第五章微生物的新陳代謝,代謝概論第一節(jié)微生物的能量代謝第二節(jié)微生物特有的合成代謝途徑第三節(jié)微生物次級(jí)代謝與次級(jí)代謝產(chǎn)物第四節(jié)微生物代謝與生產(chǎn)實(shí)踐,代謝概論,一、代謝是生命的基本特征,二、代謝通過(guò)代謝途徑完成,三、代謝途徑是不平衡的穩(wěn)態(tài)體系,四、代謝途徑的形式多樣,五、代謝途徑有明確的細(xì)胞定位,六、代謝途徑相互溝通,七、代謝途徑間有能量關(guān)聯(lián),八、關(guān)鍵酶限制代謝途徑的流量,新陳代謝：發(fā)生在活細(xì)胞中的各種分解代謝（catabolism）和合成代謝（anabolism）的總和。新陳代謝=分解代謝+合成代謝分解代謝：指復(fù)雜的有機(jī)物分子通過(guò)分解代謝酶系的催化，產(chǎn)生簡(jiǎn)單分子、腺苷三磷酸（ATP）形式的能量和還原力的作用過(guò)程。合成代謝：指在合成代謝酶系的催化下，由簡(jiǎn)單小分子、ATP形式的能量和還原力一起合成復(fù)雜的大分子的過(guò)程。,按物質(zhì)轉(zhuǎn)化方式分：分解代謝：指細(xì)胞將大分子物質(zhì)降解成小分子物質(zhì)，并在這個(gè)過(guò)程中產(chǎn)生能量。合成代謝：是指細(xì)胞利用簡(jiǎn)單的小分子物質(zhì)合成復(fù)雜大分子的過(guò)程。在這個(gè)過(guò)程中要消耗能量。,物質(zhì)代謝：物質(zhì)在體內(nèi)轉(zhuǎn)化的過(guò)程。能量代謝：伴隨物質(zhì)轉(zhuǎn)化而發(fā)生的能量形式相互轉(zhuǎn)化。按代謝產(chǎn)物在機(jī)體中作用不同分：初級(jí)代謝：提供能量、前體、結(jié)構(gòu)物質(zhì)等生命活動(dòng)所必須的代謝物的代謝類(lèi)型；產(chǎn)物：氨基酸、核苷酸等。次級(jí)代謝：在一定生長(zhǎng)階段出現(xiàn)非生命活動(dòng)所必需的代謝類(lèi)型；產(chǎn)物：抗生素、色素、激素、生物堿等,一、概述,第一節(jié)微生物的能量代謝,能量代謝是新陳代謝中的核心問(wèn)題。中心任務(wù)：把外界環(huán)境中的各種初級(jí)能源轉(zhuǎn)換成對(duì)一切生命活動(dòng)都能使用的能源ATP。,有機(jī)物最初能源日光通用能源還原態(tài)無(wú)機(jī)物,化能自養(yǎng)菌,化能異養(yǎng)菌,光能營(yíng)養(yǎng)菌,1、化能異養(yǎng)微生物的生物氧化和產(chǎn)能過(guò)程：脫氫（或電子）遞氫（或電子）受氫（或電子）功能：產(chǎn)能（ATP）、還原力H、小分子中間代謝產(chǎn)物等。,葡萄糖降解代謝途徑生物氧化：發(fā)酵作用產(chǎn)能過(guò)程呼吸作用（有氧或無(wú)氧呼吸）,生物氧化的形式：某物質(zhì)與氧結(jié)合、脫氫或脫電子三種,生物氧化的功能為：產(chǎn)能（ATP）、產(chǎn)還原力H和產(chǎn)小分子中間代謝物,自養(yǎng)微生物利用無(wú)機(jī)物異養(yǎng)微生物利用有機(jī)物,生物氧化,能量,微生物直接利用,儲(chǔ)存在高能化合物（如ATP）中,以熱的形式被釋放到環(huán)境中,2、化能自養(yǎng)微生物的生物氧化與產(chǎn)能通常是化能自養(yǎng)型細(xì)菌，一般是好氧菌。