密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文 擾介導(dǎo)抑制家蠶核型多角體病毒（ 殖的研究 on of I on of 要 為了探討利用 制病毒復(fù)制、增殖的效果，選取家蠶核型多角體病毒（ 復(fù)制具有關(guān)鍵作用的極早期表達(dá)基因 旋酶基因 及對(duì)細(xì)胞釋放型病毒（ 平傳播具有關(guān)鍵作用的病毒囊膜蛋白 基因 靶基因，體外合成了與其相對(duì)應(yīng)的 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染家蠶 胞 ,感染病毒粒子或共轉(zhuǎn)染病毒基因組 究比較了供試 制、增殖的抑制效果，探討 子大小以及同時(shí)抑制 2 個(gè)基因表達(dá)對(duì)病毒滴度的影響，篩選最佳標(biāo)靶基因序列， 為結(jié)合利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)和 術(shù)進(jìn)行家蠶抗病毒研究提供依據(jù)。本文的主要研究內(nèi)容如下： 一、 因相應(yīng) 家蠶核型多角體病毒復(fù)制增殖的抑制研究 根據(jù) 人工設(shè)計(jì)并體外合成了長度為 438 利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，研究其對(duì) 果表明該 大抑制效果是病毒滴度比對(duì)照 降低了 1 處理區(qū)病毒增殖過程被完全抑制的有效作用時(shí)間是 2 二、 因相應(yīng) 家蠶核型多角體病毒復(fù)制增殖的抑制研究 根據(jù) 工設(shè)計(jì)并體外合成了分別位于 個(gè)1、 度分別為 459、 508、 337 以及 個(gè) 3度分別為 122、 105、 109用 殖的抑制效果并進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明 6個(gè)供試 3個(gè)長片段 制效果沒有明顯差別， 最大抑制效果為病毒滴度比對(duì)照 降低了 小片段 毒滴度抑制效果在感染后 24h、 96雙峰型曲線， 與推測的 有表達(dá)相一致。 三、 解旋酶 基因相應(yīng) 家蠶核型多角體病毒復(fù)制增殖的抑制研究 根據(jù) 旋酶基因 列， 體外合成了長度為 427 經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞后研究其對(duì) 果表明該 大抑制效果為病毒滴度 降低了 四、 抑制不同靶基因?qū)倚Q核型多角體病毒增殖的抑制效果比較 在相同條件下，分別將 應(yīng) 染 究各 結(jié)果表明 3個(gè) 殖的抑制效果的 大小順序?yàn)?3為 制 佳靶基因。利用 制 個(gè)基因與抑制單個(gè)基因進(jìn)行比較，表明同時(shí) 抑制 個(gè)基因的病毒滴度介于對(duì) 2個(gè)基因單獨(dú)抑制的病毒滴度之間，未發(fā)現(xiàn)協(xié)同增效作用。 關(guān)鍵詞： 擾，雙鏈 蠶核型多角體病毒，增殖，抑制 o on we (, as in in NA mN by of on of of of on as on in of in 1. of of on to of in 38 bp in NA mN by 04 g NA mN 2. of of on on in RF 59 08 3(337 in 3 32205 309 mN of of NA 1, G2 3 03.5 333-3 to or 4 6 of on of is at at 3. of of on on of 27bp in NA mN by of of on To of on of 1), 3), 1) 1 1 mN 11, is of of 1 1 of t 錄 第一章 緒論 1 發(fā)現(xiàn)與發(fā)展 1 相關(guān)因子及機(jī)制模型 2 相關(guān)因子 2 機(jī)制模型 3 作用特征 4 有高度的特異性 4 應(yīng)具有高效性 4 在放大效應(yīng) 4 生效應(yīng)的中介分子 