蘭州大學博士學位論文 1 前 言 原發(fā)性肝細胞肝癌（以下簡稱肝癌）是世界第五大最常見 惡性腫瘤 與第三大致命癌癥 1肝癌的發(fā)病率在東南亞、中國以及撒哈拉 沙漠 以南非洲最高，而在西方國家相對較低 5。在世界范圍內(nèi)，肝癌的發(fā)病率在女性所有惡性腫瘤中位居第七，而死亡率位居第六；在男性所有的惡性腫瘤中，肝癌的發(fā)病率位居第五，而死亡率則位居第二 6。 男性發(fā)生肝癌的機率較女性高 。 在過去的 二三十年里，肝癌在西方發(fā)達國家如澳大利亞的發(fā)病率顯著增加，預計到 2020 年將翻一倍 7。 據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng) 計， 在 2008 年，全世界肝癌新發(fā)病例總 人數(shù)為748300，死亡總?cè)藬?shù)為 695900。 肝癌有著明確的危險因素，其中乙肝病毒 (丙肝病毒 (占比率達 80%以上 8在我國，乙型肝炎病毒 是 肝癌發(fā)生最主要的獨立危險因素。 此外， 在中國由于環(huán)境 及食品 污染，藥物 濫用問題日益嚴重，也對各種惡性腫瘤包括 肝癌的發(fā)生起有重要作用 。在澳 大利亞 ， 主要原因，其感染者進展為肝癌的可能性比非感染者高出 27 倍13。肝癌的預后很差：在沒有遠處轉(zhuǎn)移的病例， 5 年存活率也只有 28%, 而一旦發(fā)生局部或遠處轉(zhuǎn)移 時， 5 年存活率降至 3% (因此，我們迫切需要研究肝癌的分子發(fā)病機理，以期尋求敏感特異的肝癌標記物和新的治療靶點，從而提高肝癌的早期診斷率，并開發(fā)更為有效的治療策略與方案。 在全世界范圍內(nèi)，有超過 的慢性 染者。在澳大利亞，大約有291,000 個 染者，其中 75%為 活動期感染。若無有效治療， 染者會進一步向肝纖維化發(fā)展，最終可發(fā)展成為肝硬化。一旦肝硬化出現(xiàn)，其每年發(fā)生肝癌的發(fā)病率將達到 414。 在 發(fā)的肝癌中， 蛋白在其發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用 15 然而 在 導肝細胞 發(fā)生 惡性轉(zhuǎn)化的機理依然沒有被闡明。 與 同的是，一種 毒，缺乏基因整合能力。 該病毒可誘發(fā)肝臟的慢性炎癥，使其發(fā)生代償性再生， 炎癥反應與肝細胞再生周而復始，反復相互作用，最終發(fā)生基因錯配， 傷，腫瘤基質(zhì)形成。除此之外，一些病毒蛋白可能與重要的細胞信號通路發(fā)生相互作用，從而促進肝 細胞 惡性轉(zhuǎn)化 18， 在這些病毒中， 白被認為是最重要的 致癌 病毒蛋白。 心蛋白（ 一種結(jié)構(gòu)蛋白，它形成了病毒衣殼，同時 它可以和某 些與腫瘤形成相關(guān)的 信號通路發(fā)生相互作用。例如，小鼠肝細胞中過表達此病毒可發(fā)展成為肝細胞性肝癌 19, 20。 心蛋白通過激活 2 活化蛋白激酶（ 1, 22、 8和轉(zhuǎn)化生長因子 ( 23 來刺激肝細胞的增殖。 通過與 族蛋白 24、 磷脂酰肌醇激酶 3（ 25、 6以及 7信號通路發(fā)生相互作用進而抑制細胞凋亡，促進細胞的增殖。 )，也被稱作 。該基因 最初 被 發(fā)現(xiàn)于接受過全反式視黃酸處理后的人類支氣管上皮細胞 28，之后發(fā)現(xiàn)其表達很廣泛。該基因位于染色體3 3 個外顯子和 2 個內(nèi)含子組成，其蛋白集中于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ 高爾基體內(nèi)，關(guān)于此基因其他報道相對甚少。 果蠅屬 白同源，該蛋白是一個屬于烯化的 體家族的小分子蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基轉(zhuǎn)運機制中起著一定 的作用 29。