利用卡爾文循環(huán)固定C02作為它們的碳源。其產(chǎn)能的途徑主要也是借助于無(wú)機(jī)電子供體(能源物質(zhì))的氧化，從無(wú)機(jī)物脫下的氫(電子)直接進(jìn)入呼吸鏈通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生ATP。代謝特點(diǎn)1）無(wú)機(jī)底物脫下的氫（電子）從相應(yīng)位置直接進(jìn)入呼吸鏈2）存在多種呼吸鏈3）產(chǎn)能效率低；4）生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)細(xì)胞率低。,3、光能自養(yǎng)或異氧微生物的產(chǎn)能代謝指具有捕捉光能并將它用于合成ATP和產(chǎn)生NADH或NADPH的微生物。分為不產(chǎn)氧光合微生物和產(chǎn)氧光合微生物。前者利用還原態(tài)無(wú)機(jī)物H2S，H2或有機(jī)物作還原C02的氫供體以生成NADH和NADPH。后者由H2O分子光解產(chǎn)物H+和電子形成還原力(NADPH+H+),二、葡萄糖降解代謝途徑（EMP、HMP、ED、PK途徑等。）1）EMP途徑（糖酵解途徑、己糖二磷酸途徑）葡萄糖2丙酮酸有氧：EMP途徑與TCA途徑連接；無(wú)氧：還原一些代謝產(chǎn)物，(專(zhuān)性厭氧微生物)產(chǎn)能的唯一途徑。產(chǎn)能：（底物磷酸化）產(chǎn)能：（1）1，3P-甘油醛3P-甘油酸+ATP；（2）PEP丙酮酸+ATP,10步反應(yīng),葡萄糖的酵解作用(又稱(chēng)：Embden-Meyerhof-Parnas途徑，簡(jiǎn)稱(chēng)：EMP途徑),EMP途徑關(guān)鍵步驟,1.葡萄糖磷酸化1.6二磷酸果糖(耗能)2.1.6二磷酸果糖2分子3-磷酸甘油醛3.3-磷酸甘油醛丙酮酸總反應(yīng)式：葡萄糖+2NAD+2ADP+2Pi2丙酮酸+2NADH+2H+2ATPCoA丙酮酸脫氫酶乙酰CoA，進(jìn)入TCA,磷酸果糖激酶,EMP途徑的關(guān)鍵酶，在生物中有此酶就意味著存在EMP途徑需要ATP和Mg+在活細(xì)胞內(nèi)催化的反應(yīng)是不可逆的反應(yīng),分為兩個(gè)階段：1、3個(gè)分子6-磷酸葡萄糖在6-磷酸葡萄糖脫氫酶和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶等催化下經(jīng)氧化脫羧生成6個(gè)分子NADPH+H+，3個(gè)分子CO2和3個(gè)分子5-磷酸核酮糖2、5-磷酸核酮糖在轉(zhuǎn)酮酶和轉(zhuǎn)醛酶催化下使部分碳鏈進(jìn)行相互轉(zhuǎn)換，經(jīng)三碳、四碳、七碳和磷酸酯等，最終生成2分子6-磷酸果糖和1分子3-磷酸甘油醛。,2）HMP途徑（磷酸戊糖途徑、旁路途徑）,6-磷酸果糖出路：可被轉(zhuǎn)變重新形成6-磷酸葡糖，回到磷酸戊糖途徑。甘油醛-3-磷酸出路：a、經(jīng)EMP途徑，轉(zhuǎn)化成丙酮酸，進(jìn)入TCA途徑b、變成己糖磷酸，回到磷酸戊糖途徑?？偡磻?yīng)式：66-磷酸葡萄糖+12NADP+6H2O56-磷酸葡萄糖+6CO2+12NADPH+12H+Pi特點(diǎn)：a、不經(jīng)EMP途徑和TCA循環(huán)而得到徹底氧化，無(wú)ATP生成；b、產(chǎn)大量的NADPH+H+還原力；c、產(chǎn)各種不同長(zhǎng)度的重要的中間物（5-磷酸核糖、4-磷酸-赤蘚糖）；d、單獨(dú)HMP途徑較少，一般與EMP途徑同存；e、HMP途徑是戊糖代謝的主要途徑。