密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 百菌清降解菌的篩選及其降解特性研究 of a of a 要 為有效控制因化學(xué)農(nóng)藥“百菌清”大量應(yīng)用而導(dǎo)致的農(nóng)田土壤和農(nóng)產(chǎn)品污染問(wèn)題，本研究開(kāi)展了該化學(xué)農(nóng)藥的微生物降解研究?，F(xiàn)將對(duì)所分離到的一株對(duì)百菌清具有高效降解能力的菌株的生物學(xué)特性、降解能力、降解譜、降解中間產(chǎn)物等簡(jiǎn)要介紹如下： 1、通過(guò)加富培養(yǎng)法富集、培養(yǎng)，從所采土樣中共得到 30株耐受菌株， 其中菌株 形成明顯的降解圈。通過(guò)高效氣相色譜（ 該菌株進(jìn)行了降解能力測(cè)定，結(jié)果表明：在無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中（接菌菌體終濃度為 1107 30， 180r/天，百菌清（ 50）的平均降解率為 2、通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化特征測(cè)定和 16列分析，確定菌株 對(duì)生長(zhǎng)條件的研究結(jié)果表明， 該菌株的適宜生長(zhǎng)溫度為 30 ,適宜 株搖瓶培養(yǎng)適宜的碳源為葡萄糖，有機(jī)氮源為牛肉膏，無(wú)機(jī)氮源為草酸銨，適宜的 C/。 3、應(yīng)用高效液相色譜（ 定了菌株 果表明所用技術(shù)體系對(duì)土壤中添加百菌清后的回收率在 達(dá)到了農(nóng)藥殘留提取標(biāo)準(zhǔn)要求。將菌株以 1070百菌清的滅菌土壤中，室溫培養(yǎng) 24 小時(shí)后百菌清的平均 降解率可達(dá) 第 3 天 后 達(dá) 一周后可達(dá) 4、降解譜測(cè)定結(jié)果表明， 氯硝基苯、 六六六、 唑磷、甲基對(duì)硫磷、苯胺和苯酚或降解效果不明顯。 5、 將 30 ， 180r/天的培養(yǎng)液以正己烷：異丙醇：甲醇體積比 5： 3： 2為展開(kāi)劑，經(jīng)硅膠薄層層析（ 離， 并 收集 254 下 的分離 斑 ，以 甲醇溶解 和 自然濃縮后，利用高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) (析鑒定 ， 獲得兩種降解產(chǎn)物，分別為 1,3四氯苯和 4三氯苯二腈（ 。 推測(cè) 基水合作用和羥基化作用兩種途徑降解百菌清。 該研究 對(duì)百菌清殘留土壤和環(huán)境的生物修復(fù) 具有重要意義。 關(guān)鍵詞： 百菌清，生物降解，蒼白桿菌，生物學(xué)特性，代謝產(chǎn)物 n to to a is a in to 1. A of in a on 0 as By it PN by of 0 , 180 in 2. in of 6s pH 0 .0 1% 1% % : N ( PN in of in PN 0 by 107g 1. 4% 4 h, . of it 5. of 0 by :3:2 as v/v). of 254 in by ,3,5,6,6 It of of V 目 錄 第一章 緒論 . 1 究背景 . 1 . 1 機(jī)氯農(nóng)藥微生物降解研究進(jìn)展 . 1 菌清及其降解代謝研究進(jìn)展 . 7 . 9 究的主要內(nèi)容及技術(shù)路線(xiàn) . 10 . 10 . 11 第二章 百菌清高效降解菌的分離與篩選 . 12 . 12 . 12 試土樣 . 12 養(yǎng)基 . 12 要儀器 . 13 . 13 . 13 . 13 富培養(yǎng)法） . 13 . 14 . 14 . 15 . 15 然土壤中固有微生物耐受百菌清濃度的測(cè)定 . 15 解菌的分離 . 