蘭州大學碩士學位論文 紫花苜蓿種質(zhì)生物 質(zhì) 能源性狀評價及其莖 細 胞 壁木質(zhì)素沉積特性研究 1 第一章 文獻綜述 隨著能源需求 的 急劇增加， 加之 傳統(tǒng) 的 不可再生化石燃料面臨開采枯竭等問題，迫切需要 尋求和發(fā)展新 能源 ，而 生物能源 （ 作為可再生替代能源之一， 因其 具有減少溫室氣體排放 、 利用非糧農(nóng)作物廢料 和 潔凈安全等特點 已成為當前 最有前景的替代能源 之一 （ 2007； et 2011）。 為此 ，美國農(nóng)業(yè)部計劃 2022 年利用能源植物生產(chǎn)酒精產(chǎn)量達到 134 億加侖 /年（ ） ， 用以替代傳統(tǒng)燃料。我國 也 明確提出 2015 年國內(nèi)生物質(zhì)發(fā)電裝機不低于 1300 萬千瓦，2020 年將達到 3000 萬千瓦，在 2010 年 550 萬千瓦的基礎上分別增長 （可再生能源發(fā)展十二五規(guī)劃） 。 鑒于此， 能源 植物生物能源性狀評價、細胞壁成分生物合成途徑、相關基因遺傳改良及其轉化利用效率的影響因素等均已經(jīng)成為目前該領域的熱點問題 （ et 2011）。 能源植物的開發(fā)和應用是生物燃料大規(guī)模生產(chǎn)的基礎（ et 2007），根據(jù)產(chǎn)生能源的成分不同，可 將能源植物分為三類： 1）油脂類，富含油脂或石油類似物，可用于生產(chǎn)生物柴油； 2）糖類和淀粉類，富含糖或淀粉，可用于生產(chǎn)生物酒精； 3）木質(zhì)纖維素類，富含纖維素和半纖維素，可用于生產(chǎn)生物酒精（ et 2011）。其中，木質(zhì)纖維素類因材料豐富，價格低廉，且不涉及糧食安全問題成為當前能源植物的首選（ Pu et 2008； et 2011）。在眾多的木質(zhì)纖維素類植物中，多年生草本植物被認為最符合生物能源生產(chǎn)的要求（ et 2003）。 圖 1紫花苜蓿綜合開發(fā)利用流程（改編自 2006） of in 2006) 多年生豆科 牧草紫花苜蓿（ .）作為優(yōu)良的能源植物，不僅具有 適應范圍廣、 抗逆性強 、 種植成本低 和 生態(tài)效益好等特點 ，同時 還具有其它能源作物所不具備的特性， 即通過莖葉分離后莖稈用以生產(chǎn)生物燃料的 同時， 葉蘭州大學碩士學位論文 紫花苜蓿種質(zhì)生物 質(zhì) 能源性狀評價及其莖 細 胞 壁木質(zhì)素沉積特性研究 2 片 可以 生產(chǎn)優(yōu)質(zhì) 飼料、蛋白質(zhì)添加劑等副產(chǎn)品 ，具有很高的綜合利用價值（ 2006； et 2010； et 2011）（圖 1近年來，國內(nèi)外科研工作者對紫花苜蓿生物能源的開發(fā)利用開展了大量的研究工作（ et 2007； et 2008； et 2011；張樹振等， 2012），本文從 紫花苜蓿的生物 能源 利用 角度出發(fā)，系統(tǒng) 回顧了近年來 紫花苜蓿 生物能源性狀評價 ， 細胞壁發(fā)育合成途徑及其遺傳調(diào)控 、栽培管理措施對紫花苜蓿生物質(zhì)酒精轉化效率的影響 等方面的研究進展 ，以期為能源植物紫花苜蓿的 進一步 研發(fā)利用提供參考。 蓿種質(zhì)資源能源性狀評價 紫花苜蓿在全球分布廣泛，生存環(huán)境高度異質(zhì)化，這種廣泛的地理適應性促進了基因的變異，進而形成了豐富多樣的種質(zhì)資源 （ et 2004） 。國內(nèi)外育種工作者收集和保存了大量苜蓿種質(zhì)材料，如美國農(nóng)業(yè)部種質(zhì)資源信息網(wǎng)絡（ s 布收集有 4000多份紫花苜蓿及其近親種質(zhì)，可為生物質(zhì)型苜蓿（ 種的選育或改良提供了豐富的種質(zhì)材料（ et 2011a）。 獲得高產(chǎn)、高纖維素和低木質(zhì)素的新型種質(zhì)是紫花苜蓿能源利用研究的重要目標，生物質(zhì)型苜蓿的育種目標明確： 直立生長，適宜低頻次刈割，莖、葉產(chǎn)量均最大化，生產(chǎn)成本低，纖維素含量高而木質(zhì)素含量低（程序， 2008）。近年來，紫花苜蓿種質(zhì)能源性狀評價逐漸開展， （ 2007）對 4 份紫花苜蓿種質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，不同種質(zhì)莖細胞壁含量及細胞壁中葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、海藻糖和糖醛酸含量存在顯著差異（ m2s，相對濕度 50白天溫度 24，夜間溫度 18。苜蓿生長至現(xiàn)蕾中期（ 65%植株現(xiàn)蕾）進行刈割，共進行 2 次刈割，刈割 時間分別為 2011年 1 月 20 日與 2011 年 3 月 6 日。 