嚙齒類動物腦組織富含該基因 。 小鼠中 該基因被稱為為 大鼠中 則稱為 神經(jīng)元的分化以及調(diào)節(jié)發(fā)揮著作用 30中樞神系統(tǒng)中， 抗氧化防御，細胞信號轉(zhuǎn)導，細胞增殖以及細胞凋亡中均起 著 必要的作用 33。 腫瘤的發(fā)生離不開癌基因與抑癌基因的改變，我們在前期胃癌的研究中顯示，胃癌組織中，基因 發(fā)生了上調(diào)，該基因的上調(diào)同時影響著胃組織中相關(guān)基因（ 達的變化 34。 因的突變與非小細 胞肺癌密切相關(guān) 35，前列腺素 酶通過活化早期生長因子 1 和 號軸促進肝癌的發(fā)生發(fā)展 36，基因 能是一種新型的腫瘤抑制基因，它可以通過調(diào)節(jié) 合蛋白的表達以及 導的信號通路而抑制乳腺癌的進展 37，在食管鱗狀細胞癌的研究中，基因 證實為一種新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因 38。 人研究發(fā)現(xiàn) 脂酶 腫瘤環(huán)境中促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移等 39。前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)， 號通路被顯著活化40其在結(jié)直腸癌中的表達增 高或被持續(xù)活化 43。 為一種新的前列腺癌生物標記物被發(fā)現(xiàn)，抑制 表達有助于前列腺癌的治療44。有的基因則扮演雙向或多重作用，大量研究表明， 化生長因子 ）的效果是不同的，甚至是完全相反的，這完全取決于細胞的類型和周圍環(huán)境，高干細胞多分化潛能同時增強細胞分化，抑制惡性癌前細胞卻促進轉(zhuǎn)移的發(fā)生 45。死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白 可以促進凋亡的發(fā)生也可以扮演抗凋亡因子的角色，這取決于細胞的類型與外環(huán)境的不同， 人卵巢表面上皮細胞腫瘤的表達增高，但在卵巢顆粒細胞瘤中不增高 46。與其他許多基因在不同組織中生物學行為 一樣 ，基因 肝組織及肝癌發(fā)生發(fā)展中如何發(fā)揮其功能與作用，目前還未曾有報道。 基 因 表 達 譜 尚有 爭議 。 公 開 可 獲 得 的 資 料 數(shù) 據(jù) 庫蘭州大學博士學位論文 3 （ 顯示 ，來自大多數(shù)組織的腫瘤包括乳腺癌與肝癌在內(nèi)，其表達水平高于相應的正常組織。相反地， 47%的卵巢癌 組 織 顯 示 該 基 因 表 達 下 調(diào) (在乳腺癌中， 人注意到 表達與腫瘤的大小，分級以及病人生存率無關(guān) 47。然而，另一個資料庫顯示 48， 表達水平越高，腫瘤的體積越小，同時可提高生存率。 因啟動子（ C） 中的高頻率的單核苷酸多態(tài)性（ 已經(jīng)被報道是一個引起膀胱癌、胃癌、食管癌、絨毛膜癌以及鱗狀細胞癌的獨立危險因素 49 因結(jié)構(gòu)中 高頻率 出現(xiàn) 的 454C A 被認為是中國人 群中白血病的高危因素 52。然而， 體細胞中的突變還未曾在其他實體瘤中注意到 。 迄今，對 腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中所起的生物學作用研究甚少。已有報道指出， 促進 胞 發(fā)生 凋亡 的作用 ， 而此作用是 通過C/介導 53。 此外 ， 多項研究表明， 在宮頸癌細胞、乳腺癌和白血病細胞中，全反式維甲酸與環(huán)境應激（ 如 熱休克，氧化應激 等 ） 所導致的 抑制增殖與促 進 凋亡 作用都有 導 作用的參與 54敲除 白血病細胞 發(fā)生凋亡的能力明顯下降 56。 