密級： 內(nèi)部 5 年 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 利用比較基因組學(xué)進(jìn)行小麥太谷核不育 基因的克隆 of of I 摘 要 太谷核不育小麥?zhǔn)俏覈?1972 年發(fā)現(xiàn)的一份珍貴小麥材料，是我國特有的種質(zhì)資源。其不育性受顯性單基因（ 制，雄性不育徹底、穩(wěn)定而且不受遺傳背景的影響?？寺?因、闡釋其作用機(jī)理具有重要意義。太谷核不育基因定位于小麥 4色體，在矮敗小麥中，與矮稈 基因 密連鎖。小麥 4色體多態(tài)性非常低，在已有的 小麥 遺傳圖譜中， 定位于 4分子標(biāo)記 最 少，這給 該 基因的克隆帶來了很大困難。比較基因組學(xué)研究表明，禾本科不同物種之間在基因及基因排列順序上具有很好的共線性。 本研究的目的是 對小麥 域的共線性進(jìn)行分析 ，并 利用比較基因組學(xué)進(jìn)行 因的克隆 。 小麥 4色體與水稻第三染色體長臂具有同源性。 根據(jù)這種同源關(guān)系，利用 小麥 計D 基因組特異引物，對六倍體小麥 庫和二倍體 D 基因 組 庫進(jìn)行篩選，并利用 物進(jìn)行染色體步行。共篩選得到 32 個 隆，跨疊群總長度大約 應(yīng)的水稻基因組同源 區(qū) 段長 度為 820 對小麥 段 11 個 隆， 因組序列 分析表明，重復(fù)序列占 其中反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子分布最多，占重復(fù)序列的 80%，總測序長度的 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中主要為型，占 非 型占 基因序列占 不同 的基因含量差別很大，最低為 最高為 測序的 11 個 共包含 50 個基因，平均基因密度為 1 個基因/30 1個基因 / 1個基因 /源區(qū)段的共線性分析表明，小麥和水稻之間存在很好的共線性。該區(qū)段 96%的小麥基因與水稻第三染色體同源，其中 81%與水稻保持共線性。同時，該區(qū)段小麥中也存在基因重復(fù)、插入、缺失、倒位等非共線性區(qū)段。 為進(jìn)一步比較 源區(qū)段的共線性， 對 兩個短柄草 的 隆 進(jìn)行了測序 ， 其 一致序列為 180中，基因序列占 21%，共包含 10 個基因，基因密度為 1 個基因 /18在該測序區(qū)段， 短柄草的基因全部與水稻和小麥具有共線性， 但 是，短柄草比水稻 少 8 個基因，比 小麥少 1 個 基因。 7 個同源基因中，有 6 個在 短柄草與小麥 之間 的蛋白質(zhì)序列相似性大于水稻與小麥的相似性。 這些結(jié)果表明， 該區(qū)段小麥與短柄草間的共線性及基因相似性均大于小麥與水稻 。 記是一種基于重復(fù)序列的新的分子標(biāo)記類型，可有效地用于分子標(biāo)記的開發(fā)。本研究利用 的重復(fù)序列，設(shè)計了 109 對 D 基因組特異引物。采用 物直接測序的方法，在12 對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物中檢測到 15 個多態(tài)性位點，其中 9 個位點 被 成功 地 開發(fā) 為 記。新開發(fā)的 9 個 記中， 7 個位于矮稈基因左側(cè)， 2 個位于矮稈基因右側(cè)，在水稻同源區(qū)段中覆蓋大約 530區(qū)段 。利用新開發(fā)的分子標(biāo)記對 因進(jìn)行定位，幾方面證據(jù) 表 明， 因位于 著絲粒之間的區(qū)段。 公共數(shù)據(jù)庫中 有 100 多 萬條的小麥族 小麥基因組學(xué)研究提供了豐富的可利用資源。在 本研究中，利用與水稻基因同源的小麥 計引物，檢測可育株與不育株之間的基因序列的多態(tài)性。