,HMP途徑的生理學(xué)意義,供應(yīng)合成原料：磷酸戊糖、4-磷酸-赤蘚糖為原料。產(chǎn)還原力。作為固定CO2的中介。擴(kuò)大碳源利用范圍。連接EMP途徑。提供發(fā)酵產(chǎn)物：核苷酸、氨基酸、輔酶,3）ED途徑2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖酸裂解途徑1952年Entner-Doudoroff：嗜糖假單胞菌過(guò)程：（4步反應(yīng)）1葡萄糖6-磷酸-葡萄糖6-磷酸-葡糖酸,KDPG,6-磷酸-葡萄糖-脫水酶,3-磷酸-甘油醛+丙酮酸,KDPG醛縮酶,特點(diǎn):a、步驟簡(jiǎn)單b、產(chǎn)能效率低：1ATPc、關(guān)鍵中間產(chǎn)物KDPG特征酶：KDPG醛縮酶細(xì)菌：銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、根瘤菌、固氮菌、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌等。,4）PK途徑（磷酸酮解酶途徑）,a、磷酸戊糖酮解酶途徑（腸膜明串珠菌、番茄乳桿菌、甘露醇乳桿菌、短桿乳桿菌）G5-磷酸-木酮糖,乙酰磷酸+3-磷酸-甘油醛,特征性酶木酮糖酮解酶,乙醇,丙酮酸,乳酸,1G乳酸+乙醇+1ATP+NADPH+H+,G6-磷酸-果糖,b、磷酸己糖酮解酶途徑又稱(chēng)HK途徑（兩歧雙歧桿菌）,4-磷酸-赤蘚糖+乙酰磷酸,特征性酶磷酸己糖酮解酶,3-磷酸甘油醛+乙酰磷酸,5-磷酸-木酮糖，5-磷酸-核糖,乙酸,戊糖酮解酶,6-磷酸-果糖,乳酸,乙酸,1G乳酸+1.5乙酸+2.5ATP,TCA循環(huán)的重要特點(diǎn),1、循環(huán)一次的結(jié)果是乙酰CoA的乙酰基被氧化為2分子CO2,并重新生成1分子草酰乙酸；2、整個(gè)循環(huán)有四步氧化還原反應(yīng)，其中三步反應(yīng)中將NAD+還原為NADH+H+，另一步為FAD還原；3、為糖、脂、蛋白質(zhì)三大物質(zhì)轉(zhuǎn)化中心樞紐；4、循環(huán)中的某些中間產(chǎn)物是一些重要物質(zhì)生物合成的前體；5、生物體提供能量的主要形式；6、為人類(lèi)利用生物發(fā)酵生產(chǎn)所需產(chǎn)品提供主要的代謝途徑。如:檸檬酸發(fā)酵；Glu發(fā)酵等。,1、定義廣義：利用微生物生產(chǎn)有用代謝產(chǎn)物的一種生產(chǎn)方式。狹義：厭氧條件下，以自身內(nèi)部某些中間代謝產(chǎn)物作為最終氫（電子）受體的產(chǎn)能過(guò)程特點(diǎn)：1）通過(guò)底物水平磷酸化產(chǎn)ATP；2）葡萄糖氧化不徹底，大部分能量存在于發(fā)酵產(chǎn)物中；3）產(chǎn)能率低；4）產(chǎn)多種發(fā)酵產(chǎn)物。,三、發(fā)酵（fermentantion）,發(fā)酵的定義（1）狹義“發(fā)酵”的定義在生物化學(xué)或生理學(xué)上發(fā)酵是指微生物在無(wú)氧條件下，分解各種有機(jī)物質(zhì)產(chǎn)生能量的一種方式，或者更嚴(yán)格地說(shuō)，發(fā)酵是以有機(jī)物作為電子受體的氧化還原產(chǎn)能反應(yīng)。