然而，也有 其他研究者發(fā)現(xiàn)， 導細胞的增殖 57 但卻抑制細胞的遷移 58。例如，過 渡 表達 宮頸癌胞 的 遷移 能力明顯下降 ， 而此變化很可能是 通過 號通路 的抑制 作用 而實現(xiàn)。相反， 當 乏時， 細胞的 遷移 能力增強 59。此外，還有報道表明 軟組織腫瘤的局部侵襲及轉(zhuǎn)移行為密切相關(guān)70。 但是有些報道表明， 腫瘤 細胞 中的 作用 很可能 隨著 細胞 的 類型以及細胞所處 的環(huán)境不同而 異。例如， 過 渡 表達 C/ 癌細胞株）細胞中 啟動子活性 明顯受到抑制。 然而 ，在 過 渡 表達 C/胞中 ， 動子的活性 卻明顯地增強 53。 正常 肝組織 以及 肝癌 的 發(fā)生發(fā)展中 起什么 作用，目前還未曾有報道。但目前有些研究結(jié)果顯示，在 基因結(jié)構(gòu)中， 鄰近啟動子區(qū)域 存在著與氧化應激反應密切相關(guān) 的結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)上 存在 熱休克反應元件 （ 和應激反應元件（ 28。 與此 相一致的 研究表明， 當乳腺癌細胞接受氰戊菊酯或 理時，會導致 達的 增高，同時會出現(xiàn) 表達 增加和 8 羥基脫氧鳥苷（ 8的生成 增多，而后者 是一個 反映 有力的 標志物 55, 60。 因此，推測 細胞的應激反應密切相關(guān)。 蘭州大學博士學位論文 4 眾所周知， 導致肝癌的最重要原因之一。同時，已經(jīng)很明確地知道， 肝臟誘導氧化應激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，這 也 是 致 肝損傷的經(jīng)典機制之一61, 62。 臨床上也觀察到，在 染 者 的肝臟 及血清 中， 氧化應激標志物 （ 包括 8 4） 的 水平明顯增加 63一些病毒蛋白與氧化應激的產(chǎn)生 密切 相關(guān)， 如 心蛋白 就 存在于線粒體膜上 ，而線粒體 膜也是氧化應激的發(fā)生地所在 66. 同時核心蛋白 也 與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān) 。 表達核心蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠顯示出脂質(zhì)過氧化， 傷 增加 和腫瘤的形成 機率增多 67。 而 非結(jié)構(gòu)蛋白 氧化應激中也扮演者中間介質(zhì)的角色 。如 以活化 化酶 2， 進而產(chǎn)生活性氧（ 68。 同樣，當 合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上時會刺激線粒體活性氧的產(chǎn)生 69?；?這些結(jié)果 ，我們推測 導 的 氧化應激 有可能 導致 表達上調(diào)， 而后者在病毒感染誘導的慢性炎癥和 肝癌 的發(fā)生過程中起有重要作用 。 本研究旨在探討 肝癌，特別是在 關(guān)性肝癌的發(fā)生過程中是否起有重要作用。 蘭州大學博士學位論文 5 第一部分 肝癌 組織及 胞 中的表達 腫瘤的發(fā)生是癌基因與抑癌基因之間 原有 平衡 發(fā)生紊亂 的結(jié)果 。 基因突變引起基因表達的改變， 進而引起其編碼的蛋白發(fā)生功能異常，而 蛋白水平發(fā)生的變化最終引起細胞行為學的改變， 如 細胞的增殖 、 凋亡等 失控而最終形成腫瘤。 對于臨床工作者以及 腫瘤 患者 而言 ，最關(guān)心的問題則是腫瘤的治療問題。隨著人類基因組概要完成的宣布， 腫瘤 的靶向治療已成為 頗具潛力的治療 各種 手術(shù)無法切除的惡性腫瘤的 關(guān)鍵點。 如前所述， 肝癌中 的生物學作用目前尚 未有過報道。 