫酸氯吡格雷標準品溶液與 用的熒光猝滅試驗 . 8 酸氫氯吡格雷對 光猝滅作用的機理研究 . 8 同溫度下硫酸氫氯吡格雷標準品溶液與 用的熒光猝滅 . 8 酸氫氯吡格雷對 光猝滅方式 . 8 酸氫氯吡格雷與 表觀結(jié)合常數(shù) 結(jié)合位點數(shù) n . 9 酸氫氯吡格雷與 合反應(yīng)的作用力 . 9 光猝滅法測定硫酸氫氯吡格雷片劑的含量 . 9 光猝滅法測定硫酸氫氯吡格雷的標準曲線繪制 . 9 酸 氫氯吡格雷片及空白片與 用熒光光譜圖 . 9 密度試驗 . 9 樣回收率試驗 . 9 酸氫氯 吡格雷片中主藥的含量測定 . 10 3 結(jié)果與討論 . 10 李娟：氯吡格雷的含量測定 同濃度硫酸氯吡格雷標準品溶液與 用的熒光猝滅光譜 . 10 酸氫氯吡格雷對 光猝滅作用的機理研究 . 10 同溫度下硫酸氫氯吡格雷標準品溶液對 熒光猝滅方式 . 10 酸氫氯吡格雷與 表觀結(jié)合常數(shù) 結(jié)合位點數(shù) n 的測定 . 12 酸氫氯吡格雷與 合反應(yīng)的作用力 . 12 光猝滅法測定硫酸氫氯吡格雷片劑的含量 . 13 光猝滅法測定硫酸氫氯吡格雷的標準曲線繪制 . 13 酸氫氯吡格雷片及空白片與 用熒光光譜圖測定 . 13 密度試驗 . 14 加樣回收率試 驗 . 14 酸氫氯吡格雷片中主藥的含量測定 . 15 4 結(jié)論 . 16 參考文獻 . 17 致謝 . 19 李娟：氯吡格雷的含量測定 1 熒光光譜法測定硫酸氫氯吡格雷含量 作者：李娟 指導(dǎo)老師：王子寧 （ 蘭州大學(xué) 藥學(xué)院 甘肅 省 蘭州 市 730000） 中文 摘要 : 目的 采用熒光光譜技術(shù)研究硫酸氫氯吡格雷對牛血清白蛋白 (的熒光猝滅作用，建立硫酸氫氯吡格雷片劑含量測定的熒光分析方法。方法 考察不同溫度下硫酸氫氯吡格雷對 熒光 猝滅作用，利用 程及雙倒數(shù)方程處理實驗數(shù)據(jù)，探討硫酸氫氯吡格雷與 作用機理。采用間接熒光猝滅法測定硫酸氫氯吡格雷片中主藥的含量。 結(jié)論 硫酸氫氯吡格雷對 熒光猝滅過程以靜態(tài)猝滅為主 , 兩者主要靠疏水作用力相結(jié)合，結(jié)合位點數(shù)為 1。硫酸氫氯吡格雷的濃度 在 0的范圍內(nèi) 與 熒光強度呈良好的 線性關(guān)系 ， 相關(guān)系數(shù) 關(guān)鍵詞 ：硫酸氫氯吡格雷，牛血清白蛋白， 熒光光譜 李娟：氯吡格雷的含量測定 2 of by i of 30000.) To by SA to of SA to SA is is on is a SA in a 0-5 0(r=( . 娟：氯吡格雷的含量測定 3 第一節(jié) 前言 藥物對于人身健康有十分重要的意義。藥物分析則是整個藥學(xué)領(lǐng)域中重要組成部分。藥品質(zhì)量的優(yōu)劣，直接關(guān)系到人身體健康，乃至生命安全。因此，在藥品的研制、生產(chǎn)和臨床使用的過程中都應(yīng)該執(zhí)行嚴格、科學(xué)的管理制度，并需采用各種有效的分析方法，進行嚴格的藥品分析檢測，從而對藥品的各個環(huán)節(jié)進行全面的監(jiān)控，以確保藥品的質(zhì)量。 藥物分析方法主要有 光度法、質(zhì)譜法、 高效液相色譜法等。光度法 的優(yōu)點是 準確度高，精密度較好， 且設(shè)備簡單 ，成為常規(guī)的藥物分析方法。其中，熒光分析法具有高選擇性、高靈敏度、取藥量少、操作方法簡便等優(yōu)點，使其逐漸成為測定和鑒定藥物的重要手段，在藥物分析領(lǐng)域中會有良好的發(fā)展前途。 