態(tài)學指標和產(chǎn)草量測定 分別測定 2 次刈割處理不同 苜蓿 品種的 株高 、分枝數(shù)和 主莖 直徑，莖葉分離后置于烘箱中 105 殺青 然后 80 烘干至恒重，分別稱其重量計算產(chǎn)草量（莖干重 +葉干重 ）和葉莖比（葉干重 /莖干重）。 根據(jù) 1981） 的苜蓿分級標準對 參試品種 進行分級。 胞壁成分含量測定 參考 1991）的 苜蓿品質(zhì)預測方程（ 算苜蓿中性洗滌纖維（ 酸性洗滌纖維（ 酸性洗滌木質(zhì)素（ 量，根據(jù)以下公式計算纖維素和半纖維素含量（ et 2010）： )=成熟級別 ） +株高 ) )=成熟級別 ） +株高） )=成熟級別 ） +株高 ) 纖維素 (%)=性洗滌纖維 )性洗滌木質(zhì)素 ) 半纖維素 (%) = 性洗滌纖維 )性洗滌纖維 ) 兩茬纖維素含量（ %）、半纖維素含量（ %）、木質(zhì)素（ 量（ %）為：（第 1 茬干重 第 1 茬 含量 +第 2 茬干重 第 2 茬含量） /（第 1 茬干重 +第 2 茬干重 ) 100。 據(jù) 分析 文中所有數(shù)據(jù)均以平均值 標準誤表示。采用 件進行不同苜蓿品種各項指標差異顯著性分析，當 。 同苜蓿品種產(chǎn)草量比較及其變異分析 高生物量產(chǎn)出是苜蓿作為能源植物生產(chǎn)酒精燃料的重要基礎，供試的 54 個苜蓿品種兩 次刈割不同品種總產(chǎn)草量變化范圍較大（ g/株 g/株 ），其中，兩次刈割總產(chǎn)草量最高的苜蓿品種 為甘農(nóng) 3 號（ g/株）， 其次為 蘇聯(lián) 福、蘇聯(lián) 意大利等 苜蓿品種，兩次刈割總 產(chǎn) 草 量 最低的苜蓿 品種為 株） ，較低的品種為 準格爾 和 苜蓿王。 單因素方差分析表明參試品種兩次刈割產(chǎn)草量均存在極顯著差異（ 。同時，由表 2以看出產(chǎn)草量兩次刈割變異系數(shù)均較大，分別 為 具有較大的選擇潛力。兩次刈割處理產(chǎn)草量的種內(nèi)變異均高于種間變異，其種內(nèi)變異占總變異的比率分別為 53%和 61%，而種間變異僅為 47%和 39%，并且刈割后總變異系數(shù)和種內(nèi)變異對總變異的貢獻呈增大趨勢。 同苜蓿品種細胞壁成分比較及其變異分析 纖維素是生產(chǎn)乙醇等液體燃料的主要大分子物質(zhì)，兩次刈割供試苜蓿品種纖維素含量變化范圍為 ，其中三得利的纖維素含量最高（ ，其次為和闐以及牧歌，其纖維素含量均高于 23%，另外，大郁山、 第安和甘農(nóng) 3 號等苜蓿品種纖維素含量也較高，含量均大于22%；先行者的纖維素含量最低 (，纖維素含量較低的品種還有準格爾、甘農(nóng) 1 號、西部巨人、美國雜花、苜蓿王、匈牙利和蘇聯(lián)蘭花等，其兩茬纖維素含量均低于 19%。由表 2出同茬苜蓿品種間纖維素含量差異極顯著蘭州大學碩士學位論文 紫花苜蓿種質(zhì)生物 質(zhì) 能源性狀評價及其莖 細 胞 壁木質(zhì)素沉積特性研究 18 （ 。兩次刈割處理苜蓿品種的纖維素含量變異系數(shù)分別為 種內(nèi)變異對總變異的貢獻率分別為 高于種間變異（表 2且刈割處理后種內(nèi)變異呈增加趨勢，表明刈割處理增加了苜蓿纖維素含量的種內(nèi)變異程度。 表 2不同苜蓿品種 刈割處理 產(chǎn)草量及細胞壁成分差異顯著性和變異分析 of 4 狀 刈割 變異來源 變異系數(shù) 自由度 離差平方和 P 值 產(chǎn)草量 第 1 茬 種間 53 種內(nèi) 61 。兩茬苜蓿木質(zhì)素（ 量的變異系數(shù)分別為 均高于以上纖維素和半纖維素的變異范圍，在細胞壁成分中變異系數(shù)最高，表明其選擇潛力最大。與纖維素和半纖維素相似，兩茬 內(nèi)變異均高于種間變異，且刈割可增加其種內(nèi)變異占總變異的比率（表 2 同苜蓿品種聚 類分析 對 54 個苜蓿品種兩次刈割的干草產(chǎn)量、細胞壁成分（纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量）和株高、分枝數(shù)、主莖直徑、葉莖比等生長指標進行了聚類分析，可將供試苜蓿品種分為 5 個類群（圖 2五個類群的產(chǎn)草量、纖維素含量、半纖維素含量、木質(zhì)素含量均值比較分析見表 2 第 I 類群包括 12 個國外引進品種、 3 個育成品種和 6 個地方品種。該類群的特點是兩茬產(chǎn)草量及細胞壁各成分中等，刈割后分枝數(shù)和葉莖比較高。第 群包括 4 個國外引進品種和 4 個地方品種，該 類群的特點是兩茬草產(chǎn)量均較高。第 1茬產(chǎn)草量顯著高于其它類群（ 纖維素含量 半纖維素含量，表明產(chǎn)草 量和木質(zhì)素含量具有較大的選擇潛力。楊曉莉等（ 2008）進行析發(fā)現(xiàn)苜蓿種群內(nèi)遺傳多樣性（ 大于種群間遺傳多樣性（ ，表明苜蓿種群內(nèi)的遺傳變異占優(yōu)勢。