共對 59 個基因的 110 對引物進(jìn)行了檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物包含 268 個內(nèi)含子，總測序長度大約143果在 同源基因中檢測到一個多態(tài)位點，該 點與不育基因緊密連鎖。 外， 記沒有 檢 測到多態(tài)性，這些結(jié)果表明，小麥 段的多態(tài)性非常低。 本研究構(gòu)建 了 目標(biāo)基因區(qū)域 的 疊 群，開發(fā)了 9 個 記，并將 因定 位于著絲粒之間的區(qū)段 ，為最終分離、克隆 因奠定了很好的基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞 太谷核不育小麥，圖位克隆， 比較基因組學(xué)， 共線性 ， 記 972 a it by of is of on it to of of D. be of of to in of to to it is to of is on . on to D AC AC to A 2 up of is 20 AC of TR 0% of of in 0 1 a 04, 2.3 of a of In 96% in 1% of in to in in 80it a of 8of in in 8) ) of is a on it in A 09 D on 1 in IV by CR 5 2 CR 7 of on on in 30to in ST in is In on to to A 10 9 43kb 68 CR As a in NP to SR NA in In AC to of V 目 錄 英文縮略表 . 一章 文獻(xiàn)綜述 . 1 物雄性不育及其研究進(jìn)展 . 1 物雄性不育 . 1 物雄性不育研究的意義 . 1 物雄性不育發(fā)生機(jī)理研究進(jìn)展 . 2 麥雄性核不育基因 . 3 定位的小麥雄性核不育基因 . 3 谷核不育基因 其遺傳特點 . 4 谷核不育小麥的研究進(jìn)展 . 5 因的圖位克隆技術(shù) . 8 位克隆技術(shù)流程 . 8 位克隆方法在小麥中的應(yīng)用 . 9 較基因組學(xué)研究進(jìn)展 . 13 傳圖譜揭示了基因組間的共線性 . 13 片段 列比較揭示了基因組間的微共線性 . 15 麥第四部分同源群染色體的共線性 . 16 題意義及技術(shù)路線 . 19 題意義 . 19 術(shù)路線 . 19 第二章 小麥 域的跨疊群構(gòu)建及物種間的共線性比較 . 20 前言 . 20 料與方法 . 20 料 . 20 法 . 21 果與分析 . 30 庫的篩選與跨疊群的構(gòu)建 . 30 隆測序與序列拼接 . 32 麥基因組序列組成特點 . 33 麥、水稻、短柄草微共線性比較 . 37 論 . 44 麥 域的共線性 . 44 短柄草是否可作為小麥的模式植物 . 45 因密度 . 45 列與基因 . 46 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 . 46 第三章 基于重復(fù)序列的分子標(biāo)記開發(fā) . 48 前言 . 48 料與方法 . 48 料 . 48 法 . 48 果與分析 . 50 于微衛(wèi)星重復(fù)的 記的開發(fā) . 50 于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的 記的開發(fā) . 54 記轉(zhuǎn)化為 記 . 56 記檢測與 因定位 . 58 論 . 59 谷核不育基因 定位 . 59 記在小麥基因組學(xué)研究中的應(yīng)用前景 . 60 第四章 基于小麥 分子標(biāo)記開發(fā) . 62 前言 . 62 料與方法 . 62 料 . 62 法 . 62 果與分析 . 68 用基因開發(fā) 記 . 