一 硫酸氫氯吡格雷 硫酸氫氯吡格雷適用于心肌梗塞、中風(fēng)等心腦血管疾病，國產(chǎn)與進口產(chǎn)品療 效相似 1。硫酸氫氯吡格雷屬于噻吩吡啶類衍生物，是血小板聚集抑制劑，能選擇性地抑制 后抑制激活 b/ 而抑制血小板聚集，也可以抑制非 不影響磷酸二酯酶的活性。通過不可逆改變血小板血小板壽命受到影響。 床應(yīng)用 肌梗死 經(jīng)羅心平等 2的研究，證實負荷劑量的氯吡格雷在直接支架術(shù)的急性心肌梗死的治療中有良好的效果，不良反應(yīng)的發(fā)生少于噻氯匹定。 心病 柳要偉等 3考察冠心病患者分別應(yīng)用氯吡格雷與阿司匹林的療效及安全性。實驗表明，應(yīng)用氯吡格雷或阿司匹林均能起到抗血小板聚集的效果，且氯吡格雷效果優(yōu)于阿司匹林。 風(fēng) 楊卉等 4研究了氯吡格雷對進展型缺血性腦卒中的療效，實驗結(jié)果表明，氯吡格雷組的全血黏度及血漿黏度的下降程度大于阿司匹林組，無嚴重不良反應(yīng)，此類患者使用氯吡格雷有效且安全。 周動脈性疾病 沈宗泉等 5考察了氯吡格雷對頸動脈斑塊的影響，結(jié)果病人頸動脈粥樣硬化斑塊面積縮小或消失，動脈管腔直徑增加、內(nèi) 中膜厚度變薄，治療前后有顯著性差異，與對照組相比，有顯著性差異。氯吡格雷對頸動脈斑塊有明顯逆轉(zhuǎn)用。 李娟：氯吡格雷的含量測定 4 合用藥 王歡等 6將 88例不穩(wěn)定型心絞痛患者隨機分為治療組 (47例 )和對照組 (41例 )，對照組使用阿司匹林、硝酸酯類、 離子拮抗劑及他汀類藥物治療；治療組在對照組基礎(chǔ)上加用氯吡格雷。 3個月后，治療組總有效率為 對照組總有效率 這說明氯吡格雷對不穩(wěn)定型心絞痛的治療安全且有效。 王塑華等 7用中西醫(yī)結(jié)合療法治療急性腦梗死。實驗結(jié)果為：治療組（氯吡格雷口服，疏血通靜 注）總有效率為 對照組（僅氯吡格雷口服）總有效率為 兩組療效有顯著性差異。治療組的全血黏度、血漿黏度、纖維蛋白原指數(shù)均下降明顯，無特殊不良反應(yīng)。氯吡格雷與疏血通聯(lián)合治療能夠提高臨床療效，改善血液流變學(xué)，降低血液黏稠度，優(yōu)于純西藥治療。 此外 ， 氯吡格雷還可與曲美他嗪 8及阿托伐他汀聯(lián)合，用于治療不穩(wěn)定型心絞痛；氯吡格雷與低分子肝素 9聯(lián)合，可治療短暫性腦缺血發(fā)作等。 景展望 硫酸氫氯吡格雷是一種能高效的抑制血小板聚集的藥物，與其他抗血小板藥物相比，其優(yōu)點是副作用小、療效強、費 用低，在臨床上有獨特的優(yōu)勢 ，且有 廣闊市場和臨床應(yīng)用前景。根據(jù)硫酸氫吡氯格雷的晶型等物理性質(zhì)，已經(jīng)開發(fā)成膠囊劑，在生產(chǎn)工藝上或許比片劑會更具優(yōu)勢。 二 熒光光譜法 10 物質(zhì)吸收光子能量而被激發(fā)，然后從激發(fā)態(tài)的最低振動能級回到基態(tài)時所發(fā)射出的光稱為熒光。根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線位置及其強度鑒定物質(zhì)并測定物質(zhì)含量的方法稱為熒光分析法。 光的產(chǎn)生 處于激發(fā)態(tài)的分子不穩(wěn)定，可能要通過輻射躍遷和非輻射躍遷等分子內(nèi)的去活化過程釋放多余的能量而返回基態(tài)。發(fā)射熒光是其中的一條途徑，其他的途徑還有振動弛豫、內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換 、外部能量轉(zhuǎn)換、體系間跨越和磷光發(fā)射。