本研究對苜蓿產(chǎn)草量和細胞壁各成分含量的遺傳變異分析發(fā)現(xiàn)其種內(nèi)變異高于種間變異，這與李擁軍（ 1998）和孫建華等（ 2004）的研究結果一致，進一步表明我國苜蓿雜合度高，品種內(nèi)變異幅度大，品種內(nèi)變異為種質(zhì)資源的選擇利用提供了廣泛的基礎。 苜蓿由于其自身遺傳特性，品種之間存在較大的遺傳變異，那些已經(jīng)具有可觀遺傳分化的品種是苜蓿種質(zhì)資源 利用和優(yōu)良品種培育的基礎（楊曉莉等，2008）。聚類分析把 54 份供試苜蓿品種分為 5 個大類，以第 群和第 V 類群生產(chǎn)性能最高，但該類群木質(zhì)素含量高，葉莖比較低，這與苜蓿產(chǎn)量提高和品質(zhì)降低相關的報道一致（曹致中， 2002）。已有研究表明，生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇的效率和纖維素呈正相關而和木質(zhì)素呈負相關（ et 2007； 程序， 2009），因此，在實際育種過程中保證生物量及纖維素含量的基礎上選育低木質(zhì)素含量的品種，是今后該類群苜蓿品種 生物質(zhì)能源性狀改良的方向。另一方面，研究發(fā)現(xiàn)不同收獲管理方式對苜蓿酒精產(chǎn)量也具有顯著影響（ et 2007）。本文第 胞壁各成分含量高，系統(tǒng)深入開展該類群高產(chǎn)低木質(zhì)素苜蓿品種的刈割時間及收獲次數(shù)對生物質(zhì)能源性狀的影響，可以為今后苜蓿生物質(zhì)能源開發(fā)利用提供依據(jù)。基于苜蓿生物質(zhì)能源性狀的聚類分析發(fā)現(xiàn)，蘭州大學碩士學位論文 紫花苜蓿種質(zhì)生物 質(zhì) 能源性狀評價及其莖 細 胞 壁木質(zhì)素沉積特性研究 23 國內(nèi)引進品種、育成品種和地方品種聚類相對分散，說明國內(nèi)苜蓿種質(zhì)資源生物質(zhì)能源性狀遺傳背景較為復雜，這與其尚未系統(tǒng)開展相應的遺傳改良研究 利用有關。但是，通過國內(nèi)不同苜蓿品種生物質(zhì)能源初評，發(fā)現(xiàn)我國一些地方品種如和闐、大郁山、甘農(nóng) 3 號等品種生產(chǎn)性能較好，細胞壁含量高，是今后苜蓿生物質(zhì)能源開發(fā)和利用的優(yōu)良種質(zhì)材料。 蘭州大學碩士學位論文 紫花苜蓿種質(zhì)生物 質(zhì) 能源性狀評價及其莖 細 胞 壁木質(zhì)素沉積特性研究 24 第 三 章 不同收獲時期對紫花苜蓿莖 細胞壁 多糖 含量 及酒精產(chǎn)量的影響 言 紫花苜蓿作為優(yōu)良的生物能源植物，其多糖含量及酒精產(chǎn)量除 了 受紫花苜蓿種質(zhì) 基因型 影響外，種植密度、灌溉和施肥 和 收獲時期等栽培管理措施對其也具有顯著影響（ et 2003）。其中 ， 收獲時期 通過 影響紫花苜蓿生物質(zhì) 產(chǎn)量和細胞壁成分，進而影響紫花苜蓿 轉化為 酒精 的 產(chǎn)量。研究發(fā)現(xiàn) ， 晚刈割條件下可以提高紫花苜蓿生物質(zhì)產(chǎn)量及纖維素含量， 而 盛花期收獲與孕蕾期 收獲 相比纖維素含量增加 6%（ et 2008）， 盛花期收獲與初花期收獲相比生物質(zhì)產(chǎn)量增加 12%，纖維素含量由 加至 et 2011） 。 苜蓿品質(zhì)預測方程（ 利用株高等生長指標可以快速、經(jīng)濟的預測出紫花苜蓿 量，進而對苜蓿的品質(zhì)作出初評 （ 2003；et 2010） 。通過生長指標預測紫花苜蓿多糖含量，對紫花苜蓿的生物能源性狀作出判斷，對大通量生物能源材料生產(chǎn)具有重要意義。 要對飼草品質(zhì)相關的纖維素指標進行測定，沒有對半纖維素進行直接預測， 無法對其酒精產(chǎn)量進行估計，鑒于此，本試驗測定了大量苜蓿形態(tài)學指標，以探討生長指標和紫花苜蓿莖細胞壁多糖含量及酒精產(chǎn)量之間的關系。 通過轉基因等手段降低 木質(zhì)素 含量 ， 往往 伴隨著生物質(zhì)產(chǎn)量的下降 ， 而木質(zhì)素含量的降低也會降低植株的抗逆性，莖稈強度下降，直立生長習性喪失（ et 2009） 。紫花苜蓿種質(zhì)眾多， 生長習性差異較大，在直立生長習性方面存在直立生長型和匍匐生長型兩種，這兩種生長習性的苜蓿種質(zhì)間細胞壁多糖含量及酒精產(chǎn)量是否存在差異？ 鑒于此，本試驗在 第二章紫花苜蓿種質(zhì)生物質(zhì)性狀評價 的基礎上，從 54 個苜蓿 品種中選擇 7 個生物能源性狀優(yōu)良 和具有匍匐生長 習性 的 金達萊 苜蓿 品種，探討大田栽培條件下不同收獲時期對紫花苜蓿 生物質(zhì) 產(chǎn)量、 莖細胞壁 多糖含量及酒精產(chǎn)量的影響， 以期 為紫花苜蓿生物能源應用適宜收獲時期 的選擇 提供科學依據(jù)。