因此，該基因在肝癌的發(fā)生發(fā)展中究竟有無作用，有何作用，如何起作用等是我們 本研究的主要目的。 在本章節(jié)中，我們的主要實驗目的為： （ 1） 在人類 肝癌組織，特別是 關(guān)性肝癌組織中， 平和 蛋白水平的表達情況 ， 并比較 癌組織與 癌旁組織 中該基因 的表達情況； （ 2）檢測經(jīng)過致癌劑 理的 小鼠肝臟 腫瘤 組織 和非腫瘤組織 中 表達情況； （ 3） 在人肝癌細胞株 染 心蛋白 后，檢測 和 比較 該基因的表達情況 。 這 些實驗結(jié) 果 會初步揭示 該基因在肝癌中的可能作用，并 為后續(xù)檢測該基因的生物學功能實驗提供明確的方向。 驗材料 組織標本、細胞株和主要試劑 （ 1） 組織標本：所有人肝癌組織標本均由澳大利亞 院提供，其中包括 性病例和陰性病例，每個患者標本包括癌組織與癌旁組織； （ 2） 細胞株： 院細胞庫提供）； （ 3） 胎牛血清（ 由澳大利亞 司提供； （ 4） 美國 公司 司提供； （ 5） 杜氏磷酸鹽緩沖液（ 由美國 公司 司提供； （ 6） 含有 胰酶（ 10X）：由美國 司提供； （ 7） 二甲基亞砜（ 由美國 司提供； （ 8） 細胞計數(shù)板：由美國 司提供； 蘭州大學博士學位論文 6 （ 9） 提試劑盒（ ：由中國臺灣 （ 10） 錄合成試劑盒： a. 轉(zhuǎn)錄酶， b. 轉(zhuǎn)錄酶緩沖液（ 5X），由美國 司提供； （ 11） 由美國 司提供； （ 12） 18s 針： 5由美國 司提供； （ 13） ：由美國 司提供； （ 14） 10X 美國 司提供 ； （ 15） 50美國 司提供； （ 16） 10mM 美國 司提供； （ 17） 250ng/美國 司提供； （ 18） 基因 物：正向引物： 5反向引物： 5由美國 司提供； （ 19） 白定量試劑盒：由美國 司提供； （ 20） 二烷基磺 酸鈉 )：由美國生化試劑公司 供； （ 21） 美國生化試劑公司 供； （ 22） 甘氨酸：由美國 司提供； （ 23） 超純?nèi)u甲基氨基甲烷（ ：由澳大利亞司提供； （ 24） 過硫酸銨（ 由美國 司提供； （ 25） 30%甲叉雙丙烯酰胺混合液：由美國 司提供； （ 26） 美國 司提供； （ 27） 美國 司提供； （ 28） 號為 26619，由美國 （ 29） 硝酸纖維素膜 (編號為 162美國 司提供； （ 30） 脫脂奶粉：由澳大利亞 粉公司提供； （ 31） 牛血清白蛋白（ 由美國 司提供； （ 32） 無菌去離子沖洗水（ ：由澳大利亞 療公司提供； （ 33） 抗： 抗人抗體，由美國 司提供； （ 34） 抗： 抗人單克隆抗體，由美國 司蘭州大學博士學位論文 7 提供； （ 35） 抗： 抗人單克隆抗體，由美國 司提供； （ 36） 一抗： 4370S， 2)(兔抗人單克隆抗體，由美國 司提供； （ 37） 抗： 4631S， 兔抗人單克隆抗體，由美國 司提供； （ 38） 抗： 9255S， 鼠抗人單克隆抗體，由美國 司提供； （ 39） 二抗：抗兔，由美國 司提供； （ 40） 二抗：抗鼠，由美國 司提供； （ 41） 敏感化學發(fā)光試劑盒 )：由美國 司提供； （ 42） 通化學發(fā)光試劑盒 )：由美國 司提供； （ 43） 高性能化學發(fā)光片：由英國 司提供； （ 44） 顯影液：由比利時 療公司提供； （ 45） 定影液：由比利時 療公司提供； （ 46） 細胞培養(yǎng)瓶（ 美國 司提供，英國制造； （ 47） 吸管（ 25102550美國 （ 48） 細胞培養(yǎng)多孔板 ： 6 孔， 12 孔， 24 孔， 48 孔， 96 孔，由美國 （ 49） 50ml 丙烯錐形收集管）：由美國 司提供； （ 50） 15ml 丙烯錐形收集管）：由美國 司提供； （ 51） 無菌細胞凍存管： 德國 司提供； （ 52） 微量可調(diào)移液器： 210202001000德國 （ 53） 微量移液器過濾槍頭： 10202001000美國 司提供； （ 54） 量離心管：由美國 司提供。 