如葡萄糖在無(wú)氧條件下被微生物利用產(chǎn)生酒精并放出二氧化碳。同時(shí)獲得能量，丙酮酸被還原為乳酸而獲得能量等等。,（2）廣義“發(fā)酵”的定義工業(yè)上所稱(chēng)的發(fā)酵是泛指利用生物細(xì)胞制造某些產(chǎn)品或凈化環(huán)境的過(guò)程，它包括厭氧培養(yǎng)的生產(chǎn)過(guò)程，如酒精、丙酮丁醇、乳酸等，以及通氣（有氧）培養(yǎng)的生產(chǎn)過(guò)程，如抗生素、氨基酸、酶制劑等的生產(chǎn)。產(chǎn)品既有細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也包括菌體細(xì)胞、酶等。,發(fā)酵的類(lèi)型根據(jù)發(fā)酵的特點(diǎn)和微生物對(duì)氧的不同需要，可以將發(fā)酵分成若干類(lèi)型：1，按發(fā)酵原料來(lái)區(qū)分：糖類(lèi)物質(zhì)發(fā)酵、石油發(fā)酵及廢水發(fā)酵等類(lèi)型。2，按發(fā)酵產(chǎn)物來(lái)區(qū)分：如氨基酸發(fā)酵、有機(jī)酸發(fā)酵、抗生素發(fā)酵、酒精發(fā)酵、維生素發(fā)酵等。3，按發(fā)酵形式來(lái)區(qū)分：固態(tài)發(fā)酵和深層液體發(fā)酵。4，按發(fā)酵工藝流程區(qū)分：分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵和流加發(fā)酵。5，按發(fā)酵過(guò)程中對(duì)氧的不同需求來(lái)區(qū)分：厭氧發(fā)酵和通風(fēng)發(fā)酵兩大類(lèi)型。,淀粉的分解,淀粉：直鏈、支鏈1、液化型淀粉酶（淀粉酶）枯草桿菌2、糖化型淀粉酶：三種淀粉1，4麥芽糖苷酶（淀粉酶）特點(diǎn)：從非還原性末端開(kāi)始，按雙糖為單位，生成麥芽糖，不作用于1，6，產(chǎn)物是麥芽糖和極限糊精。,3、淀粉1，4葡萄糖糖苷酶（糖化酶）特點(diǎn)：以葡萄糖為單位，能越過(guò)1，6，根霉和曲霉。4、淀粉1，6葡萄糖苷酶（異淀粉酶）1，6糖苷鍵。,2、發(fā)酵類(lèi)型1）乙醇發(fā)酵a、酵母型乙醇發(fā)酵1G2丙酮酸2乙醛+CO22乙醇+2ATP條件：pH3.54.5,厭氧菌種：釀酒酵母、少數(shù)細(xì)菌（胃八疊球菌、解淀粉歐文氏菌等）i、加入NaHSO3NaHSO3+乙醛磺化羥乙醛（難溶）ii、弱堿性（pH7.5）2乙醛1乙酸+1乙醇（歧化反應(yīng)）磷酸二羥丙酮作為氫受體，經(jīng)水解去磷酸生成甘油甘油發(fā)酵,（EMP）,-亞硫酸氫鈉必須控制亞適量（3%）,概念菌種途徑特點(diǎn)發(fā)生條件,當(dāng)發(fā)酵液處在堿性條件下，酵母的乙醇發(fā)酵會(huì)改為甘油發(fā)酵。原因：該條件下產(chǎn)生的乙醛不能作為正常受氫體，結(jié)果2分子乙醛間發(fā)生歧化反應(yīng)，生成1分子乙醇和1分子乙酸；,CH3CHO+H2O+NAD+CH3COOH+NADH+H+CH3CHO+NADH+H+CH3CH2OH+NAD+此時(shí)也由磷酸二羥丙酮擔(dān)任受氫體接受3-磷酸甘油醛脫下的氫而生成-磷酸甘油，后者經(jīng)-磷酸甘油酯酶催化，生成甘油。