68 據(jù)小麥 列設(shè)計引物檢測多態(tài)性 . 69 論 . 71 麥 4色體多態(tài)性低于其它染色體 . 71 因區(qū)域分子標(biāo)記的開發(fā) . 72 第五章 全文結(jié)論 . 74 參考文獻(xiàn) . 75 致 謝 . 91 作 者 簡 歷 . 92 文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 菌人工染色體 胞質(zhì)雄性不育 達(dá)序列標(biāo)簽 向逆轉(zhuǎn)座子擴(kuò)增多態(tài)性 性不育 轉(zhuǎn)座子插入位點多態(tài)性 轉(zhuǎn)座子微衛(wèi)星擴(kuò)增多態(tài)性 制性片段長度多態(tài)性 轉(zhuǎn)座子內(nèi)部擴(kuò)增多態(tài)性 核苷酸多態(tài)性 列特異擴(kuò)增多態(tài)性 單序列重復(fù) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 1 第一章 文獻(xiàn)綜述 物雄性不育及其研究進(jìn)展 物雄性不育 植物雄性不育是指植物在有性繁殖過程中雄性生殖器官發(fā)育異常 ，不能產(chǎn)生有正常功能的花藥、花粉或雄配子，而其雌性器官的生長發(fā)育完全正常，可以接受正常發(fā)粉受精結(jié)實。植物雄性不育在自然界中是一種常見現(xiàn)象 ， 早在 1763 年 觀察到雄性不育現(xiàn)象， 1876)首次引入“植物雄性不育”的概念。目前已經(jīng)在近千個品種或種間雜交種中發(fā)現(xiàn)雄性不育（ et 1988）。 植物雄性不育主要有三種類型：（ 1）生理上不協(xié)調(diào)或某些環(huán)境因素造成的雄性不育，不能遺傳；（ 2）由于染色體數(shù)目、性質(zhì)上的不協(xié)調(diào)造成的雄性不育，多為遠(yuǎn)緣雜交種；（ 3）由基因決定的 雄性不育，可以遺傳?？蛇z傳的雄性不育是生產(chǎn)應(yīng)用和科學(xué)研究的主要 材料 。 1947)根據(jù)雄性不育材料基因型的差異，將雄性不育分為核不育 (、胞質(zhì)不育 (核質(zhì)互作不育三種類型，雄性不育性分別由核基因、細(xì)胞質(zhì)基因及二者的互作決定。然而，事實上至今沒有 細(xì)胞 質(zhì)突變獨立引起雄性不育的報道 (孫東發(fā)， 1956)把胞質(zhì)不育和核質(zhì)互作不育合為一類，提出了雄性不育的“二型學(xué)說”。核不育中有顯性基因、隱性基因控制的不育，及環(huán)境條件控制的光（溫）敏核不育。 根據(jù)雄性不 育敗育發(fā)生的過程，可分為孢子 體不育和配子體不育兩種。孢子體不育是指合子體（植株）基因型控制的花 粉不育，不育性與發(fā)粉本身的基因型無關(guān)，多數(shù)的雄性不育屬于此類。配子體不育是指由配子（花粉）基因型控制的雄性不育，如紅蓮型、型和滇型等水稻不育系（曾千春等， 2000）。 988)根據(jù)植物雄性不育表型特征將植物雄性不育分為結(jié)構(gòu) 型 、孢子發(fā)生 型 、功能 型 雄性不育三種類型。結(jié)構(gòu) 型 雄性 指 不育雄蕊結(jié)構(gòu)顯著異常，致使小孢子組織不能正常發(fā)育，不能生成小孢子。孢子發(fā)生 型 雄性不育雄蕊發(fā)育正常，但是不能產(chǎn)生花粉或花粉異常、畸 形。功能 型 雄性不育 產(chǎn)生正常的花粉，但是存在花藥不開裂、花粉不能萌發(fā)或花粉管生長不正常等障礙而不能受精。 物雄性不育研究的意義 物雜種優(yōu)勢的利用 遺傳基礎(chǔ)不同的兩個親本雜交產(chǎn)生的雜種在某些性狀上優(yōu)于其親本的現(xiàn)象稱為雜種優(yōu)勢（ 貝爾從 1862 年起，研究玉米雜交效應(yīng)，指出生產(chǎn)上可利用品種間雜種第一代。 