蘭州大學博士學位論文 8 相關(guān)溶液的配制 （ 1） 含 10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基：將一支分裝好的胎牛血清從 箱取出，放入 37水浴箱，大概 15 分鐘由冰凍狀態(tài)溶解為液態(tài)，取出放入超凈臺，同時將一瓶購買好備用的 500入超凈臺，將溶解好的胎牛血清 56入 500 ，配成含有 10%胎牛血清的 封好瓶蓋，將其放入 4儲藏室保存。 （ 2） 1X 胰酶：將含有 胰酶（ 10X）使用杜氏磷酸緩沖液（ 行 10 倍稀釋，稀釋成為工作濃度的胰酶， 1酶，加入 9封好瓶蓋，將其放入 箱保存，以上操作均為無菌操作，需在超凈臺下進行稀釋。 （ 3） 細胞凍存液（ 10% 從 箱中取出一支分裝好的胎牛血清，將其放入 37水浴箱中，大概 15 分鐘后溶解，取出放入超凈臺，將一支未打開的 5裝的 入超凈臺，并打開，將其加入 45胎牛血清中，配成含有 10% 90%胎牛血清的細胞凍 存液，混勻后， 箱保存。 （ 4） 細胞組織蛋白抽提緩沖液（ :總體系為 1L，所需加入試劑如下， 50 1M 150 1M 化鈉） ,50M 化鈉）， 5000,2 二胺四乙酸）， 2 二醇四乙酸酯），加入 3蒸水）至總體積為 1L。此緩沖液可長期保存于室溫 中，每次使用時，需使用此緩沖液來配制新鮮蛋白裂解緩沖液。 （ 5） 新鮮蛋白裂解緩沖液（ :此緩沖液只能每次使用時新鮮配制，配好之后，置于冰上，一個小時之內(nèi)用完。配方如下， 5M 硫蘇糖醇 )， 4 125甲基磺酰氟 ，蛋白酶抑制劑 )， 200 氏蛋白酶抑制劑混合物，25X)， 10 500酸鈉 )， 50甘油 ， 50乙二醇辛基苯基醚） ,加水至 5勻并使用。 （ 6） 10%過硫酸銨（ 以 10總體系，將 1g 過硫酸銨溶于 104保存。 （ 7） 離膠（ 10%）：以 10總體系，所需試劑及其體積分別為， 蒸水）， 30%丙烯酰胺混合液， 10% 10%4 蘭州大學博士學位論文 9 （ 8） 離膠（ 12%）：以 10總體系，所需試 劑及其體積分別為， 蒸水）， 30%丙烯酰胺混合液， 10% 10%4 （ 9） 縮膠（ 5%）：以 6總體系，所需試劑及其體積分別為， 蒸水）， 30%丙烯酰胺混合液， 60 10%60 10%6 （ 10） 10X 泳緩沖液（ 以 1L 為總體系，所需試劑及其量分別如下， 30g 44g 甘氨酸 ,10g 先溶解在 700蒸水中，進行攪拌充分混勻，然后繼續(xù)加入雙蒸水至 1L，室溫保存，每次使用時，將其進行 10 倍稀釋，然后使用。 （ 11） 4X 樣緩沖液： 200400硫蘇糖醇 ),8%酚藍， 40%甘油，室溫保存，用時再加 8%。 （ 12） 10X 膜緩沖液（ 以 1L 為總體系，所需試劑及其量分別如下， 30g 144g 甘氨酸 ,加入雙蒸水至 700充分攪拌混勻，定容至 1L，室溫保存。 （ 13） 1X 以 1 1000X 膜緩沖液，加入甲醇 200去離子水至 1L， 4保存。 （ 14） 10X 沖液：以 2L 為總體系，所需試劑和劑量分別為， 入去離子水至 進行充分攪拌混勻，使用濃鹽酸（ 調(diào)整 至 大概需要 80用 監(jiān)測儀進行實時監(jiān)控，當 ，繼續(xù)加入去離子水至 2L，室溫保存，避光。 （ 15） 1X 緩沖液：以 1L 為總體系，用 50管分兩次從 10X 00入 45%的 4005%的 水定容至 1L,4保存。 （ 16） 5%脫脂奶粉：奶粉 5g,加入 100X ,充分攪拌混勻， 4保存。 （ 17） 5%0X ,充分攪拌混勻， 4保存。 （ 18） 1:1000 一抗： 10體，加入 10%脫脂奶粉或 5%充分攪拌混勻， 存。 （ 19） 1:10000 一抗： 1體，加入 10%脫脂奶粉或 5%充分攪拌混勻， 存。 （ 20） 1:10000 二抗： 1體，加入 10%脫脂奶粉或 5%充分攪拌混勻， 存。 蘭州大學博士學位論文 10 相關(guān)儀器設(shè)備 （ 1） 養(yǎng)箱：由美國 司提供； （ 2） 細胞培養(yǎng)用超凈臺：由澳大利亞 司提供； （ 3） 電子秤： 日本 司提供； （ 4） 分光光度計： 美 國 司提供； （ 5） 時熒光定量 ：由美國 司提供； （ 6） 渦旋混合器：由美國 司提供； （ 7） 通用臺式搖床：由美國 司提供； （ 8） 組織均質(zhì)器：由德國 司提供； （ 9） 干式加熱器：由澳大利亞 司提供； （ 10） 迷你微孔板離心機：由美國萊伯特（ 公司提供； （ 11） 制冰機： 日本星崎 （ 司提供； （ 12） 37孵育箱：由德國 司提供； （ 13） ： 700,由美國 供； （ 14） ： CR 美國 司提供，英國制造； （ 15） 變壓器： C，由美國 司提供； （ 16） 變壓器： 200/美國 司提供； （ 17） 小型臺式高速冷凍離心機： 5424R，由德國 司提供； （ 18） 超速低溫離心機： 德國 造商提供； （ 19） 流體動力通風櫥：由澳大利亞 司提供； （ 20） 普通熒光顯微鏡 ： 日本奧林巴斯公司提供； （ 21） 顯影定影儀： 德國 司提供，中國注冊。 驗方法 胞的培養(yǎng)、凍存與復蘇 （ 1） 細胞的培養(yǎng)：來自 病研究所培養(yǎng)好的第二代 胞株（肝癌細胞株），培養(yǎng)于 養(yǎng)瓶中，生長狀態(tài)良好，將其放入超凈臺，取出配好的含 10%血清的 全培養(yǎng)基），將其加入 3 支新的 養(yǎng)瓶中，每瓶加入 10生長好的培養(yǎng)瓶打開，棄去上清液，加入溫熱好的 行沖洗 1，棄去 入 2X 胰酶，蓋好瓶蓋，來回輕輕搖晃，使 胰酶平鋪于培養(yǎng)瓶中，將其放入 37孵育箱中，大概 3分鐘后（由于 胞株貼壁能力很強，需要較長時間胰酶的消化作用），蘭州大學博士學位論文 11 取出，肉眼觀察，可見大片細胞從瓶壁上逐漸脫落，鏡下觀察，細胞突起消失并回縮，外周變圓，變鈍。放入超凈臺，打開，即刻加入 5全培養(yǎng)基，此時，培養(yǎng)基中的血清可終止胰酶的消化作用，防止胰酶進一步作用而損傷細胞，用吸管來回吹打大概 50，這樣的作用可使細胞盡量分散為單細胞，吹打好之后，將其分別加入三個已配好的新鮮培養(yǎng)基中（ 1/3 傳開），置于 37 ,含 5%培養(yǎng)箱中。每天在顯微鏡底 下觀察其生長狀態(tài)，一般首先置于低倍鏡下 (10察 ,主要有細胞生長密度，細胞的形態(tài)，細胞生長指數(shù)等。細胞生長狀態(tài)很重要，當受到污染時，會影響后續(xù)實驗結(jié)果，包括各種基因蛋白在細胞中的表達情況，一般的污染容易發(fā)現(xiàn)，但是當感染支原體時，很難在顯微鏡下觀察到，主要鑒別點在于其生長速度明顯慢于正常情況，當感染程度嚴重時，在高倍鏡下觀察，可以看到細泥沙樣改變，但是很難明確鑒別。一般當細胞生長密度達到 50%時為最佳狀態(tài)，此時可以進行傳代或者后續(xù)實驗，最高生長密度不要超過70%，否則會影響各類因子的正常表達。當進行細 胞傳代時，先棄去上清液，使用 洗 1，加入胰酶消化等，如前所述，方法一樣。 （ 2） 細胞的凍存：當細胞生長代數(shù)處在早期時，可以大量傳代培養(yǎng)一批細胞，凍存起來，可以以后隨時復蘇使用。一般選擇大培養(yǎng)瓶（ ，培養(yǎng) 5其生長密度達到 50%，開始收集細胞。