熒光是分子外層價電子從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級，以輻射形式發(fā)射光回到基態(tài)的任一振動能級，此時分子發(fā)射的光即為熒光。 響熒光強度的外部因素 度 溫度對于溶液的熒光強度有著顯著的影響。在一般情況下，隨著溫度的升高，熒光物李娟：氯吡格雷的含量測定 5 質(zhì)溶液的熒光強度和熒光效率將降低。這是因為，當溫度升高時，分子運動速度加快，分子間碰撞概率增加，使無輻射躍遷增加，從而降低了熒光效率。 劑 同一物質(zhì)在不同溶劑中，其熒光光譜的位置和強度都有差別。一般情況下，熒 光波長隨著溶劑極性的增加而長移，熒光強度也有增加。這是因為在極性溶劑中， 躍遷所需要的能量差小，而且躍遷概率增加，使紫外吸收和熒光波長均向長移，強度也增強。溶劑粘度減小時，可以增加分子間碰撞機會，使無輻射躍遷增加而熒光減弱。故熒光強度隨溶劑黏度的減小而減弱。由于溫度對溶劑的粘度有影響，一般是溫度升高，溶劑粘度變小，因此溫度上升熒光強度下降。 當熒光物質(zhì)本身是弱酸或弱堿時，該溶液的 主要是因為弱酸弱堿和它們的離子結(jié)構(gòu)有所不同，在不同的酸度中 ，分子和離子間的平衡改變，因此熒光強度也有差異。每一種熒光物質(zhì)都有其適宜的發(fā)射熒光的存在形式，也就有相應(yīng)的 保持熒光物質(zhì)和溶劑之間的離解平衡。 光熄滅的影響 熒光熄滅又稱為熒光猝滅，是指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子的相互作用，引起熒光強度降低或熒光強度與濃度偏離線性關(guān)系的現(xiàn)象。引起熒光熄滅的物質(zhì)稱為熒光熄滅劑。常見的熄滅劑有鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物。 熒光熄滅在熒光分析中會產(chǎn)生測定誤差，但是如果一種熒光物質(zhì)在加入某種熄滅劑后，熒光強度 的減小和熒光熄滅劑的濃度呈線性關(guān)系，則可以利用這一性質(zhì)測定熒光熄滅劑的含量。這種方法稱為熒光熄滅法。當熒光物質(zhì)的濃度超過 1g/于熒光物質(zhì)分子間碰撞的概率增加，產(chǎn)生熒光自熄滅現(xiàn)象。溶液濃度越高，這種現(xiàn)象越嚴重。 射光的干擾 當一束平行光照射在液體樣品上大部分光線透過溶液，小部分光線由于光子和物質(zhì)分子相碰撞，使光子的運動方向發(fā)生改變而向不同角度散射，這種光稱為散射光。散射光對熒光測定有干擾。尤其是波長比入射波長長的拉曼光，因其波長與熒光波長接近，對熒光測定的干擾更大，必須采取措施消除。 量分析方法 光強度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系 李娟：氯吡格雷的含量測定 6 溶液的熒光強度與該溶液吸收光能的程度以及溶液中熒光物質(zhì)的熒光效率有關(guān)。熒光分析法定量的依據(jù)是熒光強度與濃度的線性關(guān)系，所測定的是熒光強度 F。只要增加檢測器的靈敏度，使極微弱的的熒光也能檢測到，就可以測定很稀的溶液濃度。因此，熒光分析法的靈敏度很高。 量分析法 (1) 標準曲線法 熒光 光譜 分析一般采用 的是 標準曲線法，即標準物質(zhì)和試樣 經(jīng)過相同的處理之后，配一系列標準溶液，測定熒光強度，以 標準溶液的濃度為橫坐標， 熒光 強度為縱坐標繪制標準曲線。