并 通過 株高 、莖粗、分枝數(shù) 等生長指標 的 相關性分析，確定與 生物質(zhì)產(chǎn)量、纖維素 含量 、半纖維素 含量和酒精產(chǎn) 量顯著 相關的 生長 指標，以期確定能夠預測紫花苜蓿 莖細胞壁纖維素含量、半纖維素含量 和酒精產(chǎn)量的 形態(tài)學 指標 ，為快速經(jīng)濟預測紫花苜蓿生物能源性狀提供科學依據(jù) 。 蘭州大學碩士學位論文 紫花苜蓿種質(zhì)生物 質(zhì) 能源性狀評價及其莖 細 胞 壁木質(zhì)素沉積特性研究 25 料與方法 驗地 概況 試驗地點為甘肅省張掖實驗站（ 9720 E， 3957 N）進行，該地區(qū)海拔 1405m，年日照總時數(shù) 2869h，無霜期 112d，降水量 1220 年積溫 3470 ，年均氣溫 7 。 每年 4 月中旬灌溉施肥，并在每次刈割后灌溉 。 驗 材料 選擇 7 種生物能源性狀較為優(yōu) 良的紫花苜蓿品種 和具有 匍匐生長 習性的 的金達萊苜蓿 為試驗材料 （ 表 3。 表 3苜蓿品種編號、名稱及其來源 of 號 稱 源 拉達克 5 意大利 1 牧歌 2 金達萊 5 黃羊鎮(zhèn) 1 熊岳 5 大郁山 0 甘農(nóng) 1 號 : 中國農(nóng)業(yè)科學院草原研究所 ; 甘肅農(nóng)業(yè)大學 ; 蘭州西部草業(yè)工程技術研究有限公司 驗設計 試驗于 2011 年 4 月在溫室育苗， 5 月上旬移栽至試驗地，試驗地設置 5 個小區(qū)，每個小區(qū)每個品種 5 個重復，行距 距 別于盛花期 、 綠莢期 和 褐莢期 3 個生長期進行刈割收獲 ，分析 不同收獲時期對紫花苜蓿莖細胞壁纖維素、半纖維素 及酒精產(chǎn)量的影響，并 探究生長指標和細胞 壁多糖含量和理論酒精產(chǎn)量之間的關系 。 長指標測定 每次收獲測定 苜蓿品種的 株高 、 分枝數(shù) 、 側枝數(shù) 、 莖粗 、 節(jié)間數(shù) 、 第 5 節(jié)間、第 6 節(jié)間和第 7 節(jié)間 的 長 度 和 直徑 ，最長節(jié)間 長度 及所在節(jié)間位置 （由底部 節(jié)間開始算起） ，莖 、 葉分離后分別測定 莖鮮重和葉鮮重，之后至于 80 烘箱中烘干至恒重，測定莖干重和葉干重（ 花和種莢歸入葉 ） 。 維素和半纖維素測定 紫花苜蓿莖干樣粉碎 后 過 40 目篩，參照波欽諾克（ 1981）的方法對纖維素蘭州大學碩士學位論文 紫花苜蓿種質(zhì)生物 質(zhì) 能源性狀評價及其莖 細 胞 壁木質(zhì)素沉積特性研究 26 含量 和半纖維素含量進行測定。 纖維素 含量 測定方法：稱取 g 生物質(zhì)干樣， 裝入離心管加入硝酸和醋酸混合液 5 住離心管沸水中煮沸 25 心棄上清液，并用蒸餾水洗滌沉淀 3 次，加入重鉻酸鉀 和 濃硫酸 的 混合液 10 入沸水浴中煮沸 10 定期攪拌，冷卻后倒入錐形瓶中加入 20%碘化鉀 5 入淀粉 溶液 2 ，用0.2 硫代硫酸鈉反滴定，并作不加干樣的空白試驗。并用下式計算纖維素含量： X%=（ ， X%：留待硫酸鈉含量 ， K：硫代硫酸鈉濃度 （ ） ， a：空白消耗留待硫酸鈉體積 （ ， b： 試樣消耗的留待硫酸鈉體積 （ 。 半纖維素 含量 測定方法：稱取 烘干 的生物質(zhì)粉末 小燒杯中加入 15 0%的硝酸鈣溶液，在慢慢沸騰下加熱 5 步離心，用 10 水洗滌沉淀三次，加入 2 的鹽酸 10 水浴下煮沸 45 心，取上清液，殘渣用 10 餾水沖洗 3 次，歸入上清液中，加入 1 滴酚酞，用 2 的氫氧化鈉中和至顯橙紅色，轉入 100 容量瓶，稀釋至刻度，過濾，取 10 液，加入 10 性銅，蓋好后于沸水中煮沸 15 卻，加入 5 酸和硫酸混合液，加入 0.5 粉，用 硫代硫酸鈉溶液滴定至藍色消失，并作空白作為對照。并用下式計算半纖維素含量： X%=00 248-（ （ 10n 其中， X%：半纖維素含量 ， a：空白消耗的留待硫酸鈉體積 （ ， b：待測液消耗的留待硫酸鈉體積 （ 。 論酒精產(chǎn)量 利用生物質(zhì)產(chǎn)量、纖維素含量和半纖維素含量結合其轉化效率，可以計算其理論酒精產(chǎn)量（謝光輝， 2011），公式如下： 1000 其 中， 理論酒精產(chǎn)量（ L/ 纖維素和半纖維素含量（ %）， t/ 糖轉化為酒精的轉化系數(shù) 轉化效率 3 為糖化系數(shù) 為酒精密度。 據(jù) 分析 所有 試驗數(shù)據(jù)用均值標準誤表示，采用 件進行 生物質(zhì)產(chǎn)量、纖維素含量、半纖維素含量和酒精產(chǎn)量等 指標 的 差異顯著性分析 和 并對生長指標和生物能源性狀的 相關性 進行 分析 ， 表 3 表 3不同 處理 苜蓿 生物量、纖維素 產(chǎn)量、半纖維素產(chǎn)量和 酒精產(chǎn)量 的多 因素方差 分析 of of of 狀 變異來源 自由度 均方 P 值 莖產(chǎn)量 品種（ A） 7 38933 在形態(tài)學指標中，酒精產(chǎn)量與節(jié)間數(shù)呈現(xiàn)極顯著負相關性，與最長節(jié)間位置呈現(xiàn)顯著相關，與其它指標呈現(xiàn)極顯著正相關關系，其中和株高、第 1分枝數(shù)、第 5節(jié)間粗和第 6節(jié)間粗的皮爾遜相關系數(shù)均高于 見這幾個指標對于預測酒精產(chǎn)量具有重要的價值。 