注意到玉米自交衰退與雜交有利的現(xiàn)象，于 1914 年將此現(xiàn)象定名為“雜種優(yōu)勢”（ 現(xiàn)今，主要農(nóng)作物如水稻、小麥、玉米及經(jīng) 濟(jì)作物都利用了雜種優(yōu)勢，在產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性等性狀上獲得了大幅度提高。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 2 盡管利用雜種優(yōu)勢已成為提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效益的主要途徑之一，但對于自花授粉作物，在未解決人工去雄的困難以前，難以在生產(chǎn)上大面積推廣。而利用植物的雄性不育性是解決這一困難的有效途徑。目前水稻、玉米、高粱、洋蔥、油菜等作物已經(jīng)利用雄性不育性進(jìn)行雜交種子的生產(chǎn)，并產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。水稻中基于細(xì)胞質(zhì)雄性不育的 f 體系（ 1980; 1988）對中國及亞洲地區(qū)國家的雜交水稻的發(fā)展發(fā)揮了重要作用（ Li 2000）。小麥雜種優(yōu)勢利用中，發(fā)展了利用隱性核不育基因的 系，和利用 T 型胞質(zhì) (T. 、 K 型 (具有 胞 質(zhì) )、 V 型 (具有 胞質(zhì) )、 (普通小麥細(xì)胞質(zhì) )、 Q 型 (具有燕麥細(xì)胞質(zhì) )等多種胞質(zhì)不育系的三系配套體系（ 2003; 1987)。顯性雄性核不育則被廣泛應(yīng)用于輪回選擇等群體改良中。 物花發(fā)育機(jī)制及基因作用機(jī)理的研究 高等植物的開花 無 論對 植物本身還是對于人類都十分重要。開花是高等植物生活史上的一個質(zhì)變過程，是植物個體發(fā)育過程的中心環(huán)節(jié)。研究高等植物的開花過程，闡明其調(diào)控機(jī)理無論在理論上還是在應(yīng)用上都具有重要意義。雄性不育是植物花器官發(fā)育的特殊形式，對植株本身是一種不利性狀，但卻是植物在進(jìn)化過程中一種生存的方式。植物雄配子的產(chǎn)生需要幾千個特異基因（ et 1993; et 1999），多數(shù)花藥特異基因表達(dá)具有嚴(yán)格的時空順序?；ǚ郯l(fā)育所需基因一旦發(fā)生突變，就會有損于花粉的正常發(fā)育，造成雄性不育 。研究不育花粉在敗育過程中基因表達(dá)特征，并分離和克隆與雄性不育有關(guān)基因，研究基因的 結(jié) 構(gòu)與功能，闡述雄性不育的發(fā)生機(jī)理具有重要意義 （ et 1998） 。植物雄性不育具有多種類型，控制敗育發(fā)生的生物途徑具有不同的特點。核質(zhì)互作雄性不育是研究核基因與細(xì)胞質(zhì)基因相互作用的典型材料，光（溫）敏雄性核不育基因的研究將對探討環(huán)境對基因表達(dá)的影響及植物的環(huán)境應(yīng)答機(jī)制 有 所幫助。 物雄性不育發(fā)生機(jī)理研究進(jìn)展 被子植物可育花粉的產(chǎn)生，涉及到大量遺傳控制的生理、生化和形態(tài)學(xué)過程。任何干擾雄蕊發(fā)育 、 胞原細(xì)胞分化 、 減數(shù)分裂 、 自由小孢子的發(fā)育 、 小孢子有絲分裂 、 花粉分化或花藥開裂的基因突變，都有可能導(dǎo)致植物的雄性不育 （ et 1998）。 目前，對植物雄性不育的研究，在擬南芥和 金魚草 等模式植物中開展得比較多 （ et 2001; 2005） ，主要是以各種誘變的雄性不育突變體為材料，通過分離克隆不育相關(guān)基因探討其發(fā)生機(jī)理。