然后在同樣 的 條件下 ， 測定試樣溶液的熒光強度， 再 從標準曲線 中 求出試樣中熒光物質(zhì)的含量。 (2) 比例法 如果熒光 物質(zhì) 的標準曲線 經(jīng) 原點， 那么可以在 其線性范圍內(nèi)，用比例法 測定。取已知量 對照品，配制 濃度在線性范圍之間的 標準溶液，測定熒光強度 ， 然后在 相同 條件下測定試樣溶液的熒光強度。由標準溶液的濃度和兩個溶液的熒光強度比， 可求 試樣中熒光物質(zhì)的含量。 光分析新技術(shù) 隨著儀器分析的日趨發(fā)展，分子熒光分析法的新技術(shù)發(fā)展也很迅速。熒光儀器使用了單色性極好、強度更大的激光作為光源，提高了 熒光分析法的靈敏度和選擇性。 間分辨熒光分析 由于分子熒光的壽命不同，可在激發(fā)和檢測之間延緩一段時間，使具有不同熒光壽命的物質(zhì)達到分別檢測的目的。這就是時間分辨熒光分析。時間分辨熒光分析采用脈沖激光作為光源。該法在測定混合物中某一組分時的選擇性比用化學(xué)法處理樣品時更好，而且省去前處理的麻煩。目前已將時間分辨熒光法應(yīng)用于免疫分析，形成時間分辨熒光免疫分析法。 步熒光分析 同步熒光分析是在熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光光譜中選擇一適宜的波長差值，同時掃描熒光發(fā)射波長和激發(fā)波長，得到 同步熒光光譜。熒光物質(zhì)濃度與同步熒光峰峰高呈線性關(guān)系，故可用于定量分析。 束增敏熒光分析 極性小而難溶于水的熒光物質(zhì)在膠束溶液中溶解度顯著增加。膠束溶液對熒光物質(zhì)的李娟：氯吡格雷的含量測定 7 增溶作用是因非極性的有機物與膠束的非極性尾部有親和作用，使熒光分子定位于膠束的親酯性內(nèi)核中，這也對熒光分子起了一定的保護作用，減弱了熒光質(zhì)點之間的碰撞，減少了分子的無輻射躍遷，增加了熒光效率，從而增加了熒光強度。膠束溶液對熒光物質(zhì)有增溶、增敏和增敏作用可大大提高熒光分析法的靈敏度和選擇性。 光分析法 常用 方法是 固體磷光法和膠束溶液室溫磷光法。固體磷光法是在薄層色譜板上揮發(fā)溶劑 后進行斑點磷光分析；膠束室溫磷光法是在樣品溶液中加入表面活性劑 形成膠束，可增加其剛性，減少因碰撞引起的能量損失。常用的表面活性劑有十二烷基硫酸鹽、環(huán)糊精等。 學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光分析 化學(xué)發(fā)光是在沒有任何光、熱或電場等激發(fā)源，而是以化學(xué)反應(yīng)代替光激發(fā)物質(zhì)產(chǎn)生的光輻射；生物發(fā)光是指產(chǎn)生于生物體系中的化學(xué)發(fā)光，螢火蟲及其他真菌、原生動物發(fā)射的光屬于生物發(fā)光。這兩種發(fā)光分析方法都屬于分子發(fā)射光譜，發(fā)光強度和單位時間與被測反應(yīng)物的濃度變 化相關(guān)，可用于定量分析。發(fā)光分析法的儀器優(yōu)點是由反應(yīng)室、光檢測器及信號輸出裝置組成，靈敏度高，儀器設(shè)備簡單，線性范圍寬，分析速度快。發(fā)光分析法在痕量分析、生物醫(yī)學(xué)分析及環(huán)境檢測中有較多的應(yīng)用。 三 熒光猝滅法測定藥物含量 許多藥物自身的熒光強度與其濃度在一定范圍內(nèi)能夠呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系 , 因此可以根據(jù)工作曲線直接進行熒光分析；也有許多藥物的熒光強度與其濃度的線性關(guān)系較差 , 但可用化學(xué)法改變藥物分子的部分結(jié)構(gòu) , 使體系的熒光強度與其濃度之間的線性關(guān)系滿足測定要求 , 同樣可以獲得滿意的分析結(jié)果 ,這種間接熒光分析法在藥物熒光分析中占有重要地位 11。 