4 要 與其效應(yīng) 4 他的沉默機(jī)制 4 錄水平基因沉默 4 導(dǎo)內(nèi)在的 5 生物學(xué)功能 5 病毒感染免疫 5 持基因組中轉(zhuǎn)座子的穩(wěn)定性 6 除異常 6 V 因表達(dá)調(diào)控 6 1.6 生成方式 7 過 賴的 合酶合成 7 座子產(chǎn)生 7 建表達(dá) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞表達(dá) 7 1.7 生成方式 8 學(xué)合成 8 外轉(zhuǎn)錄法 8 內(nèi)載體表達(dá)法 8 外酶切法 8 術(shù)在哺乳動(dòng)物、昆蟲中的應(yīng)用 9 術(shù)在哺乳動(dòng)物中的應(yīng)用 9 術(shù)在昆蟲中的應(yīng)用 9 結(jié) 10 第二章 研究目的與意義 11 第三章 一般實(shí)驗(yàn)材料和方法 12 驗(yàn)材料 12 粒和菌種 12 蟲細(xì)胞 12 試劑及試劑盒 12 它主要試劑 12 菌培養(yǎng)基 12 蟲細(xì)胞培養(yǎng)基 12 用溶液及緩沖液 13 用主要儀器和設(shè)備 14 般實(shí)驗(yàn)方法 14 胞的傳代 14 胞的凍存 14 胞的復(fù)蘇 14 胞計(jì)數(shù) 14 因組 共轉(zhuǎn)染 15 染后病毒母液感染細(xì)胞 15 毒滴度測定 15 度測定 15 度測定 15 因組 取 16 應(yīng) 16 法少量快速抽提質(zhì)粒 16 法大量制備質(zhì)粒 17 制性內(nèi)切酶反應(yīng) 17 段的分離與回收 17 6 連接 18 粒 轉(zhuǎn)化 18 組質(zhì)粒的鑒定 18 用 司 行體外轉(zhuǎn)錄 19 第四章 因相應(yīng) 家蠶核型多角體病毒（ 制 增殖的抑制研究 20 料與方法 20 試驗(yàn)材料與試劑 20 病毒擴(kuò)增及 因組 提取 20 引物的合成 21 增 21 因部分片段的克隆及測序 22 外轉(zhuǎn)錄合成 1 22 胞轉(zhuǎn)染 22 因組 共轉(zhuǎn)染 22 1 轉(zhuǎn)染的 細(xì)胞用病毒母液感染 22 毒滴度測定 22 毒滴度（ 計(jì)算方法 23 果與分析 23 因組 提取 23 1 的制備 23 1 與 轉(zhuǎn)染對(duì)病毒增殖的抑制效果 23 1 轉(zhuǎn)染對(duì)病毒粒子感染增殖的抑制 23 論 26 第五章 因相應(yīng) 家蠶核型多角體病毒（ 制 增殖的抑制研究 29 驗(yàn)材料與試劑 29 法 29 毒擴(kuò)增及 因組 提取 29 物的合成 29 外合成大片段 31 外合成小片段 31 胞轉(zhuǎn)染 32 毒滴度測定 32 果與分析 32 因組 提取 32 片段 制備 32 增長度為 100右的 因片段 32 片段 制備 32 1、 染對(duì)病毒粒 子感染增殖的抑制 33 3 與病毒基因組 轉(zhuǎn)染對(duì)病毒增殖的抑制效果 33 包埋脂質(zhì)體用量與 3 對(duì)病毒粒子增殖抑制效果的關(guān)系 34 片段 染對(duì)病毒粒子感染增殖的抑制 34 論 35 第六章 解旋酶基因相應(yīng) 家蠶核型多角體病毒（ 制 增殖的抑制研究 40 驗(yàn)材料與試劑 40 法 40 毒擴(kuò)增及 因組 提取 40 物的合成 40 因部分片段的克隆及測序 41 外轉(zhuǎn)錄合成 1 41 染的細(xì)胞用病毒母液感染 42 毒滴度測定 42 果與分析 42 因組 提取 42 擾用 制備 42 1 轉(zhuǎn)染對(duì)病毒粒子感染增殖的抑制 42 論 42 第七章 抑制不同靶基因?qū)倚Q核型多角體病毒增殖的抑制效果 比較 44 料與方法 44 生物材料與試劑 44 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 44 病毒滴度 測定 44 果與分析 44 染 病毒粒子感染增殖的抑制比較 44 染 1 對(duì)病毒粒子感染增殖的抑制分析 46 論 48 第八章 全文結(jié)論 49 8.1 因相應(yīng) 制增殖的抑制 49 因片段克隆與體外轉(zhuǎn)錄合成 49 1 轉(zhuǎn)染對(duì)病毒粒子感染增殖的抑制 49 8.2 因相應(yīng) 制增殖的抑制 49 外轉(zhuǎn)錄合成較長片段的 49 外轉(zhuǎn)錄合成較短片段的 49 因長片段 病毒粒子感染增殖的抑制 50 片段 染對(duì)病毒粒子感染增殖的抑制 50 期基因 應(yīng) 抑制效果 50 因片段克隆與體外轉(zhuǎn)錄合成 50 染對(duì)病毒粒子感染增殖的抑制 50 制不同靶基因?qū)?