.,第九章,免疫檢測技術(shù),.,免疫檢測是目前生物學(xué)檢測方法中用途最廣泛的一種方法。具有高度精確、靈敏、特異的特點?？捎糜诿庖邔W(xué)的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究，也可應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域。,.,1、免疫疾病診斷2、動物植物生理活動研究（激素、維生素）3、物種及微生物鑒定4、動物、植物性狀的免疫標(biāo)記5、免疫增強藥物和疫苗的研究6、發(fā)病機理研究7、分子生物學(xué)研究,免疫檢測技術(shù)在生物科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用：,.,第一節(jié)抗原抗體反應(yīng)原理,抗體能特異性地識別相應(yīng)的抗原，并與之結(jié)合。這種結(jié)合在體外也能發(fā)生，當(dāng)抗原和抗體在體外特異性結(jié)合后可出現(xiàn)肉眼可見或借助儀器可檢測出的反應(yīng)現(xiàn)象。試驗時既可用已知抗體檢測標(biāo)本中有無相應(yīng)抗原，也可用已知抗原檢測標(biāo)本中有無相應(yīng)抗體。,這種特性就是許多免疫檢測方法的基礎(chǔ)!,.,一、體外抗原抗體反應(yīng)的特點,特異性：抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性?？赡嫘裕嚎乖贵w反應(yīng)所形成的復(fù)合物較穩(wěn)定，但在一定條件下可解離。（低酸、高鹽）比例性：抗原抗體的比例合適，才可出現(xiàn)可見的反應(yīng)現(xiàn)象。（網(wǎng)格理論）階段性：特異性結(jié)合階段和可見反應(yīng)階段。,.,網(wǎng)格理論解釋抗原抗體形成沉淀的機制,網(wǎng)格學(xué)說（latticetheory）,抗體過剩,抗原過剩,抗體抗體比例合適,抗原,抗體,.,二、影響抗原抗體反應(yīng)的因素,溫度：在一定溫度范圍內(nèi)，提高溫度可加速反應(yīng)速度，縮短反應(yīng)時間，常用反應(yīng)溫度為37-45。溶液的pH：pH過高或過低可改變抗原和抗體理化性質(zhì)，影響反應(yīng)結(jié)果，因此溶液的pH應(yīng)適宜（pH6-8）。電解質(zhì)：反應(yīng)中必須有適宜的電解質(zhì)（0.85%NaCl）參與，否則不出現(xiàn)可見反應(yīng)。,.,三、抗原抗體反應(yīng)類型,1.沉淀反應(yīng)2.凝集反應(yīng)3.補體參與的反應(yīng)4.中和反應(yīng)5.免疫標(biāo)記技術(shù),.,第二節(jié)常見免疫檢測方法,可溶性抗原（血清蛋白、病毒抗原、細胞裂解液或組織液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下形成肉眼可見的沉淀物稱沉淀反應(yīng)。,一、免疫沉淀反應(yīng),.,一、免疫沉淀反應(yīng),1.液相沉淀反應(yīng),2.凝膠擴散沉淀,3.凝膠免疫電泳,絮狀沉淀,環(huán)狀沉淀,免疫濁度沉淀,單向瓊脂擴散試驗,雙向瓊脂擴散試驗,血清免疫電泳,火箭電泳,對流免疫電泳,免疫印跡等,.,絮狀沉淀試驗,操作步驟：（1）將可溶性抗原作一系列倍比稀釋。（2）各管加入一定濃度的適量抗血清。（3）振搖使抗原、抗體充分混勻，置37孵育。（4）產(chǎn)生沉淀量隨抗原量而不同，以出現(xiàn)沉淀物最多的管為最適比例管。絮狀沉淀試驗方法簡單，設(shè)備要求低，敏感度較低，目前多用以測定抗原抗體反應(yīng)的最適比。,.,環(huán)狀沉淀試驗,操作步驟：（1）用毛細滴管吸取抗血清加于沉淀管（550mm）底部，避免產(chǎn)生氣泡。（已知！）（2）將抗原溶液沿管壁緩緩疊加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。（待測?。?）置沉淀管于室溫下使其反應(yīng)，15min內(nèi)在兩界面間呈現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)為陽性。30min仍無沉淀環(huán)出現(xiàn)則為陰性。應(yīng)用：主要用于抗原的定性試驗。用已知抗體來檢測未知抗原。（診斷炭疽的Ascoli實驗、細菌分型、血跡鑒定）。,.,2.凝膠擴散沉淀,凝膠擴散沉淀是指抗原與抗體在凝膠介質(zhì)中自由擴散形成濃度梯度，抗原與抗體在比例合適的擴散部位相遇形成沉淀線的反應(yīng)。常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝膠等。