論 栽培管理措施對紫花苜蓿的生物質(zhì)產(chǎn)量、 細胞壁 多糖含量及酒精產(chǎn)量均具有顯著影響（ et 2007）。 2008）等研究發(fā)現(xiàn)盛花期與孕蕾期相比，細胞壁含量、纖維素含量和木質(zhì)素含量分別 增加 6%、 8%和 20%，而半纖維素、果膠、可溶性糖含量差異不顯著， 從高溫熱解角度考慮， 隨著成熟紫花苜蓿蘭州大學碩士學位論文 紫花苜蓿種質(zhì)生物 質(zhì) 能源性狀評價及其莖 細 胞 壁木質(zhì)素沉積特性研究 33 生物燃料產(chǎn)量增加， 且 更成熟的苜蓿有利于能量的回收。本試驗在前人研究的基礎上 （ et 2007） ，增加收獲處理，由前人 2個收獲時期處理增加為 3個，并且使紫花苜蓿收獲更加延遲，即褐莢期收獲。從紫花苜蓿生物能源利用出發(fā)，探究不同收獲時期對紫花苜蓿生物質(zhì)產(chǎn)量、纖維素 產(chǎn)量 、 半纖維素 產(chǎn)量 和 酒精產(chǎn)量的影響。 延遲收獲可獲得較高的生物質(zhì)產(chǎn)量，盛花期與初花期收獲相比生物質(zhì)產(chǎn)量增加 12%（ et 2011）， 2003）等研究發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿 綠莢期 收獲可獲得最高的生物質(zhì)材料，本試驗研究發(fā)現(xiàn) 綠莢期 收獲可獲得最高的葉產(chǎn)量和較高的莖產(chǎn)量， 褐莢期可獲得最高的莖生物質(zhì)產(chǎn)量，其中僅有大郁山苜蓿在褐莢期收獲莖、葉產(chǎn)量均最大化，不僅有利于生物質(zhì)生產(chǎn)，并且還可以獲得最高的葉產(chǎn)量，為符合生物質(zhì)型苜蓿選育標準之一。 紫花苜蓿生物質(zhì)能源生產(chǎn)不僅需要高生物質(zhì)產(chǎn)量，還需要 生產(chǎn)材料含有 高 的細胞壁 多糖含量。 2007）等研究發(fā)現(xiàn)延遲收獲使得生物質(zhì)的細胞壁含量增加 6%（現(xiàn)蕾初期：綠莢期），葡聚糖和木聚糖含量顯著增加， 其中木聚糖增加 4%。 2011）等研究發(fā)現(xiàn) 盛花期收獲與初花期收獲相比纖維素含量均增加 12%。本研究發(fā)現(xiàn)半纖維素 產(chǎn)量 隨收獲時期的延遲呈現(xiàn)增加趨勢， 這與以上研究結果一致， 且各個收獲之間存在顯著差異 （ ， 最長節(jié)間長在先前試驗中很少涉及 ， 而 有可能為半纖維素含量作出預測 。 運用形態(tài)學指標對紫花苜蓿酒精產(chǎn)量進行預測， 使得 優(yōu)良生物質(zhì)型紫花苜蓿能夠快速、大通量篩選。本試驗研究的所有形態(tài)學指標均與酒精產(chǎn)量呈現(xiàn)顯著或極顯著相關，但與半纖維素含量相關性不顯著，酒精產(chǎn)量與株高、第 1分枝數(shù)、第 5節(jié)間粗、第 6節(jié)間粗等形態(tài)學 指標的皮爾遜相關系數(shù)均高于 更好的解釋酒精產(chǎn)量，應是生物質(zhì)型苜蓿選育的指標，節(jié)間數(shù)和酒精產(chǎn)量呈現(xiàn)極顯著負相關，在紫花苜蓿選育的過程中應選擇植株高大、分枝數(shù)多、第 5、 6節(jié)間粗、節(jié)間數(shù)少的植株。 蘭州大學碩士學位論文 紫花苜蓿種質(zhì)生物 質(zhì) 能源性狀評價及其莖 細 胞 壁木質(zhì)素沉積特性研究 35 第四章 苜蓿 莖細胞壁 木質(zhì)素和果膠質(zhì) 沉積特性 言 生物能源作為重要的可再生能源之一，具有可再生，原材料豐富，降低溫室氣體排放，減少污染等優(yōu)點（ et 2011）。其中 木質(zhì)纖維素 類 是一種低成本的生物燃料生產(chǎn)原料，近年來科研工作者對木質(zhì)纖維素轉化為液體燃料和其它化學產(chǎn)品的研究和 探索做了大量工作 （ et 2006； Pu et 2008） 。木質(zhì)纖維素類生產(chǎn)酒精等液體燃料的難點在于木質(zhì)素的存在對纖維素和半纖維素多糖的糖化酵解具有拮抗作用，使得木質(zhì)纖維素轉化為液體燃料的成本顯著高于淀粉生產(chǎn)酒精（ et 2004； 2005）。因此，克服木質(zhì)纖維素轉化為液體燃料的障礙，降低轉化成本是木質(zhì)纖維素生產(chǎn)液體燃料的主要探究方向之一。 通過降低木質(zhì)素含量或改變木質(zhì)素的結構可以降低預處理的成本，并能增加酶解效率，從而促 進生物燃料生產(chǎn)（ Pu et 2009）。