殖的抑制效果比較研究 51 埋 脂質(zhì)體的用量對(duì)滴度抑制效果的影響 51 參 考 文 獻(xiàn) 52 致 謝 57 附錄 58 碩士期間發(fā)表的論文 68 作者簡歷 69 英文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 NA 擾 鏈 干擾 鏈 發(fā)卡狀 識(shí)別、剪切 酶 錄后基因沉默 導(dǎo)的沉默復(fù)合體 NA NA 導(dǎo)的 合酶 蠶核型多角體病毒 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第 一章 緒論 發(fā)現(xiàn)與發(fā)展 1990年 ， 行了研究 ， 嘗試加深花朵的顏色。他們將一個(gè)能產(chǎn)生色素 (基因前加上一個(gè)強(qiáng)的啟動(dòng)子后 ， 轉(zhuǎn)入矮牽牛 （開紫花） 中 ， 結(jié)果沒有看到期待的深紫色花朵 ， 多數(shù)花朵成了開紫花有白斑甚至全白色。因?yàn)閷?dǎo)入的基因和其內(nèi)源基因同時(shí)被抑制，所以 et 1990；et 1996。在病毒感染的植物中也發(fā)現(xiàn)同源 為病毒誘導(dǎo)的基因沉默（ 1994年 ， 入野生型粗脈孢霉 (， 發(fā)現(xiàn)大約 30的 轉(zhuǎn)染細(xì)胞 的 內(nèi)源性 當(dāng)時(shí)稱這種現(xiàn)象為壓制 “et 1996。以后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)昆蟲和哺乳動(dòng)物中均有轉(zhuǎn)錄后基因沉默（ 是進(jìn)化過程中非常保守的生命現(xiàn)象。 et 999 首次發(fā)現(xiàn) 1995年 ，美國康奈爾大學(xué)的研究人員 于線蟲第一次卵裂是不對(duì)稱的 ， 所形成的子細(xì)胞的大小、胞漿成份、以后的發(fā)展命運(yùn)都不相同。 們注入反義 使之與 而阻斷蛋白的翻譯過程，達(dá)到阻斷 果發(fā)現(xiàn)反義是作為對(duì)照的正義 也同樣阻斷了該基因的表達(dá) et 1995。這種現(xiàn)象與反義 1998年，華盛頓卡耐基研究院的 4和 過電泳純化后 注射到線蟲中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有微弱的基因抑制作用。而將純化后的 義鏈和反義鏈的混合物）注入線蟲，發(fā)現(xiàn) 且抑制基因表達(dá)的效率比單鏈 個(gè)數(shù)量級(jí)。他們推測正義來的實(shí)驗(yàn)表明在線蟲消化道中注入會(huì)導(dǎo)致其第一代子代的同源基因沉默。他們將這種現(xiàn)象稱為 簡稱 (et 1998. 1999 年， 報(bào)道：在外源基因或病毒基因誘導(dǎo)產(chǎn)生 植物中發(fā)現(xiàn)大小均一的約 25 對(duì)核苷酸的 在無 植物中沒有檢測出 et 999。在果蠅、哺乳動(dòng)物的 驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)長 賴的酶剪切加工成小分子干擾 et 001; et 000; et 000，現(xiàn)在已經(jīng)證實(shí) 跨種屬的介導(dǎo) 關(guān)鍵因素，并與特異性識(shí)別同源靶序列密切相關(guān)。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 2 相關(guān)因子及 機(jī)制 模型 相關(guān)因子 啟動(dòng)因子 家族成員。