首先，如前所述，棄去培養(yǎng)液，使用 行沖洗，然后加入 3X 胰酶于每個大培養(yǎng)瓶中，放入 37細胞培養(yǎng)箱中，大概 3 分鐘，取出，加入完全培養(yǎng)基 5止胰酶作用，開始吹打細胞，將所有培養(yǎng)瓶中細胞吹打下來，混合在一個 無菌的 50料離心管中，開始離心， 800 4出后立即棄去上清液，加入 10吹打混勻，再次離心， 800 4出后立即棄去上清液，盡量將 干凈，此時加入事先已經(jīng)配好的細胞凍存液（含 10% 胎牛血清），要逐漸少量加入，否則會殺死更多的細胞。以 5 個大培養(yǎng)瓶計算，一般需要 15存液，混勻后，將其分裝于 10 個凍存管中，密封好，貼上標簽，包括日期，名稱，以及細胞的代數(shù)（比如 第六代），實驗人員的姓名等。放入細胞管架上，將細胞管架放入一個白色 泡沫盒中，蓋上蓋子，里面有較大空間（這樣細胞的溫度可以逐漸下降，以免速凍而凍傷或凍死細胞），密封好放入 箱中，第二天將其取出，將細胞凍存管移至普通試劑儲存盒中，一般可保存 1 年。 （ 3） 細胞的復蘇：首先，準備好完全培養(yǎng)基，預熱培養(yǎng)基，之后放入超凈臺，吸管吸出 15養(yǎng)液加入一支新的中培養(yǎng)瓶中（ 此時，從 蘭州大學博士學位論文 12 箱中取出一支凍存的 胞株，將其取出后迅速放入 38水浴鍋中，此時可用手拿著在水浴鍋中進行來回搖晃，使其溶解，大概需要一分鐘，拿出后放入超凈臺，打開，小心緩慢的使用加樣槍將其吸出再加 入含有新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，蓋好瓶蓋，來回輕輕搖晃，置于 37， 5%胞培養(yǎng)箱中。這里有個原則：慢凍快溶，凍存細胞時，使其溫度逐漸降低，溶解細胞時，使其溫度迅速升高，這會把對細胞的損傷降到最低。剛才的操作中，沒有進行離心并棄去凍存液，這是由于離心對細胞的損傷遠大于殘留的 細胞的損傷，而且加入培養(yǎng)基后， 濃度已由原來的 10%降至小于 1%，因此我們選擇不離心。觀察細胞，一般過夜后，為細胞換新鮮培養(yǎng)基，首先棄去上清液， 洗 1，直接加入新鮮完全培養(yǎng)基，觀察細胞生長狀態(tài)，當細胞生長 密度達到 50%時，可進行傳代，一般剛剛復蘇的細胞，需要傳代 2后方可使用，使其細胞內(nèi)各因子的表達恢復到正常狀態(tài)，后續(xù)細胞培養(yǎng)方法與之前所述一樣。（所有實驗室的任何操作，需全程戴實驗室專用手套和白大褂）。 織標本的收集 （ 1） 人肝癌組織：所有人肝癌組織及癌旁組織均由 院手術(shù)外科醫(yī)生提供，由 病研究所喬梁教授收集并核查，組織均為新鮮標本，并凍存于 箱中，所有獲得的組織均受到患者本人及其家屬的同意，每個標本存于凍存管中，每個凍存管都貼上相關(guān)標簽，包括標本的編號及其是否 性， 每組標本均由一對組成，癌組織與癌旁組織。共 8 對組織， 4 對 性， 4 對 性。 （ 2） 急性 理小鼠肝組織：從獲得小鼠到拿到肝組織，均由 病研究所 士后完成并予提供。組織標本為， 6齡小鼠，一次性腹腔內(nèi)注射 150mg/ 二 乙 基 亞 硝 胺 ） ，分別在 0h ，12h,24h,36h,48h,72h,96h,144h 給予小鼠安樂死，同時摘取小鼠肝組織。 （ 3） 慢性 理小鼠肝組織：從獲得小鼠到拿到肝腫瘤組織，均由 授研究小組完成并予提供。 組織標本為 經(jīng)過 48 周理后形成的小鼠肝腫瘤組織： 2 周齡小鼠，一次性單劑量腹腔內(nèi)注射 50mg/重），經(jīng)過 48 周的正常飼養(yǎng)后，行安樂死，并摘取小鼠肝癌組織及非癌肝組織 。 （ 4） 第 1 代 相同代數(shù) 胞株：由 病研究所 1 代 胞株是指在普通 胞株感染 13 核心蛋白 錄 后經(jīng)過第一次傳代以后所獲得的細胞，亦即第 1 代感染 胞株，而這里的普通 胞株可以是 50 代）以內(nèi)的細胞 株，在感染 后的 般在5 代以內(nèi)均可使用，其轉(zhuǎn)染效率在 5 代以內(nèi)可維持至 70%以上，第 2,3 代最佳，均能達到 90%以上， 5 代之后會迅速下降，不能使用。 