15 解菌在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上對(duì)百菌清的降解能力 . 16 解菌株對(duì)百菌清降解能力的測(cè)定 . 16 論與討論 . 18 第三章 百菌清高效降解菌株的鑒定 . 20 . 20 株 . 20 養(yǎng)基 . 20 驗(yàn)儀器 . 20 劑 . 20 法 . 21 形態(tài)特征 . 21 理生化特征 . 22 6S 因序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析 . 23 . 26 態(tài)特征 . 26 理生化特征 . 26 6S 因序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析 . 27 論與討論 . 30 第四章 不同條件對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響 . 32 料 . 32 法 . 32 子液配制 . 32 定方法 . 32 度對(duì) . 32 . 32 液量對(duì) . 33 養(yǎng)對(duì) . 33 據(jù)處理 . 33 果 . 33 度對(duì) . 33 . 34 液量對(duì) . 35 養(yǎng)對(duì) . 35 論與討論 . 37 第五章 解百菌清中間產(chǎn)物的測(cè)定 . 38 料 . 38 . 38 解譜的測(cè)定 . 38 解中間產(chǎn)物的鑒定 . 39 果 . 39 解譜的測(cè)定 . 39 解中間產(chǎn)物的鑒定 . 40 論與討論 . 43 第六章 . 45 . 45 . 45 . 45 壤中百菌清添加回收率的測(cè)定 . 45 土壤中百菌清的降解效果測(cè)定 . 45 果 . 46 . 46 菌清在土壤中的添加回收率 . 47 土壤中百菌清的降解效果測(cè)定 . 47 論與討論 . 48 第七章 全文總結(jié) . 49 參考文獻(xiàn) . 51 致謝 . 58 作者簡(jiǎn)歷 . 59 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒 論 究背景 在過(guò)去的 50 年里 ， 環(huán)境污染尤其是土壤的污染已受到科學(xué)界和大眾的廣泛關(guān)注。 工業(yè)生產(chǎn)釋放的廢物、現(xiàn)代交通運(yùn)輸工具排放的廢氣以及有機(jī)農(nóng)藥使用造成的殘留等 ， 使土壤圈越來(lái)越多地被 外來(lái) 化合物污染并且大大超過(guò)了環(huán)境的 自?xún)裟芰Α?有機(jī)氯農(nóng)藥是歷史上最早大規(guī)模使用過(guò)的高殘毒農(nóng)藥，使用時(shí)間長(zhǎng)，雖然經(jīng)過(guò)近 20 年的自然降解，土壤環(huán)境中的殘留量仍十分 可 觀。農(nóng)藥殘留微生物降解技術(shù)是通過(guò)在土壤中接種高效降解性微生物，原位消除土壤中的農(nóng)藥殘留，降低土壤中農(nóng)藥污染物的 量 ，從而減少進(jìn)入作物體內(nèi)的農(nóng)藥。本技術(shù)投入低、效率高，已經(jīng)在無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中得到應(yīng)用，是一項(xiàng)已經(jīng)獲得民眾認(rèn)可的、可操作性強(qiáng)的無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)技術(shù)。目前生物降解技術(shù)已廣泛用于土壤、水體、海灘的污染治理。 