木質(zhì)素主要由紫丁香基木質(zhì)素（ S），愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（ G），對 H）組成，其中前 S 木質(zhì)素和 G 木質(zhì)素是草類植物的主要組成成分。由于 S 木質(zhì)素 5 號碳位置為甲氧基不一形成碳鏈，而， G 木質(zhì)素 5 號 碳位置沒有連接的碳使得其更容易形成碳鏈，因此改變 S/G 比值可以減少木質(zhì)素碳鏈長度，從而增加其可分解性 （ 李貞等，2009） 。 紫花苜蓿木質(zhì)素沉積和發(fā)育時期，植株部位密切相關，并且果膠質(zhì)的沉積隨紫花苜蓿的成熟逐漸降低（ et 2002），同一部位不同組織的 木質(zhì)化程度也存在差異（ et 1998）。 由于不同組織木質(zhì)化程度不同，使得組織間降解性存在差異，而品種間不同組織分配比例或木質(zhì)化程度差異可能是引起降解性不同的原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，降解性不同的柳枝稷（ .）品種，木質(zhì)化組織分配比例存在顯著不同（ et 2005）。 木質(zhì)素生物合成是其相關基因時空特異表達的結果，有研究表明通過轉基因等技術可以調(diào)控其時空表達結果，進而獲得所需的轉基因植株（ et 2011； et 2011）。有研究表明利用轉基因手段 強烈抑制木質(zhì)素合成基因表達后 ， 有些植株會出現(xiàn)直立生長習性喪失 （ et 2009）。紫花苜蓿品種眾多，種質(zhì)資源復雜。在現(xiàn)有紫花苜蓿種質(zhì)中直立生長 習性 也存在差異，如直立生長和匍匐生長習性的苜蓿品種，此外苜蓿品種還存在多年生和一年生種質(zhì)，其中一年生的蒺藜苜蓿常作為豆科植物的模式植物來研究。不同習性的苜蓿種質(zhì)的木質(zhì)素單體沉積 特性 是否存在差異，沉積部位 是否不同 ，兩種木質(zhì)素單體沉積部位及 特性 是否存在差異？ 蘭州大學碩士學位論文 紫花苜蓿種質(zhì)生物 質(zhì) 能源性狀評價及其莖 細 胞 壁木質(zhì)素沉積特性研究 36 本文對牧歌（多年生直立生長）、金達萊（多年生匍匐生 長）、蒺藜苜蓿（一年生匍匐生長，模式植物） 3 種苜蓿材料 的 S 木質(zhì)素、 G 木質(zhì)素和果膠質(zhì)在不同發(fā)育 時期、不同生長部位及不同組織的沉積 特性 進行 觀察 研究 ， 以期 從細胞學角度出發(fā) 通過生物化學染色方法，對 不同 苜蓿的木質(zhì)素和果膠質(zhì)沉積 特性 進行研究， 發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素單體 和果膠質(zhì) 合成在不同種質(zhì)和發(fā)育時期的特異合成，探討其沉積的共性及不同，為苜蓿木質(zhì)素沉積模式的建立提供參考，為進一步木質(zhì)素 單體和果膠質(zhì)的 合成調(diào)控研究提供依據(jù)。 料與方法 驗材料 試驗材料為牧歌、金達萊和蒺藜苜蓿 3 個苜蓿品種，牧歌為多年生直立生長紫花 苜蓿商業(yè) 品種 ，金達萊為多年生匍匐生長 品種 ，蒺藜苜蓿為一年生匍匐生長品種 ，且 蒺藜苜蓿 為豆科植物 的 模式植物。 驗設計 2012 年 5 月 10 日在育苗盤種育苗，兩周后移栽至 15 15 盆中，試驗用土壤為營養(yǎng)土 :大田土 :細沙 =2:1:1（體積比） ， 機質(zhì)含量 全氮含量 全磷含量 堿解氮 mg/效磷 mg/能溫室 光照時間 16h/d，光照強度 600 m2s，相對濕度 50白天溫度24，夜間溫度 18。 圖 4紫花苜蓿上部（ T） 、 中部（ M） 和 底部（ B）節(jié)間 示意圖 of T), M) B) of 照 1981） 的苜蓿分級標準 ，分 7 個時期對參試材料進行染色觀察： 1）株高為 15右，不現(xiàn)蕾， 2）株高為 30右，不現(xiàn)蕾， 3）現(xiàn)蘭州大學碩士學位論文 紫花苜蓿種質(zhì)生物 質(zhì) 能源性狀評價及其莖 細 胞 壁木質(zhì)素沉積特性研究 37 蕾期，小花未開放 ， 4）初花期，莖上有 1花絮開花， 5）盛花期，莖上有 36）綠莢期， 1 到 3 個花柄結莢（或花柄上小花風干或脫落）， 7）褐莢期，出現(xiàn)褐色種莢（或 3 個以上花柄小花風干或脫落）。對苜蓿上部（ 中部（ 底部（ 間（圖 4樣徒手切片，挑選厚度一致的切片進行組織化學染色，然后在光學和熒光顯微鏡下觀察，拍照。 