密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 he of 士研究生 ：羅術(shù)東 指 導(dǎo) 教 師 ：吳孔明 研究員 申請(qǐng)學(xué)位類別 ：農(nóng)學(xué)博士 專業(yè) ：農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治 研究方向 ：昆蟲毒理學(xué) 培養(yǎng)單位 ：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提交日期 2007 年 6 月 he of 007 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 摘要 摘 要 長(zhǎng)期大面積種植將導(dǎo)致靶標(biāo)害蟲抗性的產(chǎn)生。為延緩昆蟲對(duì)性的產(chǎn)生，人們提出了轉(zhuǎn)雙基因策略，但該策略有效實(shí)施的重要前提就是轉(zhuǎn)入的雙基因之間不存在交互抗性。本研究旨在利用生物測(cè)定的方法測(cè)定利用體外標(biāo)記結(jié)合和表面等離子體共振技術(shù)研究 棉鈴蟲中腸刷狀緣膜囊泡 (結(jié)合動(dòng)力學(xué)，以明確棉鈴蟲中與性相關(guān)的生化基礎(chǔ)。另外，還運(yùn)用酶標(biāo)板動(dòng)力學(xué)等方法研究了酯酶與毒素和毒素間的相互作用，以闡明酯酶與性的關(guān)系。全文主要結(jié)果如下： 1、 生物測(cè)定表明兩個(gè)性品系性分別達(dá) 和 ，對(duì)抗性分別為 和 ，說明對(duì)有抗性的棉鈴蟲對(duì)存在交互抗性；進(jìn)一步對(duì)、感品系結(jié)合動(dòng)力學(xué)研究表明：無論是在敏感品系內(nèi)還是抗性品系中， 間均不存在競(jìng)爭(zhēng)，說明了它們之間不存在共同的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合位點(diǎn)的不同是性棉鈴蟲對(duì)存在交互抗性的生理生化基礎(chǔ)。 2、 體外標(biāo)記結(jié)合表明棉鈴蟲對(duì) 生抗性后， 位點(diǎn) 2、 位點(diǎn) 1 的結(jié)合能力都會(huì)下降， 位點(diǎn) 2 的結(jié)合能力隨著抗性的增加而繼續(xù)減少，直至結(jié)合能力的喪失。但 位點(diǎn) 1 的結(jié)合能力下降到一定程度時(shí)不再下降。、感品系 的親和力沒有差異，但抗性品系中的結(jié)合位點(diǎn)濃度及結(jié)合能力顯著低于敏感品系。表面等離子體共振技術(shù)研究表明，在各品系與 結(jié)合過程中，敏感品系的結(jié)合速率明顯高于抗性品系。這些結(jié)果表明，結(jié)合位點(diǎn)濃度和結(jié)合速率的降低促使結(jié)合能力降低，結(jié)合能力的降低可能是棉鈴蟲對(duì) 性產(chǎn)生的重要因素。 3、 酶活性測(cè)定表明， 系 性棉鈴蟲的酯酶活性顯著高于敏感品系，但抗性品系中的堿性磷酸酯酶的活性卻顯著低于敏感品系。當(dāng)用 毒素和毒素處理酯酶時(shí)發(fā)現(xiàn)敏感品系棉鈴蟲的酯酶不能與它們結(jié)合，而抗性品系的卻能與二者結(jié)合。當(dāng)用酯酶處理毒素時(shí)，發(fā)現(xiàn)抗性品系棉鈴蟲的酯酶對(duì)前毒素的活化作用顯著低于敏感品系。據(jù)此，我們推測(cè)：棉鈴蟲體內(nèi)堿性磷酸酯酶的減少，減弱了其對(duì)前毒素的活化作用；同時(shí)，總酯酶在體內(nèi)的大量表達(dá)，并與前毒素和毒素發(fā)生更多的非特異性結(jié)合，使毒素減少或失去與中腸上皮細(xì)胞膜上受體結(jié)合的機(jī)會(huì)。在以上兩個(gè)因素的作用下，使得棉鈴蟲對(duì) 表現(xiàn)為抗性的產(chǎn)生。 綜上所述，無論是在 感棉鈴蟲還是抗性棉鈴蟲中， 白均不具有共同的結(jié)合位點(diǎn)，性棉鈴蟲對(duì) 存在交互抗性。因此，用于延緩棉鈴蟲對(duì) 抗性。 關(guān)鍵詞： 花, 性棉鈴蟲 , 交互抗性, 堿性磷酸酯酶 he of an in of is a of a of t in is of to is of be a of we on . by of . ry In . as 1、 ry of a 96S) . of tR . no 2、 in in . or it . In a of be to no . to to of to of At we it to it to . To no in . in of be of is by of 3、 be . We of in . by 50. of . of . At of to we . of at or to on of . In a . a of it be to . Bt 錄 摘要 . 