機(jī)氯農(nóng)藥的生物致毒性及其殘留 有機(jī)氯農(nóng)藥自上世紀(jì) 70 年代在 全球范圍內(nèi)陸續(xù)被禁用，但它們不易分解且具有強(qiáng)脂溶性，能通過(guò)食物鏈在生物體包括人體內(nèi)富集，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人類(lèi)健康造成威脅。有機(jī)氯的慢性毒理作用主要表現(xiàn)在影響神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和侵害肝臟、腎臟，可引起肌肉震顫、內(nèi)分泌紊亂、肝腫大、肝細(xì)胞變性和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等病變（ 2001）；不但影響本代，而且可能影響后代。據(jù)報(bào)道，它們使女性患乳腺癌、子宮癌和子宮內(nèi)膜疾病的危險(xiǎn)明顯增加 (1998; 1998)。近年研究也表明，它們?cè)趧?dòng)物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物具有類(lèi)似于性激素的作用，影響動(dòng) 物正常生理活動(dòng)，有 環(huán)境激素 之稱(chēng) (吳德生 ， 2001)。 因有機(jī)氯農(nóng)藥的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定 ， 同時(shí)受到各種自然環(huán)境及耕作制度的制約 。 土壤中的有機(jī)氯農(nóng)藥殘留期極長(zhǎng)，據(jù)報(bào)道 95%的六六六在土壤中被分解，最長(zhǎng)需要 20 年， 分解 95%需 30年 (劉廣民 等 ， 2001)。劉廣民等對(duì)吉林省西部松原地區(qū)農(nóng)田土壤中的有機(jī)氯農(nóng)藥進(jìn)行了研究，雖然停產(chǎn)、停用有機(jī)氯類(lèi)農(nóng)藥幾十年 ， 但六六六殘留的最高值可以達(dá)到 60ng/廣民 等 ， 2001)。有機(jī)氯農(nóng)藥通過(guò)土壤被植物吸收殘留在植物內(nèi)，并通過(guò)食物富集對(duì)人體健康產(chǎn)生威脅。郝桂明等（ 2001） 對(duì) 10 種茶葉中的有機(jī)氯含量進(jìn)行了測(cè)定，其中，農(nóng)藥的殘留量超過(guò)國(guó)家規(guī)定的有四種，占樣品總數(shù)的 40%。張曙明等（ 2000）測(cè)試了黃芪、三七和西洋參中 15 種有機(jī)氯農(nóng)藥的殘留量，結(jié)果表明各被測(cè)樣品中均含有有機(jī)氯農(nóng)藥的殘留。加強(qiáng)有機(jī)氯農(nóng)藥在土壤環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化、分布模式以及微生物降解等方面的研究，從而提出有效的控制和治理方法成為人們研究的熱點(diǎn)。 機(jī)氯農(nóng)藥微生物降解研究進(jìn)展 國(guó)外對(duì)農(nóng)藥微生物降解的相關(guān)研究主要集中在以下幾個(gè)方面：農(nóng)藥降解菌的分離、特性、對(duì)土壤和水體的生物修復(fù)、對(duì)農(nóng)藥的降解途徑、降解 動(dòng)態(tài)、降解酶的研究、利用固定化酶和固定化細(xì)胞進(jìn)行水體和土壤的修復(fù)、化合物結(jié)構(gòu)與降解能力的關(guān)系、外界條件對(duì)降解菌降解能力的影響、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 2 降解農(nóng)藥的分子機(jī)理、降解基因的檢測(cè)、分離和穩(wěn)定性研究、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移、工程菌構(gòu)建及其表達(dá)特性（虞云龍 等 ,1998; et 1976; 崔中利 等 ,2002；蔡烈偉， 1999；羅啟芳 ,1996; et 1995; 994; 986; et 1995；王永杰 等 ,1999；阮少江 等，2000）、降解基因及構(gòu)建工程菌的研究（ et 1976; 呂澤勛 等 , 1993; 崔中利 等 , 2002）。