血清白蛋白是人及動物的血清中含量最豐富的蛋白質(zhì)，各種藥物進入人體時首先與血清白蛋白結(jié)合，再通過血漿存儲和運輸，最終到達受體部位而產(chǎn)生藥理作用 12研究藥物分子與蛋白質(zhì)間的相互作用，對了解藥物作用機制有非常重要的意義 14。熒光光譜法是目前研究生物大分子以及各種小分子、離子間的相互作用最常用的手段之一。 硫酸氫氯吡格雷，分子式 2學(xué)名 2 (2氯苯基 ) 2 (6， 7二氫噻吩并 3， 2 c吡啶 5- 基 )乙酸甲酯硫酸氫鹽，是一種噻吩并吡啶類化合物，白色或類白色粉末，血小板抑制劑，主要用作治療心腦血管疾病的藥物。目前測定硫酸氫氯吡格雷含量的常用方法有 高效液相色譜法、紫外分光光度法等 15。本實驗擬應(yīng)用一種新的測量硫酸氫氯吡格雷含量的方法，即間接熒光分析法，以使其含量測定快速準確。 李娟：氯吡格雷的含量測定 8 第二節(jié) 實驗部分 1 儀器與試劑 儀器 光分光光度計； 子分析天平； 酸度計。 試劑 牛血清白蛋白（ 930，分子量 65000）；硫酸氫氯吡格雷原料藥 （蘭州大學(xué)藥學(xué)院微生物與生物化學(xué)研究所提供，含量 98%）； 硫酸氫氯吡格雷對照品（ 中國食品藥品檢定研究院，含量 ； 硫酸氫氯比格雷片劑（蘭州大學(xué)藥學(xué)院微生物與生物化學(xué)研究所提供，規(guī)格 75號： 20100501） 牛血清白蛋白儲備溶液：用萬分之一電子分析天平精密稱定 血清白蛋白，用蒸餾水定容至 50溶液濃度為 0）； 硫酸氫氯吡咯雷標準品溶液：用萬分之一電子分析天平精密稱取硫酸氫標準品 適量水超聲溶解，定容至 25 溶液濃度為 以上溶液均需進行振蕩，充分搖勻并避光保存。實驗中的 ，用以維持離子強度。實驗所用試劑均為分析純，水為二次蒸餾水，經(jīng)檢測無熒光雜質(zhì)。 2 實驗方法 同濃度硫酸氯吡格雷標準品溶液與 用的熒光猝滅試驗 取八個 10量瓶，分別依次加入 0 的 準溶液 液（ ） 2上述溶液中分別加入硫酸氫氯吡咯雷標準品溶液 蒸餾水定容至 10勻后，于 25水浴鍋中恒溫 10定激發(fā)波長為 285描熒光發(fā)射光譜。同時測定各溶液熒光強度（ 8540 酸氫氯吡格雷對 光猝滅作用的機理研究 同溫度下硫酸氫氯吡格雷標準品溶液與 用的熒光猝滅 同 下方法，制備含有等濃度 系列硫酸氫氯吡格雷標準溶液，用蒸餾水定容至 10勻后，于 35 水浴鍋中恒溫 10定 85 描熒光發(fā)射光譜。同時測定各溶液熒光強度（ 8540 酸氫氯吡格雷對 光猝滅方式 光猝滅作用有動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種方式。根據(jù)文獻報道方法 16，分別測定未加入硫酸氫氯吡格雷的 光值 熒光值 F，以 值和相應(yīng)的硫酸氫氯吡格雷標準溶液的濃度 Q作圖，求測不同濃度硫酸氯李娟：氯吡格雷的含量測定 9 吡格雷對 光猝滅作用的 態(tài)猝滅方程及猝滅常數(shù)，以論證猝滅機理。 酸氫氯吡格雷與 表觀結(jié)合常數(shù) 結(jié)合位點數(shù) n 藥物與蛋白質(zhì)相互作用時，可應(yīng)用以下公式計算藥物與蛋白質(zhì)的表觀結(jié)合常數(shù) 結(jié)合位點數(shù) n:17 ( F) /F = n . 