一章 緒論 . 1 11 花生產(chǎn)應(yīng)用概況 . 1 12 結(jié)構(gòu)與作用機(jī)理 . 2 12 1 .2 2 .2 3 .3 昆蟲對(duì)性的生理生化基礎(chǔ) . 6 14 昆蟲體蛋白及其與抗性的關(guān)系 . 8 14 1 氨肽酶 N.4 2 鈣粘蛋白 .4 3 堿性磷酸酶和肌動(dòng)蛋白 . 11 14 4 醣脂 .5 害蟲抗性治理策略 . 12 16 毒素受體結(jié)合動(dòng)力學(xué)研究新方法表面等離子體共振技術(shù) . 15 16 1 .6 2 .6 3 受體結(jié)合中的應(yīng)用 .7 本文研究意義 . 18 18 研究技術(shù)路線 . 20 第二章 . 21 21 材料與方法 . 21 21 1 供試棉鈴蟲品系 .1 2 主要試劑與儀器 .1 3 部分溶液儲(chǔ)存液、緩沖液配方 .1 4 .1 5 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 .1 6 棉鈴蟲飼養(yǎng)條件及生測(cè)方法 .1 7 數(shù)據(jù)分析 .2 結(jié)果與分析 . 25 22 1 .V 22 2 供試各品系對(duì)抗性程度 .2 3 供試各品系對(duì)抗性程度 . 3 結(jié)論與討論 . 27 第三章 棉鈴蟲酯酶比較 . 29 31 材料與方法 . 29 31 1 供試?yán)ハx與毒素 .1 2 主要試劑與儀器 .1 3 部分試劑及緩沖液的配制 .1 4 酶液的制備、活力測(cè)定及酶譜分析 .1 5 .2 結(jié)果與分析 . 33 32 1 酶譜分析 .2 2 酶活性分析 .2 3 .2 4 酯酶液對(duì)毒素的酶解作用 .3 結(jié)論與討論 . 38 第四章 素的相互作用 . 40 41 材料與試劑 . 40 41 1 供試棉鈴蟲 .1 2 主要試劑 .1 3 部分儲(chǔ)存液、緩沖液配方 .1 4 主要儀器設(shè)備 .2 試驗(yàn)方法 . 42 42 1 棉鈴蟲抗、感品系制備與溶解 .2 2 .2 3 感品系的體外標(biāo)記結(jié)合動(dòng)力學(xué)研究 .2 4 數(shù)據(jù)分析 .3 結(jié)果與分析 . 44 43 1 .3 2 .4 結(jié)論與討論 . 52 44 1 有交互抗性的原因初探 .4 2 .五章 棉鈴蟲 合過程的實(shí)時(shí)測(cè)定 . 55 V 51 材料與方法 . 55 51 1 供試材料 .1 2 主要試劑與儀器 .1 3 樣品的前處理 .1 4 .2 結(jié)果與分析 . 57 52 1 處理 .2 2 .2 3 特異性結(jié)合 .2 4 的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 .3 結(jié)論與討論 . 67 53 1 、感品系實(shí)時(shí)結(jié)合 .3 2 .六章 全文結(jié)論與討論 . 71 61 全文主要結(jié)論 . 71 62 本研究的創(chuàng)新點(diǎn) . 72 63 有待于進(jìn)一步開展的工作 . 72 參考文獻(xiàn) . 74 致謝 . 88 作者簡(jiǎn)介 . 89 附錄 .定義書簽。 第一章 緒論 第一章 緒論 蘇云金芽孢桿菌( 一種革蘭氏陽性細(xì)菌，在其形成芽孢的過程中伴隨著具有殺蟲活性的伴孢晶體形成，因而又稱為殺蟲晶體蛋白( 它是目前應(yīng)用最為廣泛的微生物農(nóng)藥之一。 且可以顯著降低農(nóng)藥的使用量、增加農(nóng)民收益、增多農(nóng)田中天敵的種類和數(shù)量、有效保護(hù)生態(tài)環(huán)境 (Wu 2005) 。根據(jù)環(huán)境影響系數(shù)( 一種基于多種因素對(duì)單一活性成分構(gòu)成的純環(huán)境所造成影響的復(fù)合測(cè)試方法的測(cè)算表明，1996 年至2005年累計(jì)減少殺蟲劑的使用量達(dá)二十二萬四千三百噸的活性成分，相當(dāng)于作物用殺蟲劑對(duì)環(huán)境的破壞作用降低了14% (2006) 。因而，推廣定生產(chǎn)和害蟲綜合防治的重要措施之一。 