國(guó)內(nèi)目前對(duì)降解有機(jī)磷農(nóng)藥 和除草劑 的細(xì)菌的研究較深入，包括降解菌株的獲得、降解酶的純化、降解酶基因的克隆以及降解菌的田間應(yīng)用等。而對(duì)于有機(jī)氯的研究相對(duì)較少，研究多局限于菌株及生理特性的研究。 機(jī)氯農(nóng)藥降解菌的獲得途徑與鑒定 目前，可降解農(nóng)藥的微生物的獲得途徑主要有：從受農(nóng)藥污染嚴(yán)重的土壤中篩選分離具有優(yōu)良性狀的菌種；定向培育優(yōu)良菌種；在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行誘 變育種、原生質(zhì)體融合及基因工程等手段構(gòu)建高效、廣譜的降解工程菌。 從受農(nóng)藥污染嚴(yán)重的土壤中篩選分離具有優(yōu)良性狀的菌種是目前采用最多的一種方法，一般是利用農(nóng)藥排污口及周?chē)蜷L(zhǎng)期使用某一種農(nóng)藥的土壤，經(jīng)富集培養(yǎng)，分離出可降解農(nóng)藥的高效菌株。方玲（ 2000）分離到能降解六六六的芽孢桿菌屬、無(wú)色桿菌屬和假單孢菌屬菌株，以及降解滴滴涕的產(chǎn)堿桿菌屬和無(wú)色桿菌屬。王玉軍等（ 2002）從多年施用過(guò) 土壤中分離出一株高效細(xì)菌菌株 吉氏擬桿菌（ 一株放線(xiàn)菌菌株 金霉素 鏈霉菌( 并對(duì)其生長(zhǎng)條件和降解機(jī)理進(jìn)行了初步研究。王國(guó)惠（ 2004）從受污染的土壤中篩選到一株有機(jī)氯農(nóng)藥 2， 4效降解菌 菌對(duì) 2， 4有很高的降解活性及較強(qiáng)的耐受力。當(dāng) 2,4 D 的濃度為 400 時(shí)幾乎完全被降解，濃度為 800 時(shí) 降 解率達(dá) 耐受濃度高達(dá) 3200。 定向培養(yǎng)優(yōu)良菌種也受到人們的關(guān)注，其方法就是在土壤中通過(guò)人為的多次施藥，培育可降解該農(nóng)藥的微生物，當(dāng)再次施藥時(shí)，經(jīng)降解速率的測(cè)定，如發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥在該土壤 中的降解速率快于未施藥土壤，則可以確定可降解該種農(nóng)藥的微生物種群已被培育起來(lái)，而后從中分離出高效菌株。這方面的研究已有過(guò)成功的例子。如 (1996)通過(guò)向土壤中施用萘丙酸草胺誘 導(dǎo) 該農(nóng)藥降解菌。 (1994)連續(xù)向土壤中施用乙烯菌核利，篩選出降解該農(nóng)藥的假單胞桿菌。 在上述農(nóng)藥降解菌的培育過(guò)程中，誘變育種也是常用的方法。對(duì)于降解效率不高的菌株可采用誘變的辦法，使基因發(fā)生突變，獲得降解能力提高的菌株。沈齊英等（ 2004）用紫外線(xiàn)做為誘變劑處理由燕化煉油廠污水廠的活性污泥中篩選得到的降酚菌株， 在 好 氧條件 下 篩選出 2 種高效降酚微生物 種能夠有效降解較為復(fù)雜的含酚污水，且 種處理效果最佳。 高效農(nóng)藥降解工程菌的構(gòu)建已經(jīng)成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。降解微生物尤其是細(xì)菌中的降解基因、降解途徑等許多農(nóng)藥降解機(jī)制的闡明為構(gòu)建高效降解性能的工程菌提供可能，基因工程技術(shù)的利用使人們可以按照人類(lèi)的需要構(gòu)建具有特殊功能的降解質(zhì)粒，產(chǎn)生出降解效率高，降解范圍廣，表達(dá)穩(wěn)定的新菌株。 