分別將在 25 和 35 條件下測得的不含有硫酸氫氯吡格雷的 光值 列加入硫酸氫氯吡格雷藥品后 熒光值 F，以及硫酸氫氯吡格雷標準溶液的濃度值 Q代入該方程，可以求測硫酸氫氯吡格雷藥品與 表觀結(jié)合常數(shù) n。 酸氫氯吡格雷與 合反應(yīng)的作用力 藥物與蛋 白質(zhì)之間的作用力主要包括疏水相互作用、范德華力、氫鍵等?？梢酝ㄟ^計算不同溫度下，硫酸氫氯吡格雷與大分子 用的焓變 變 自由能變斷藥物與 相互作用力。 光猝滅法測定硫酸氫氯吡格雷片劑的含量 光猝滅法測定硫酸氫氯吡格雷的標準曲線繪制 含有等濃度 硫酸氫氯吡格雷系列標準溶液的配制同 下，以系列硫酸氫氯吡格雷溶液的濃度為橫坐標，相應(yīng)的 光強度（ 8540縱坐標，繪制 25 條件下硫酸氫氯吡格雷含量測定的標準工 作曲線，求出線性方程。 酸氫氯吡格雷片及空白片與 用熒光光譜圖 取硫酸氫氯吡格雷空白片 1 片，加水定容至 25瓶中，超聲 10 分鐘， 膜過濾，棄初濾液，保留續(xù)濾液，取該濾液 10量瓶中，加入 備液 液 2蒸餾水定容至 10 285激發(fā)波長，掃描 光發(fā)射光譜。同時，與上述方法相同，配制硫酸氫氯吡格雷藥片的供試品溶液，掃描熒光發(fā)射光譜。 密度試驗 按 下方法，制備硫酸氫氯吡格雷藥片的供試品溶液 ，測定熒光強度（ 8540連續(xù)測定 6 次，考察測量結(jié)果的精密度。 樣回收率試驗 按 下方法，制備硫酸氯比格雷片劑浸出濾液，準確量取 9 份該濾液各 于 10量瓶中。準確量取硫酸氫氯吡格雷標準品溶液 于 25量瓶中并定容至刻度，取該液 三份分別置于上述 10量瓶中。依次加入備液 液 蒸餾水定容至刻度，搖勻，測定相對熒光強度，李娟：氯吡格雷的含量測定 10 計算加樣回收率。 酸氫氯吡格雷片中主藥的含量測定 取同一批號硫酸氫氯吡格雷片劑，制備供試品溶液，測定熒光強度 F 值（ 8540代入標準曲線方程中，計算片劑含量。 3 結(jié)果與討論 同濃度硫酸氯吡格雷標準品溶液與 用的熒光猝滅光譜 由圖 1 可見，隨著硫酸氫氯比格雷濃度的提高， 340長處的熒光強度逐漸減弱，說明硫酸氫氯吡格雷可以與 互作用，進而導(dǎo)致 熒光猝滅。 熒光猝滅作用隨硫酸氫氯吡格雷的濃度增高而相應(yīng)增強。 圖 1 不同濃度硫酸氯吡格雷標準品溶 液與 用的熒光猝滅光譜 酸氫氯吡格雷對 光猝滅作用的機理研究 同溫度下硫酸氫氯吡格雷標準品溶液對 熒光猝滅方式 硫酸氫氯吡格雷對 猝滅方式若為動態(tài)猝滅，應(yīng)滿足 程：。 25 時，硫酸氫氯吡格雷與 互作用的線見圖 2。 35 時，藥物與 互作用的 線見圖 3。線性方程及相關(guān)系數(shù)計算見表 1。 李娟：氯吡格雷的含量測定 11 表 1 不同溫度下 程及猝滅常數(shù) 溫度 /K 程 L Ls r 298 =03Q+03 011 308 =03Q+03 011 圖 2 硫酸氫氯吡格雷與 互作用的 線（ 25 ） 圖 3 硫酸氫氯吡格雷與 互作用的 線（ 35 ） y=2=y=2=娟：氯吡格雷的含量測定 12 一般各類 猝滅劑對生物大分子最大擴散碰撞猝滅常數(shù)為 21010(Ls 從表 1 結(jié)果看， 數(shù)量級為 1011，由此可初步判斷加入硫酸氫氯吡格雷導(dǎo)致 光猝滅的過程以靜態(tài)猝滅為主，而溫度升高 程斜率減小，則進一步表明該猝滅過程是以靜態(tài)猝滅為主。 酸氫氯吡格雷與 表觀結(jié)合常數(shù) 結(jié)合位點數(shù) n 的測定 根據(jù)方程 ( F) /F = n ，計算硫酸氫氯吡格雷藥品與 表觀結(jié)合常數(shù) 結(jié)合位點數(shù) n，結(jié)果見表 2。 