然而，隨著 用量和轉(zhuǎn) 因作物的迅速增長(zhǎng)，轉(zhuǎn)入的 因在作物體內(nèi)的持續(xù)表達(dá)，使得害蟲在整個(gè)生長(zhǎng)周期都受到 蟲蛋白的高壓選擇，因而害蟲對(duì) 抗藥性已成為一個(gè)不容忽視的問題。雖然到目前為止，小菜蛾是唯一一種對(duì) 在抗性的田間昆蟲，但國(guó)內(nèi)外許多研究證明：已有分屬于鱗翅目、雙翅目和鞘翅目的昆蟲經(jīng)室內(nèi)篩選后可以對(duì) et 1985; et 1990; et 1993; et 1995; 唐振華等, 1996; et 1997；沈晉良等 , 1998；梁革梅等 , 2000a)。 2003 年， 現(xiàn)溫室中粉紋夜蛾對(duì) 在抗性，這是繼小菜蛾后又一個(gè)實(shí)驗(yàn)室外昆蟲對(duì)性的報(bào)道(2003) 。因此，在廣泛使用 劑和種植 物的時(shí)代，昆蟲對(duì) e et 1999)，古語云“未雨綢繆”，因而研究昆蟲對(duì) 抗性機(jī)制對(duì)于運(yùn)用 劑和 物來進(jìn)行害蟲綜合治理以及延長(zhǎng)轉(zhuǎn) 因作物的壽命就顯得尤為重要。 本章簡(jiǎn)略介紹了 花的生產(chǎn)概況，從 結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理入手，綜述了影響昆蟲對(duì) 述了昆蟲體內(nèi) 體蛋白的變異與抗性的關(guān)系，并對(duì) 物害蟲抗性治理策略進(jìn)行了概括。最后對(duì)研究昆蟲 素受體與 素相互作用中最有效的新技術(shù) 表面等離子體共振技術(shù)(進(jìn)行了介紹，并對(duì)其在該領(lǐng)域的研究做了簡(jiǎn)短回顧。 1 1 花生產(chǎn)應(yīng)用概況 利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)在棉株中導(dǎo)入抗蟲性素而選育成的其具有穩(wěn)定和連續(xù)的抗蟲效果，被認(rèn)為是害蟲管理最經(jīng)濟(jì)、最有效的防治方法。自1996年轉(zhuǎn)基因棉花在美國(guó)商業(yè)化種植以來，其種植面積在世界范圍內(nèi)快速增長(zhǎng)。 1996年，我國(guó)政府首次批準(zhǔn)單價(jià)抗蟲棉在國(guó)內(nèi)進(jìn)行預(yù)中試和中試， 1997年初批準(zhǔn)進(jìn)行環(huán)境釋放試驗(yàn)， 1997年底批準(zhǔn)進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)。 1999年，由美國(guó)孟山都（司、中國(guó)農(nóng)科院生物技術(shù)研究所和棉花所等分別成功研制的轉(zhuǎn)基因棉保鈴新棉33B 、 獲得農(nóng)業(yè)部門的基因安全性檢驗(yàn)后以商業(yè)運(yùn)作的模式在生產(chǎn)領(lǐng)域得到迅速推廣，美國(guó)孟山都公司的33B 棉同年在中國(guó)的主栽省河北的植棉面積達(dá)101中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒論 萬公頃左右。從此，抗蟲棉種植面積不斷擴(kuò)大。 2001年以前，我國(guó)的花主要種植于黃河流域棉區(qū)( 如河北，河南，山東和山西等省) ，種植面積約50 萬公頃。截至到2006年，我國(guó)的植面積也從當(dāng)初的10萬公頃提高到了2006 年的350 萬公頃，居全球第六位，占全國(guó)棉花種植面積的66 (2006)。 u et 2003; et 2004; 2005; 李號(hào)賓等, 2006; 吳孔明 , 2007)。據(jù)2006年，包括美國(guó)、中國(guó)、印度、澳大利亞、阿根廷、巴西、南非、墨西哥、哥倫比亞在內(nèi)的9 個(gè)國(guó)家總計(jì)種植以2006)。但和其它的化學(xué)農(nóng)藥一樣，隨著標(biāo)害蟲也有可能對(duì)花產(chǎn)生抗性，從而導(dǎo)致Wu 2005) 。 為延緩靶標(biāo)害蟲對(duì)花抗性的產(chǎn)生，多種物抗性治理策略得以提出，其中轉(zhuǎn)雙價(jià)基因棉被認(rèn)為是一種比較有效的措施。截至到2006 年，由美國(guó)孟山都 (公司研制的轉(zhuǎn)大利亞、南非、墨西哥和菲律賓等國(guó)商品化種植。同時(shí)，基于些具有與原來素不同作用機(jī)理的新抗蟲基因( 如