降解菌的鑒定對(duì)于開(kāi)發(fā)農(nóng)藥降解菌資源，闡明降解原理，構(gòu)建工程菌及利用混合菌降解農(nóng)藥具有重要意義。目前常用的鑒定方法主要依據(jù)降解菌的形 態(tài)特征培養(yǎng)特征及生理生化特征，隨著中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 3 分子生物學(xué)技術(shù)和其他學(xué)科的發(fā)展，一些先進(jìn)的技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于降解菌的鑒定中，這些技術(shù)包括： 量測(cè)定 合率測(cè)定 堿基順序測(cè)定核糖體蛋白的組成分析，其他技術(shù)如紅外吸收光譜核磁共振脂類(lèi)分析細(xì)胞色素類(lèi)型以及輔酶 Q 的類(lèi)型等也被廣泛應(yīng)用 (馬文漪 等 ，1998; 張繼忠 ， 1990)。 降解的微生物種類(lèi) 土壤微生物主要包括真菌、細(xì)菌、放線(xiàn)菌等，它們對(duì)農(nóng)藥均有降解作用。細(xì)菌由于生化上的多種適應(yīng)能力和容易誘發(fā)突變等特性，在降解農(nóng)藥的微生物種群中占有重要位置 (1984)。土壤中的農(nóng)藥降解菌并非特殊微生物，它們?cè)谕寥乐蟹植己軓V，某種農(nóng)藥往往同時(shí)有多種降解菌，同一種菌也可能會(huì)對(duì)多種農(nóng)藥具有降解作用。目前已分離到的能降解或轉(zhuǎn)化有機(jī)氯的微生物如表1偉東 等， 2005） 。 藥降解途徑與機(jī)理 (一 ) 微生物降解農(nóng)藥的本質(zhì)是酶促反應(yīng) 農(nóng)藥的代謝方式主要有酶促與非酶促兩種方式，而微生物的降解作用主要是通過(guò)其分泌酶的代謝來(lái)完成，其本質(zhì)為酶促反應(yīng)。常見(jiàn)的降解酶類(lèi)主要有水解酶和氧化還原酶類(lèi)（逢煥成等，2002）。水解酶類(lèi)如對(duì)硫磷水解酶、酯酶和硫基酰 胺酶能將農(nóng)藥水解為結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的、毒性較低的小分子化合物，并且降低農(nóng)藥的生物專(zhuān)一性和穩(wěn)定性，提高產(chǎn)物的生物降解性。這類(lèi)酶對(duì)作用農(nóng)藥的專(zhuān)一性要求不高，水解農(nóng)藥的種類(lèi)較多，顯著降低原藥毒性。此類(lèi)酶促反應(yīng)中不需要輔酶或輔助因子，使用也較方便 ， 多 見(jiàn) 于有機(jī)磷農(nóng)藥如久效磷、對(duì)氧磷和馬拉硫磷等的降解。 氧化還原酶類(lèi)可分為過(guò)氧化物酶和多酚氧化酶，如酪氨酸酶、漆酶對(duì)土壤中酚類(lèi)化合物和芳香族化合物的降解就很有效。其中過(guò)氧化物酶可由植物和微生物分泌產(chǎn)生，如棘根過(guò)氧化物酶包含一個(gè)鐵 原子 的卟啉環(huán)，需要過(guò)氧化氫才能發(fā)生酶促反應(yīng)，能催化芳香 族化合物等一大類(lèi)反應(yīng)，包括木質(zhì)素的聚合和解離反應(yīng)。辣根過(guò)氧化物酶能催化酚和苯胺的聚合反應(yīng)；酪氨酸酶通過(guò)催化酚的羥基化和氧聯(lián)苯酚的脫氫作用來(lái)消除土壤中有毒物質(zhì)的污染；漆酶是通過(guò)聚合過(guò)程來(lái)起作用。帶有氯的苯酚和苯胺由漆酶和過(guò)氧化物酶在土壤中進(jìn)行氧化而解毒。目前漆酶被證明是最有效的氧化還原酶類(lèi)之一（和文樣 等， 2001）。 1970） 則發(fā)現(xiàn)球形芽孢桿菌(細(xì)胞抽提物具有酰胺酶活性 ， 可降解苯胺類(lèi)除草劑。 