織化學染色方法 木質(zhì)化加厚 的 細胞壁在紫外光照射下 發(fā)生 自體熒光 現(xiàn)象 ，利用細胞壁的該性質(zhì)對紫花苜蓿莖切片在熒光顯微鏡下觀察，可確定苜蓿莖細胞壁加厚 的組織（ et 2009） ；愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（ G 木質(zhì)素）觀察，用 間苯三酚 混合液染色 12 去多余染液，固定在 50%甘油（ v/v）中觀察， G 木質(zhì)素存在的部位被染成紅色 （ 1962； et 1998） ；紫丁香基木質(zhì)素（ S 木質(zhì)素）觀察，首先 將切片放置在 4%的戊二醛中 60 水沖洗， 理 10 水沖洗，再用 10%的鹽酸處理 5 水沖洗，固定在氨水中進行紫丁香基木質(zhì)素（ S 木質(zhì)素）觀 察 ， S 木質(zhì)素被染成紅色（ 1901； et 2005） ； 果膠質(zhì)沉積觀察， 切片 用 紅染色 10 流動自來水上沖洗 10 定在 50%甘油，用于 果膠質(zhì)沉積 部位 的觀察 （ 1962； et 1998） 。 果 苜蓿木質(zhì)素單體及果膠質(zhì)沉積 在不同 發(fā)育時期 、不同 節(jié)間位置 、不同 品種間存在差異 ， 品種間 共同之處 本文以紫花苜蓿牧歌進行介紹，存在差異之處單獨列出，用于比較分析。 同發(fā)育時期木質(zhì)素及果膠質(zhì)沉積 特性 隨 苜蓿 發(fā)育 木 質(zhì)化程度 呈 加重 趨勢 ，在 15 初生木質(zhì)部和初生韌皮部被木質(zhì)化 。 從 15 30 質(zhì)部 快速 加厚，并且加厚的木質(zhì)部全部 被 木質(zhì)化，此時靠近木質(zhì)部的髓 薄壁 細胞開始木質(zhì)化 。 從營養(yǎng)生長 后期（ 30 至現(xiàn)蕾期木質(zhì)部也有加厚，加 厚的木質(zhì)部也 全部被木質(zhì)化，靠近木質(zhì)部的髓 薄壁細胞木質(zhì)化趨勢向髓中心部位拓展 ， S 木質(zhì)素和 G 木質(zhì)素沉積部位相同，變化趨勢一致 ，可見在苜蓿中兩種木質(zhì)素單體共同參與木質(zhì)化進程 ?，F(xiàn)蕾期 后 莖的木質(zhì)部基本不再加粗， 此時木質(zhì)化組織明確， 主要存在于初生韌皮部、初生木質(zhì)部和次生木質(zhì)部，髓細胞僅靠近木質(zhì)部 的部位有木質(zhì)素沉積，內(nèi)部髓細胞均沒有木質(zhì)素沉積。從現(xiàn)蕾期開始，初花期、盛花期、 青 莢期 的木質(zhì)化程度及趨勢基本沒有變化，均 蘭州大學碩士學位論文 紫花苜蓿種質(zhì)生物 質(zhì) 能源性狀評價及其莖 細 胞 壁木質(zhì)素沉積特性研究 38 圖 4牧歌苜蓿不同發(fā)育時期莖底部節(jié)間橫切圖 A、 D、 為 15B、 E、 為盛花期， C、 F、 為褐莢期。 A、 ，紫外光激發(fā)木質(zhì)素自體熒光，藍色熒光指示木質(zhì)化且次生壁加厚部分； D、 ，間苯三酚 色指示 G、 ，莫氏染色，紅色指示 J、 ，釕紅染色，紅色指示果 膠質(zhì)沉積部位。 c：形成層； 色組織； 角組織； 生韌皮部； 生韌皮部； 生木質(zhì)部； 生木質(zhì)部。圖中標尺為 200 m。 at , D, G 5B, E, H at C, F, I at A, B : of V D, E : G, H : G, K : of c, 00 m 與現(xiàn)蕾期相似。生長至褐莢期后， S 木質(zhì)素和 G 木質(zhì)素均在髓的中心 細胞沉積，此時髓細胞木質(zhì)化已擴展至中心，但表皮、厚角組織、綠色組織、分生組織、次生韌皮部和髓分生組織均沒有木質(zhì)素沉積，這些組織生長至褐莢期仍沒有被木質(zhì)化，這些組織的比例將直接影響苜蓿莖木質(zhì)化細胞壁比例，進而影響生物質(zhì)能源生產(chǎn)的效率。此外探究褐莢期髓中心細胞壁的迅速木質(zhì)化，對于探究木質(zhì)化機蘭州大學碩士學位論文 紫花苜蓿種質(zhì)生物 質(zhì) 能源性狀評價及其莖 細 胞 壁木質(zhì)素沉積特性研究 39 理，及木質(zhì)化的調(diào)控方式具有重要意義。 從 15 始至褐莢期，紫花苜蓿果膠質(zhì)沉積部位主要集中在表皮、厚角組織、形成層、次生韌皮部和髓分生組織等這些未被木質(zhì)化的組織。生長至盛花期果膠質(zhì)沉積減少，但綠莢期和褐莢期的果膠質(zhì)沉積有 增多趨勢，其中盛花期髓細胞壁已無果膠質(zhì)沉積，綠莢期和褐莢期的髓細胞壁有較多果膠質(zhì)的沉積，其變化趨勢為從營養(yǎng)生長至盛花期果膠質(zhì)沉積逐漸減少，而生長至莢期后果膠質(zhì)沉積又呈現(xiàn)增加趨勢。木質(zhì)素沉積的部位為初生木質(zhì)部、次生木質(zhì)部和初生韌皮部，隨發(fā)育進行髓薄壁細胞木質(zhì)化面積逐漸增加，果膠質(zhì)沉積部位與木質(zhì)化部位不同，主要集中在表皮、厚角組織、形成層、髓分生組織和部分髓薄壁組織。這些組織僅有木質(zhì)素或果膠質(zhì)一種物質(zhì)沉積，可見木質(zhì)素和果膠質(zhì)的沉積在組織間具有選擇性。綠色組織是唯一未被木質(zhì)化，且沒有果膠質(zhì)沉積的組織。 