在線蟲、果蠅、真菌、擬南芥中結(jié)構(gòu)保守。 et 001； et 002; et 001。氨基端解旋酶域；兩個(gè) 化區(qū)，參與 一個(gè)一個(gè) 區(qū)為含 110氨基酸，可與 與 NA(工成 效應(yīng)因子 一種與 有核酸內(nèi)切、外切酶活性，能識(shí)別、結(jié)合目標(biāo) 切 輔助或直接參與 以認(rèn)為后者的形成起源于前者的形成，從 2005; et 2005 在人類細(xì)胞中，已經(jīng)被確認(rèn)為 蠅 蟲 其中， 一龐大的蛋白家族，許多真核生物中有若干同源體，目前已確認(rèn)人類有 8個(gè)，果蠅有 5個(gè)，線蟲有 27個(gè)，同源體的功能有所差別，有些參與 些參與 果蠅的 現(xiàn) 一步用 現(xiàn)其含兩個(gè) of 其中， 擬南芥、線蟲、哺乳動(dòng)物中是同源的 et 2002。人類的 沉默可導(dǎo)致 是 體外培養(yǎng)細(xì)胞中，用 得到以下推測： 影響 并非 維持其穩(wěn)定性； 是一種與 括兩個(gè)亞型，兩者均與 果蠅中 2時(shí)可連接 果匹配完全， et 2001; et 2003；如果匹配不完全，則通過et 003 。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 3 大效應(yīng)所必需 生化和遺傳研究表明 ， NA 增強(qiáng) 001， 即以 同時(shí)復(fù)制觸發(fā)性 有的產(chǎn)物又可作為 始 et 2001觀察了依賴于 FP 用果蠅的非細(xì)胞系統(tǒng)提取物，在沒有靶 發(fā)性 全長的靶 被假定存在于胚胎提取液中的 后將從上述反應(yīng)混合物中純化的 可在一種非 綠色熒光素酶的負(fù)向調(diào)控下有效地靶向 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，用 32FP 結(jié)合，這個(gè)實(shí)驗(yàn)表明 合成的全長的 0分鐘之內(nèi)就能形成，并在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)被 一個(gè)合成的 合成的 端延伸，由此可以推定 在線蟲、真菌和植物系統(tǒng)中 導(dǎo)的 需 et 1999; et 2001; et 2001。 et 2001認(rèn)為 達(dá)到一個(gè)臨界濃度后， 是進(jìn)一步擴(kuò)增 合成的 后，新合成的 義鏈所引發(fā)進(jìn)入下一個(gè) 而解釋了 機(jī)制 模型 通過生化和遺傳學(xué)研究， et 2001提出了以下的 這一機(jī)制模型包括起始階段和效應(yīng)階段。起始 階段 ， 在 加入的 ， 以一種 毒感染等各 種方式引入的雙鏈 割將 1每個(gè)片斷的 3 端都有 2個(gè)堿基突出。在 激活 活的 到同源 然后 先 酸酶在 結(jié)合原先的 置切割 生新的 核酸酶形成復(fù)合物，繼續(xù)對(duì)目的 而使目的基因沉默。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 4 作用特征 有高度的特異性 對(duì)其它基因沒有影響 et 2002。 應(yīng)具有高效性 相對(duì)很少量的 數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于內(nèi)源 就能產(chǎn)生強(qiáng)烈的 個(gè)細(xì)胞僅需幾分子小干涉 可產(chǎn)生 可達(dá)到缺失突變體表型的程度 et 2001。而且， 的甚至可以傳遞數(shù)代 et 2000。 在放大效應(yīng) 通過線蟲、果蠅、小鼠等的 實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，少量的 表明括 行 沉默信號(hào)的擴(kuò)增等 et 2002。 生效應(yīng)的中介分子 長 1者為降解靶基因的中介分子，并決定 et 2001。