最常用的方法為：單向瓊脂擴散試驗雙向瓊脂擴散試驗,.,單向瓊脂擴散試驗,原理：將適當(dāng)濃度的抗體混入瓊脂凝膠中，瓊脂凝固后，打成小孔，加入待測的抗原物質(zhì)，使抗原在凝膠中由小孔自由向周圍擴散，并在小孔周圍合適的位置與抗體結(jié)合形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)的大小與抗原濃度呈正相關(guān)。,.,單向免疫擴散試驗示意圖,.,雙向免疫擴散試驗,雙向免疫擴散試驗是在瓊脂板上按一定距離打數(shù)個小孔，在相鄰的兩孔內(nèi)分別放入抗原和抗體材料。當(dāng)抗原和抗體向四周凝膠中擴散，在兩孔間可出現(xiàn)23條沉淀線，本法常用于抗原或抗體的定性或定量檢測，或用于兩種抗原材料的抗原相關(guān)性分析。,.,.,3.免疫電泳技術(shù),免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物。這種技術(shù)有兩大優(yōu)點：一是加快了沉淀反應(yīng)的速度，二是將某些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分開，再分別與抗體反應(yīng)，以此作更細微的分析。免疫電泳包括:血清免疫電泳、對流免疫電泳、火箭電泳、免疫印跡等,.,血清免疫電泳,將抗原混合物（病人血清）在凝膠中用電泳分離后，沿電泳方向挖一平行的小槽，加入抗血清，進行雙向擴散。沉淀線的特點顯示病人血清與正常人血清存在的差異，即血清蛋白組分的缺少或增加。,.,免疫電泳原理圖解,.,火箭免疫電泳,火箭免疫電泳技術(shù)又稱作單向電泳擴散免疫沉淀試驗，它是由單向擴散發(fā)展起來的一項定量技術(shù)，實質(zhì)上是加速度的單向擴散。,.,沉淀線的高度與抗原量成正比,火箭電泳圖,.,二、凝集反應(yīng)（Agglutination）,顆粒性抗原（如細菌、細胞）與相應(yīng)抗體，在適當(dāng)電解質(zhì)存在的條件下，經(jīng)過一定時間后出現(xiàn)肉眼可見凝集塊稱為凝集反應(yīng)。1、直接凝集：將細菌或紅細胞與相應(yīng)的抗體直接反應(yīng)，出現(xiàn)細菌凝集或紅細胞凝集現(xiàn)象。又分為玻片法和試管法。2、間接凝集：將可溶性抗原包被在紅細胞或乳膠顆粒表面，與相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)顆粒凝集現(xiàn)象。,.,.,妊娠免疫診斷試驗,孕婦尿中，絨毛膜促性腺激素（HCG）含量明顯增高。（HCG是可溶性抗原）反之，非孕婦尿中HCG含量甚微，不足以消耗掉抗HCG抗體。,.,三、補體結(jié)合實驗,（2個系統(tǒng)，5種成分）,.,已知抗原加入血清（檢測抗體）,加入標(biāo)準量補體,加入包被抗體的紅細胞,檢測紅細胞溶解情況,Ag,Ag,三、補體結(jié)合實驗,（2個系統(tǒng)，5種成分）,.,免疫標(biāo)記技術(shù)是采用酶、熒光素、放射性核素等標(biāo)記物標(biāo)記抗原或抗體所進行的抗原抗體反應(yīng)。免疫標(biāo)記技術(shù)既可對樣品作定性、定量檢測，也可進行定位分析，且大大提高了方法的靈敏度，是目前應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)檢測技術(shù)。,四、免疫標(biāo)記技術(shù),.,常見標(biāo)記免疫技術(shù),放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù),四、免疫標(biāo)記技術(shù),.,該法是用放射性核素作為標(biāo)記物標(biāo)記抗原或抗體所進行的抗原抗體反應(yīng)，盡管放射免疫技術(shù)需特殊儀器設(shè)備且有一定的放射性危害，但由于其具有高度的靈敏度（pg）和自動化檢測等特點，因此在實驗研究和臨床檢測中仍被廣泛應(yīng)用。主要用于激素、小分子藥物、腫瘤標(biāo)志物等小分子化合物的定量分析。,1.放射免疫技術(shù)（125I）,.,放射免疫分析基本原理,競爭性結(jié)合反應(yīng)的經(jīng)典標(biāo)記抗原（Ag*）和非標(biāo)記抗原（Ag）與限量抗體(Ab)競爭性結(jié)合Ag*和Ag具有等同的與Ab結(jié)合能力,.,放射免疫測定法(RIA)示意圖,.,RIA法原理及標(biāo)準曲線,75,50,30,10,0,1,10,100,1000,未標(biāo)記抗原濃度（ng/mL),結(jié)合/未結(jié)合的放射活性（%）,Ag*-Ab,Ag*,.,將熒光素（異硫氰酸熒光素或羅丹明等）標(biāo)記抗體，制成熒光抗體診斷試劑。用熒光顯微鏡觀察熒光的產(chǎn)生或熒光強度，以此判斷抗原的存在、定位和分布情況。