同節(jié)間位置木質(zhì)素及果膠質(zhì)沉積觀察 紫花苜蓿不同節(jié)間位置木質(zhì)素沉積存在顯著不同（ et 2002），與發(fā)育時期相對應，苜蓿莖不同生長部位組織果膠質(zhì)和木質(zhì)素沉積及次生壁加厚顯著 不同。不同節(jié)間位置以下部節(jié)間最為成熟，木質(zhì)素沉積多，果膠質(zhì)沉積少，上部節(jié)間果膠質(zhì)沉積多，木質(zhì)素沉積少。 S 木質(zhì)素和 G 木質(zhì)素沉積狀況基本一致，在上部節(jié)間 S 木質(zhì)素沉積較少，僅在初生木質(zhì)部的少數(shù)細胞有沉積， G 木質(zhì)素在木質(zhì)部的沉積面積高于 S 木質(zhì)素，并且在初生韌皮部沒有觀察到 S 木質(zhì)素的沉積， 下部 節(jié)間兩種木質(zhì)素單體沉積無差異。以牧歌初花期為例，筆者對初花期苜蓿莖不同位置節(jié)間進行顯微觀察發(fā)現(xiàn)，上部節(jié)間僅初生木質(zhì)部和初生韌皮部的少數(shù)細胞出現(xiàn)木質(zhì)化，其它各部位均未出現(xiàn)木質(zhì)素沉積，上部節(jié)間含有較高的果膠質(zhì)，各組織均有果膠質(zhì)沉積，可見上部節(jié)間新陳代謝較為活躍，與中下部節(jié)間相比，上部節(jié)間髓細胞所占的比例較大；中部節(jié)間髓薄壁組織靠中心部分、形成層、厚角組織和綠色組織均未出現(xiàn)木質(zhì)素沉積和次生壁加厚，且含有較高的果膠質(zhì)成分，初生木質(zhì)部、次生木質(zhì)部、初生韌皮部和靠近木質(zhì)部髓薄壁組織出現(xiàn)木質(zhì)化，這些組織果膠質(zhì)含量較低，木 質(zhì)部和綠色組織沒有果膠質(zhì)的沉積，但在初生木質(zhì)部間隙的髓射線細胞仍含有較多的果膠質(zhì)，木質(zhì)部所占比例增加，髓所占比例減少，并且木質(zhì)化趨勢由木質(zhì)部向髓擴展；底部節(jié)間大部分組織都被木質(zhì)化，木質(zhì)部所占比例進一步擴大，并全部被木質(zhì)化，髓組織所占比例縮小也被木質(zhì)化，初生韌皮部仍被木質(zhì)化，這些木質(zhì)化的區(qū)域基本沒有果膠質(zhì)的沉積，形成層、厚角組織、次生韌皮部和綠色組織未被木質(zhì)化，并且形成層、厚角組織和髓分生組織富含果膠質(zhì)，一般被木質(zhì)化的組織沒有果膠質(zhì)的沉積，但綠色組織除外，綠色組織不僅沒有木質(zhì)素沉積，并且在中下部節(jié)間蘭州大學碩士學位論文 紫花苜蓿種質(zhì)生物 質(zhì) 能源性狀評價及其莖 細 胞 壁木質(zhì)素沉積特性研究 40 沒有觀察到 果膠質(zhì)的沉積（圖 4 圖 4蓿初花期不同節(jié)間位置莖橫切示頂部（ T）、中部（ M）和底部（ B）節(jié)間細胞壁成分 A、 ，紫外光激發(fā)木質(zhì)素自體熒光，藍色熒光指示木質(zhì)化且次生壁加厚部分； B、 ，間苯三酚 色指示 C、 ，莫氏染色，紅色指示 D、 ，釕紅染色，紅色指示果膠質(zhì)沉積部位。 c：形成層； 色組織； 角組織； 生韌皮部； 生韌皮部； 生木質(zhì)部； 生木 質(zhì)部。圖中標尺為 200 m。 of at T), M) B) A, E : of V B, F : G, G : D, H : of c, 00 m. 同苜蓿 品種間 木質(zhì)素及果膠 質(zhì) 沉積 特性 差異 研究 不同苜蓿種質(zhì)木質(zhì)素和果膠質(zhì)沉積 特性 基本相同，但也存在不同之處。三種紫花苜蓿的木質(zhì)素沉積差異主要體現(xiàn)在髓的沉積時期及沉積范圍不同，牧歌直至生長至褐莢期其髓全部木質(zhì)化，并且從 30始與木質(zhì)部 靠近的髓細胞已經(jīng) 開始 木質(zhì)化；蒺藜苜蓿的生長趨勢與牧歌相似，其不同主要體現(xiàn)在髓的木質(zhì)化范圍，蒺藜苜蓿髓細胞壁僅有少數(shù)和髓分生組織臨近的細胞被木質(zhì)化，并且這一現(xiàn)象一直到褐莢期，即蒺藜苜蓿從營養(yǎng)生長至褐莢期大部分髓細胞沒有木質(zhì)素沉積，僅有少數(shù)的靠近髓分生組織的少數(shù)細胞壁有木質(zhì)素沉積。金達萊苜蓿 與苜蓿木質(zhì)化趨勢相似 ， 而其髓較早 被木質(zhì)化， 15近木質(zhì)部的細胞就出現(xiàn)木質(zhì)化現(xiàn)象，而牧歌苜蓿發(fā)育至 30 才有木質(zhì)素在髓細胞沉積，金達萊苜蓿生長至初花期蘭州大學碩士學位論文 紫花苜蓿種質(zhì)生物 質(zhì) 能源性狀評價及其莖 細 胞 壁木質(zhì)素沉積特性研究 41 其髓中心薄壁細胞已被木質(zhì)化，一直延續(xù)至褐莢期。其它組織的木質(zhì)化趨勢在 三種苜蓿間沒有顯著的不同。果膠質(zhì)的沉積在三種苜蓿間沒有明顯的不同，果膠質(zhì)沉積部位在三種苜蓿的各個時期都沉積在新陳代謝活躍的分生組織 和 厚角組織