時熒光定量 測 織 提?。菏紫?，獲取一些干冰置于一個大小適中的白色泡沫盒內(nèi)，將獲得的組織從 箱中取出，置于干冰上，拿出少量干冰放于一個不銹鋼托盤底下，使托盤低溫冷卻。此時切取每個標本組織，從干冰中取出一個標本，用鑷子拿出，放于托盤上，使用實驗室解剖刀進行切割，切取大小為大概30右，第一塊組織可進行稱 重，其余肉眼觀大小同前差不多即可，切取后迅速將其置于 心管中，置于干冰上，每個組織標本的切取方法一致。切好之后，準備 提液，從 提試劑盒中取出 解液，使用前，每 1加入 10巰基乙醇。具體實驗步驟如下： （ 1） 加入 350解液（含 每個離心管中，裂解液會在干冰環(huán)境下迅速結(jié)為固態(tài)，每個離心管中加入一個不銹鋼金屬小球（勻質(zhì)專用），全部加好后，將其置于勻質(zhì)器內(nèi)，開始振蕩， 302 （ 2） 取出離心管，室溫放置 3心吸出全部上清液，轉(zhuǎn)入一個過濾柱（ 中 ,置于離心機內(nèi)， 1100024； （ 3） 將過濾得到的澄清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入等體積（ 35070%乙醇，來回吹打混勻； （ 4） 將上述混懸液轉(zhuǎn)入 型柱 )， 110000 ,棄去過濾液； （ 5） 加入 500 于每個柱子中， 1100010，棄去過濾液； （ 6） 加入 750 于每個柱子中， 1100010，棄去過濾液； （ 7） 重復步驟 6； （ 8） 將含有柱子的離心管繼續(xù)放回離心機內(nèi)， 14000 速） ,30 ,此步用來干燥柱子； （ 9） 將柱子放入新的離心收集管中，每個收集管中加入 50 的去離子水，蓋上柱子的蓋子，室溫放置 1去離子水完全浸透于柱子中的蘭州大學博士學位論文 14 濾膜內(nèi)； （ 10） 離心， 11000； （ 11） 棄去柱子，此時得到的過濾液則為 速置于普通冰上； （ 12） 使用 光光度計檢測 度； （ 13） 貼上每個 本的編號以及濃度于每個收集管上 ， 存。 胞 提?。?（ 1） 首先，加入 350解液（含 每個孔（六孔板，細胞培養(yǎng)用）中，室溫靜置 3 分鐘； （ 2） 加入等體積（ 35070%乙醇，來回吹打混勻； （ 3） 將上述混懸液轉(zhuǎn)入 型柱 )， 110000 ,棄去過濾液； （ 4） 其余步驟同組織 提?。ǖ?5 步以后）。 合成：首先計算所需 體積，以 10總體系，一般合 成 需要的 500體如下： （ 1） 2O= 500 （ 2） 10=（ 3） 隨機引物（ 250ng/=（ 4） 混合上述試劑，置于 66 ,5即迅速將其放置冰上 1（ 5） 加入 轉(zhuǎn)錄酶， 2轉(zhuǎn)錄酶緩沖液（ 5X）， （ 6） 吹打混勻，置于 37 ,1 小時 時 10 分鐘， （ 7） 將合成的 于 箱中。 時熒光定量多聚酶鏈反應）： （ 1） 管家基因 18s 探針）：以 20總體系，所需試劑及其劑量如下：10X 210mM 50：18s 家基因） 離子水： （ 2） 目的基因（引物）：以 20總體系，所需試劑及其劑量分別如下： 2X 10游引物（ 10M） ： 1游引物（ 10M） ：1離子水： 35 （ 3） 上述體系配好之后，開始上機（ 時熒光定量 ）進行擴增反應，反應條件分別為： 18s：第一階段，預變性， 95 /3二階段，變性 95 /15(40 個循環(huán) )。由于我們所選用的管家基因 18s 探針，在分析結(jié)果時不會產(chǎn)生融解曲線（ ,因此在第二階段結(jié)束后，即可終止反應；目的基因：第一階段，預變性，蘭州大學博士學位論文 15 95 /20s,第二階段，變性 95 /3(40 個循環(huán) ),第三階段，延伸反應， 95 /15 /15s(此階段所需時間較長 )，在這里，我們所選用 的目的基因反應條件為 司推薦的標準條件，