免疫熒光技術(shù)有直接法和間接法等。,2.免疫熒光技術(shù),.,免疫熒光技術(shù)直接法,.,免疫熒光技術(shù)間接法,.,免疫熒光染色顯示細胞骨架,免疫熒光染色是利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，用經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗體對細胞或組織內(nèi)的蛋白質(zhì)進行定性或定量研究的方法。該技術(shù)與熒光顯微鏡觀察相結(jié)合，可對特定的蛋白質(zhì)進行細胞或組織內(nèi)的精確定位。,常用于抗原、抗體標(biāo)記的熒光染料有以下幾種顯示綠色熒光：Fluoresceinisothocyancie(FITC),Alexa-488顯示紅色熒光：RhodamineB,TexasRed,Alexa-546,568,594顯示藍色熒光：Alexa350,用Alexa488標(biāo)記的抗人-tubulin抗體染色顯示微管(綠色);細胞核:紅色,DAPI染色,人皮膚角化細胞免疫熒光染色,用抗-tubulin抗體染色顯示微管(綠色);細胞核:紅色,DAPI染色(激光共聚焦顯微鏡照片),PtK1細胞免疫熒光染色,.,本法是抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶對底物的高效催化活性相結(jié)合的免疫檢測技術(shù)。酶標(biāo)記的抗原或抗體與待檢標(biāo)本中的相應(yīng)成分特異性結(jié)合，根據(jù)酶作用底物后的顏色變化，采用肉眼或酶標(biāo)檢測儀分析、判斷結(jié)果。常用方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗和酶免疫組化法，前者用于檢測可溶性抗原或抗體，后者常用于檢測組織中或細胞表面的抗原。,3.免疫酶測定法,.,是在固相載體（通常為聚苯乙烯反應(yīng)板）表面進行的抗原抗體反應(yīng)。實驗中常用的酶是辣根過氧化物酶（HRP），底物為二苯基聯(lián)苯胺。,酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：,.,ELISA試驗三個必要的試劑,(1)固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）(2)酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）(3)酶作用的底物（顯色劑）,.,底物顯色定性或定量的分析,原理,包被,反應(yīng)加入待測抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體,洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離,1,2,3,4,基本步驟,.,五種常見的檢測方法,1雙抗夾心法（測定抗原）2測定抗體的間接法3競爭法（測定抗原）4捕獲包被法測IgM抗體5ABS-ELISA法,.,適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及低于二價的小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心,1雙抗夾心法測抗原,.,2間接法測抗體,.,幾種標(biāo)記/檢測技術(shù)靈敏度的比較,酶標(biāo),熒光,放免,發(fā)光,靈敏度(mol/L),10-1810-1510-1210-9,.,幾種標(biāo)記/檢測試劑的有效期比較,酶標(biāo),熒光,放免,發(fā)光,有效期（月）,1815129630,.,人民幣,人民幣,三種免疫測定技術(shù)的成本及費用,三種免疫測定技術(shù)的成本及費用,放免,酶標(biāo),發(fā)光,.,A.將Ab吸附在固相載體表面;B.加入酶標(biāo)Ag和待測Ag，競爭結(jié)合Ab；對照只加入酶標(biāo)Ag；C.加底物。對照孔與樣品孔底物降解量的差未知Ag量。,3競爭法測定抗原,.,血清標(biāo)本中的IgM包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結(jié)合抗人IgM抗體包被加入血清標(biāo)本加入特異性抗原試劑加入針對特異性抗原的酶標(biāo)抗體加底物顯色,4捕獲包被法測IgM抗體,.,捕獲法,原理：抗人IgM鏈抗體包被捕獲待測標(biāo)本中IgM類抗體加入特異性抗原和酶標(biāo)記特異性抗原的抗體底物顯色,.,ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(tǒng)(system)的略語