1974） 從節(jié)桿菌(得到了一種多功能氧化酶 ， 可降解 2,4 3,5這種多功能氧化酶在進(jìn)行催化解毒時(shí)需要輔助因子 氧的存在。 （二）微生物在農(nóng)藥轉(zhuǎn)化中的作用 一是礦化作用。有許多化學(xué)農(nóng)藥是天然化合物的類(lèi)似物，某些微生物具有降解它們的酶系。它們可以作為微生物的營(yíng)養(yǎng)源而被微生物分解利用，生成無(wú)機(jī)物、二氧化碳和水。礦化作用是最理想的降解方式，因?yàn)檗r(nóng)藥被完全降解成無(wú)毒的無(wú)機(jī)物，如石利利等 （ 2002） 研究了假單胞菌 1 在水溶液介質(zhì)中降解甲基對(duì)硫磷的性能及降解機(jī)理后指出， 可以將甲基 對(duì)硫磷完全降解為無(wú)機(jī)離子 和 。 二是共代謝作用。有些化合物不能被微生物降解，但若有 其他 可 利用的 碳源和 氮 源存在時(shí)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 4 它們則可被部分降解，這個(gè)作用稱(chēng)為共代謝作用。如門(mén)多薩假單胞菌 株不能以甲單脒作為碳源和能源而生長(zhǎng)，只能在添加其它有機(jī)營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)作為碳源的條件下降解甲單脒，且降解產(chǎn)物未完全礦化，屬于共代謝作用類(lèi)型（沈東升 等 , 1994）。共代謝作用在農(nóng)藥的微生物降解過(guò)程中發(fā)揮著主要的作用（王偉東 等 , 1995）。 表 1降解有機(jī)氯農(nóng)藥的微生物種類(lèi) of 解微生物種屬 能夠降解的農(nóng)藥 假單胞桿菌 ( 艾氏劑 、 毒殺芬 、 2,4 D、 2 甲 4 氯 、 對(duì)氯苯胺 、 五氯酚 、 多菌靈 、 乙烯菌核利 、 對(duì)氯苯胺 、 六六六 、 對(duì)硝基苯酚 無(wú)色桿菌 ( 2,4 D、 2 甲 4 氯 、 2,4,5 T、 對(duì)氯苯胺 、 六六六 產(chǎn)堿菌株 ( 六六六 、 五氯酚 、 三氯醋酸 屎擬桿菌 (硝基苯 吉氏擬桿菌 (五氯硝基苯 芽孢桿菌屬 (艾氏劑 、 異艾 氏劑、 七氯 、 2 甲 4 氯 、 2,4 D、 五氯酚 棒狀桿菌屬 (2 甲 4 氯 、 2,4 D、 五氯酚 土壤桿菌屬 (對(duì)氯苯胺 黃桿菌屬 (2,4 D、 2 甲 4 氯 、 三氯醋酸 、 對(duì)氯苯胺 、 五氯酚 短桿菌屬 (五氯酚 枝動(dòng)桿菌屬 (2,4 D、 2 甲 4 氯 、 2,4,5孢原平革菌 (五氯酚 曲霉屬 (艾氏劑 、 毒殺芬 、 2,4 D、 2 甲 4 氯 、 異狄氏劑 、 狄氏劑 、七氯 、 二硝基苯胺 、 五氯酚 青霉屬 (異狄氏劑 、 狄氏劑 、 七氯 、 五氯硝基苯 根霉屬 (七氯 、 艾氏劑 木霉屬 (七氯 、 艾氏劑 、 狄氏劑 、 五氯酚 、 五氯硝基苯 鐮刀菌屬 (七氯 、 艾 氏劑 、 五氯硝基苯 、 對(duì)氯苯胺 總狀共頭霉 (甲霜靈 諾卡氏菌屬 (七氯 、 五氯硝基苯 、 艾氏劑 、 2,4霉屬 (七氯 、 五氯硝基苯 、 艾氏劑 混合菌群 氯酚 、 氯苯類(lèi)化合物 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 5 （三） 微生物降解農(nóng)藥時(shí)的生化反應(yīng)（儀美芹 等 ， 2002） （ 1）氧化反應(yīng)，包括羥化反應(yīng)，如芳香族羥化、脂肪族羥化、 氧化； 化性脫烷基、脫鹵、脫胺。 （ 2）還原反應(yīng)，包括硝基還原、還原性脫鹵、醌 類(lèi)還原等。 （ 3）水解反應(yīng)，一些酯、酰胺和硫酸酯類(lèi)農(nóng)藥都有可以被微生物水解的酯鍵，如對(duì)硫磷、苯胺類(lèi)除草劑等。 （ 4）縮合和共軛形成，縮合包括將有毒分子或一部分與另一有機(jī)化合物相結(jié)合，從而使農(nóng)藥或其衍生物物失去活性。應(yīng)該指出，在微生物降解農(nóng)藥時(shí)，其體內(nèi)并不是只進(jìn)行單一的反應(yīng)，多數(shù)情況下是多個(gè)反應(yīng)協(xié)同作用來(lái)完成對(duì)農(nóng)藥的降解過(guò)程。 藥降解酶基因的克隆與表達(dá) 近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有多個(gè)有機(jī)磷農(nóng) 藥降解酶基因被克隆，主要來(lái)源于黃桿菌、假單胞菌、單胞菌、節(jié)桿菌 、土壤桿菌和紫色桿菌等。通 過(guò)研究人們發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥降解菌的降解基因主要位于質(zhì)粒上，因此，將這些降解質(zhì)粒導(dǎo)入易于繁殖的宿主中獲得高表達(dá)，提高產(chǎn)酶率，或?qū)⒉煌慕到赓|(zhì)粒導(dǎo)入同一菌株中，擴(kuò)大降解譜，提高降解效率已成為一個(gè)重要的研究?jī)?nèi)容。 2002） 在分離 2,4,5降解菌時(shí)加入了含有降解質(zhì)粒 多種微生物，共同培養(yǎng) 8 10 個(gè)月 后 篩選出高效降解 2,4,5惡臭假單胞菌 細(xì)胞內(nèi)含有 多種質(zhì)粒，該多質(zhì)粒工程菌在 6 周內(nèi)可將 1000 的 2,4,5解 至 500。 (2000)將可降解 2,4,5惡臭假單胞菌 株和 2,4解菌 行細(xì)胞融合，使 降解質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 株，得到一株新工程菌 同時(shí)降解 2,4 2,4,5國(guó)順等（ 2005）從六六六的富集液中擴(kuò)增到基因 將其克隆到 化大腸桿菌（ 得到分子量約 17蛋白，轉(zhuǎn)化子的 表達(dá) 能力明顯提高。閆艷春 （ 2000）將抗性尖音庫(kù)蚊五帶亞種 的 抗有機(jī)磷農(nóng)藥基因 酯酶基因克隆到質(zhì)粒 ，得到了高酶活性的工程菌，將工程菌固定化后對(duì)有機(jī)氯進(jìn)行降解，結(jié)果表明固定化細(xì)胞在一小時(shí)內(nèi)對(duì)其降解高達(dá) 90以上。 目前已報(bào)道了多種應(yīng)用分子生物學(xué)方法獲得的具有降解能力的基因，詳見(jiàn)表 1韓杰 等，2004） 。 響土壤中農(nóng)藥降解的因素 微生物對(duì)土壤中污染物的降解效率受多種因素的影響。首先與污染物的結(jié)構(gòu)、特性和濃度有關(guān)。結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子量小、易溶于水的農(nóng)藥較易降解。不同取代基苯酚化合物在污泥中完全降解所 需時(shí)間不同，硝基酚和甲氧酚所需時(shí)間較長(zhǎng)。具有同一取代基的苯酚物，由于取代位置不同，其消失時(shí)間也不同。苯環(huán)上取代氯的數(shù)目越多，越不易降解。以氯的位置來(lái)說(shuō)，苯環(huán)上間位取代的類(lèi)型最難降解。農(nóng)藥的濃度對(duì)降解的影響也很大，太高濃度往往對(duì)降解菌有抑制作用，而太低的農(nóng)藥濃度則難以提供微生物足夠的營(yíng)養(yǎng)而使生物降解無(wú)法進(jìn)行。其次，與微生物群體的活性有關(guān)。特定的農(nóng)藥只能由特定的微生物降解，同時(shí)，微生物的空間分布 、 群體密度 、 與其他微生物中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 6 的相互作用等均影響微生物的降解效率。 