如花絲過短雄性不育突變體（ et 1994）、花藥不開裂雄性不育突變體（ et 1999）及雄配子 發(fā)育障礙或減數(shù)分裂異常的突變體（ (et 1993a; et 1998; He et 1996;et 1996; et 1997; et 1999）等。 在 雄性不育中，對絨氈層的研究很多，絨氈層的異常往往直接導(dǎo)致雄性不育。絨氈層是花藥壁的內(nèi)層細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)濃，富含線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和高爾基體等細(xì)胞器。小孢子形成過程中，絨氈層分化形成雙核的、具極性的分泌細(xì)胞層，缺乏初級細(xì)胞層。細(xì)胞學(xué)分析表明 ，絨氈層細(xì)胞質(zhì)膜的內(nèi)表面含有許多的囊泡。它通過向花藥室中分泌大量的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂類等物質(zhì)，促進(jìn)花粉的發(fā)育或變成花粉外壁的重要成分 。 有證據(jù)表明，花粉外壁腔中的蛋白質(zhì)主要是在絨氈層中合成，組成花粉外壁的孢粉素也是在絨氈層中合成并分泌到花藥室中。其次，絨氈層還與花中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 3 粉鞘和含油層（疏水和親水物質(zhì)的混合物，包裹著成熟的花粉粒）的合成有關(guān)。另外，與苯丙烷酮代謝有關(guān)的幾個關(guān)鍵酶，如苯丙氨酸脫氨酶、肉桂酸羥化酶等都是在絨氈層中合成并分泌到花藥室中，從而催化花藥室中或發(fā)育中的小孢子外壁的苯丙烷酮代謝。苯丙烷酮代謝途徑 為 類黃酮、木質(zhì)素、芪類化合物和香豆素合成提供前體。 上述研究 表明絨氈層在小孢子的發(fā)育過程中具有許多非常重要的作用。擬南芥 用 簽法克隆的雄性不育基因（ et 1997） ，表現(xiàn)為絨氈層細(xì)胞嚴(yán)重液泡化，花粉粒外壁發(fā)育異常。 在小孢子釋放至花粉粒外壁形成的短暫時間內(nèi)， 因在絨氈層細(xì)胞中特異表達(dá)，它很可能參與了胞粉素形成過程中脂肪酰到脂肪醇的還原過程。 水稻 變體則表現(xiàn)為絨氈層延遲解體而導(dǎo)致小孢子崩潰（ Li et 2006） 減數(shù)分裂時期是對各種干擾非常敏感的發(fā)育階段，植物中大多數(shù)雄性不育突變都發(fā)生在減數(shù)分裂開始或減數(shù)分裂結(jié)束的某個時期 （ 1988） 。在擬南芥菜中，已 鑒定 許多減數(shù)分裂缺陷突變體 ，如 et 1998; et 2002; 2004; 2002; et 2005; et 1999; et 1998; et 2001; et 2001; 2000; et 2004; Li et 2005; et 2005)等。 因有兩個等位突變體，即 變 的等位基因 入引起 的等位基因 胞學(xué)分析表明 變體在花粉 母細(xì)胞 發(fā)育到第二次減數(shù)分裂以后出現(xiàn)異常，產(chǎn)生異常的四分體狀結(jié)構(gòu)，即在第二次減數(shù)分裂后，又出現(xiàn)了一次額外的分裂，而 沒有復(fù)制，結(jié)果形成多分體 （ et 1998）。 另外，激素類物質(zhì) (Li et 2006)、 、 細(xì)胞骨架（ Ye et 2003）及細(xì)胞程序性死亡（ et 1996； et 1996）等都與植 物的雄性不育有關(guān)。 麥雄性核不育基因 胞核雄性不育性是由細(xì)胞核不育基因 控制，其作用不受細(xì)胞質(zhì)類型影響，沒有正反交的遺傳效應(yīng)，其雄性不育的遺傳、表達(dá)完全符合孟德爾遺傳規(guī)律，一般由控制花粉正常育性的核基因發(fā)生突變形成。自然突變和誘發(fā)突變都可以產(chǎn)生核雄性不育。在核不