表 2 氯吡格雷與 表觀結(jié)合常數(shù) 結(jié)合位點數(shù) n 溫度 /K 線性方程 r L n 298 F=+03 08 F=+03 表 2 可以看出，在接近人體生理條件下氯吡格雷與 合位點 n 接近于 1，結(jié)合常數(shù) 數(shù)量級為 103,這說明了氯吡格雷可與 成 1 個結(jié)合位點 并且有較強的結(jié)合作用，即可被蛋白質(zhì)運輸和儲存。 酸氫氯吡格雷與 合反應(yīng)的作用力 由熱力學(xué)公式 (1)= )/R K T 計算不同溫度下氯吡格雷與 用的熵變 變 由能變 表 3。 表 3 氯吡格雷與 熱力學(xué)參數(shù) 溫度 /K kJ kJ kJ 298 308 由表 3 可知，硫酸氫氯吡格雷與 熱力學(xué)參數(shù) 和 ，根據(jù) 判斷小分子與生物大分子結(jié)合力性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律 18， 推斷出氯吡格雷與 間以疏水作用力為主。 李娟：氯吡格雷的含量測定 13 光猝滅法測定硫酸氫氯吡格雷片劑的含量 光猝滅法測定硫酸氫氯吡格雷的標準曲線繪制 根據(jù)靜態(tài)猝滅方程 F=，作出硫酸氫氯吡格雷含量測定標準曲線。25 時，標準曲線方程為 F=，相關(guān)系數(shù) r=0。工作曲線圖譜見圖 4。 y = 4 3F圖 4 硫酸氫氯吡格雷熒光測定工作曲線 酸氫氯吡格雷片及空白片與 用熒光光譜圖測定 硫酸氫氯吡格雷空白片與含藥片劑供試品溶液與 用的熒光發(fā)射光譜圖見圖 5。由圖 5 可知，空白片供試品溶液對 熒光激發(fā)光譜基本不產(chǎn)生干擾，而含藥片劑溶液可使 光猝滅。因此可以用熒光猝滅法測定硫酸氫氯吡格雷片劑中藥物的含量。李娟：氯吡格雷的含量測定 14 圖 5 硫酸氫氯吡格雷片及空白片 與 用熒光光譜圖 密度試驗 精密度試驗結(jié)果見表 4。 表 4 精密度試驗結(jié)果 由表 4 可知，同一份硫酸氫氯比格雷片劑的供試品溶液 6 次測定結(jié)果 )說明該方法精密度好。 樣回收率試驗 加樣回收率試驗結(jié)果見表 5。由表 5 可知，用熒光猝滅法測定硫酸氫氯吡格雷片劑的加樣回收率，平均加樣回收率為 %）為 結(jié)果表明，采用熒光猝滅法測定硫酸氫氯吡格雷片劑中主藥的含量，靈敏度高，準確性好，可以作為硫酸氫氯比格雷片劑的含量測定方法。 1 2 3 4 5 6 F（ 8540 %） 娟：氯吡格雷的含量測定 15 表 5 硫酸氫氯吡咯雷回收率測定結(jié)果 酸氫氯吡格雷片中主藥的含量測定 取同一批號硫酸氫氯吡格雷片劑，按含量測定方法，測定主藥含量，并折算為標示量百分含量，結(jié)果見表 6。標示量百分含量的平均值為 %）為 編號 儲液加入量 /單次測定熒光強度 平均值 理論加入量 ( 實際加入量 (回收率/% 平均回收率 /% % 1 娟：氯吡格雷的含量測定 16 表 6 同一批號硫酸氫氯吡格雷片劑中主藥含量測定結(jié)果（ %， n=6）（批號： 20100501） 測定次數(shù) 1 2 3 4 5 6 平均 F 值 曲方程 F=+示量百分含量 % 平均百分含量 % 結(jié)論 熒光分析法主要的優(yōu)點是測定靈敏度高和選擇性好。一般紫外 0熒光分析法的檢出限可達到 10至 10本實驗通過熒光光譜方法研究了 硫 酸氫氯吡格雷與牛血清白蛋白（ 的相互作用，探討了硫酸氫氯吡格雷與 光猝滅常數(shù)，以及結(jié)合