再者 ，環(huán)境因子對(duì)農(nóng)藥的降解的影響是巨大的，這些因子包括溫度 、濕度、酸堿度、營(yíng)養(yǎng)等。了解影響農(nóng)藥降解的因素 對(duì) 因時(shí)因地創(chuàng)造有利條件，充分發(fā)揮降解菌的降解效能有 重要意義 。 表 1用分子生物學(xué)方法獲得的降解基因 by 標(biāo)基因 分子生物學(xué)方法 來(lái) 源 下水 胱甘肽轉(zhuǎn)移酶 壤 酚羥化酶 性污泥 并引物 染土樣 氧化酶 壤菌群 并引物 洋菌 并引物 壤菌群 并引物 壤菌群 氧化酶 兒茶酚雙氧化酶兼并引物 水和土壤菌群 氧化酶兼并引物 水、淤泥、土壤菌群 學(xué)問(wèn)題及發(fā)展趨勢(shì) 今后微生物降解農(nóng)藥的研究方向主要 涉及 以下幾方面 ： 高效農(nóng)藥降解工程菌的開(kāi)發(fā) ， 混合菌的培養(yǎng)，降解菌的固定化 ， 農(nóng)藥生物降解的模型定量化研究。但也存在不少問(wèn)題： （ 1）目 前關(guān)于農(nóng)藥微生物降解的研究多集中于細(xì)菌方面。真菌因其卓越的降解能力正逐漸引起人們的重視，但總體上不如細(xì)菌，而放線(xiàn)菌和藻類(lèi)則更少。今后要加強(qiáng) 該 方面的研究。 （ 2）在實(shí)際應(yīng)用中酶也存在局限性，如酶純化和提取技術(shù)耗時(shí)長(zhǎng)，花費(fèi)高；酶受周?chē)h(huán)境因素的影響可能不穩(wěn)定；有些酶需要輔酶因子，在應(yīng)用中比較困難；酶和污染物的相互作用會(huì) 因?yàn)?擴(kuò)散受到抑制；酶可能會(huì)被蛋白酶所降解。但近年來(lái)已有研究表明，通過(guò)采用固定化技術(shù)，酶可重復(fù)使用 ； 同時(shí)抗蛋白酶降解能力較強(qiáng)，明顯提高了酶的穩(wěn)定性和使用期限，而采用基因工程技術(shù)可以解決酶的來(lái)源及降解 譜較窄問(wèn)題。因此農(nóng)藥降解酶實(shí)際中應(yīng)用具有廣闊的前景。 （ 3）基因工程技術(shù)的應(yīng)用使人們可以按照人類(lèi)的需要 構(gòu) 建具有特殊功能的降解質(zhì)粒，產(chǎn)生出降解效率高 、 降解范圍廣 、 表達(dá)穩(wěn)定的新菌株。但是目前這項(xiàng)技術(shù)的研究尚停留在實(shí)驗(yàn)室 階段 ，真正投入應(yīng)用的基因工程菌很少。 （ 4）進(jìn)入到環(huán)境中的農(nóng)藥，會(huì)受到環(huán)境因子的作用，土壤的 度、含水量、有機(jī)質(zhì)含中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 7 量、粘度及氣候等均影響農(nóng)藥的降解。目前進(jìn)行的農(nóng)藥微生物降解研究多停留在實(shí)驗(yàn)室水平，與大田的農(nóng)藥應(yīng)用情況相比較，是在相當(dāng)強(qiáng)選擇壓下分離降解菌，常用純培養(yǎng)方式進(jìn)行試驗(yàn)，得到的降解菌應(yīng) 用到田間或者自然環(huán)境條件下其降解活性容易喪失。另外在實(shí)驗(yàn)室里得到的微生物在向大田釋放和直接應(yīng)用時(shí)對(duì)環(huán)境的安全性以及對(duì)人和其他生物的是否有害必須認(rèn)真深入細(xì)致 地研究。如何使實(shí)驗(yàn)室得到的結(jié)果與大田應(yīng)用相結(jié)合，是一個(gè)有待進(jìn)一步進(jìn)行探討的復(fù)雜而具有實(shí)際意義的課題。 菌清及其降解代謝研究進(jìn)展 菌清及其生態(tài)毒理學(xué) 百菌清 (化學(xué)名稱(chēng) 2,4,5,61,3由美國(guó)的 o (現(xiàn)在 司開(kāi)發(fā)出來(lái)的一種 高效、低毒的非內(nèi)