,2葡萄糖2甘油+乙醇+乙酸+2CO2,巴斯德效應(yīng)(ThePasteureffect),現(xiàn)象：,通風(fēng)對(duì)酵母代謝的影響,概念：有氧條件下，發(fā)酵作用受抑制的現(xiàn)象（或氧對(duì)發(fā)酵的抑制現(xiàn)象）。意義：合理利用能源機(jī)理：,巴斯德效應(yīng)（續(xù)）,葡萄糖6-磷酸-葡萄糖6-磷酸-果糖1,6-二磷酸果糖磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙酰CoA,草酰乙酸,檸檬酸,6-磷酸-葡萄糖磷酸烯醇式丙酮酸,-ADP,AMP,-ATP、檸檬酸,-ADP,AMP,1,6-二-磷酸-果糖,己糖激酶,磷酸果糖激酶(PFK),丙酮酸激酶,b、細(xì)菌型乙醇發(fā)酵(發(fā)酵單胞菌和嗜糖假單胞菌)同型酒精發(fā)酵1G2丙酮酸代謝速率高，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率高，發(fā)酵周期短等。缺點(diǎn)是生長(zhǎng)pH較高，較易染雜菌，并且對(duì)乙醇的耐受力較酵母菌低.,（ED）,乙醇+1ATP,異型酒精發(fā)酵(乳酸菌、腸道菌和一些嗜熱細(xì)菌）1G2丙酮酸,（丙酮酸甲酸解酶）,乙醛乙醇,甲酸+乙酰-CoA,無(wú)丙酮酸脫羧酶而有乙醛脫氫酶,利用Z.mobilis等細(xì)菌生產(chǎn)酒精,優(yōu)點(diǎn)：代謝速率高；產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率高；菌體生成少;代謝副產(chǎn)物少；發(fā)酵溫度高；,缺點(diǎn)：pH5較易染菌；耐乙醇力較酵母低,2）乳酸發(fā)酵同型乳酸發(fā)酵（德氏乳桿菌、植物乳桿菌等）EMP途徑（丙酮酸乳酸）異型乳酸發(fā)酵（PK途徑）腸膜明串株菌（PK）產(chǎn)能：1ATP雙歧雙歧桿菌（PK、HK）產(chǎn)能：2G5ATP即1G2.5ATP,葡萄糖,3-磷酸甘油醛,磷酸二羥丙酮,2(1,3-二-磷酸甘油酸）,2乳酸2丙酮酸,同型乳酸發(fā)酵,2NAD+2NADH,4ATP,4ADP,2ATP2ADP,Lactococcuslactis（乳酸乳球菌）Lactobacillusplantarum（植物乳酸菌）,概念菌種途徑特點(diǎn),異型乳酸發(fā)酵：,葡萄糖,6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖酸,5-磷酸木酮糖,3-磷酸甘油醛,乳酸,乙酰磷酸,NAD+NADH,NAD+NADH,ATPADP,乙醇乙醛乙酰CoA,2ADP2ATP,-2H,概念菌種途徑特點(diǎn),-CO2,乳酸細(xì)菌能利用葡萄糖及其他相應(yīng)的可發(fā)酵的糖產(chǎn)生乳酸，稱(chēng)為乳酸發(fā)酵。由于菌種不同，代謝途徑不同，生成的產(chǎn)物有所不同，將乳酸發(fā)酵又分為同型乳酸發(fā)酵、異型乳酸發(fā)酵和雙歧桿菌發(fā)酵。同型乳酸發(fā)酵：（經(jīng)EMP途徑）異型乳酸發(fā)酵：（經(jīng)HMP途徑）雙歧桿菌發(fā)酵:（經(jīng)HK途徑磷酸己糖解酮酶途徑）,3)混合酸、丁二醇發(fā)酵a混合酸發(fā)酵：腸道菌（E.coli、沙氏菌、志賀氏菌等）,1G,丙酮酸,乳酸,乳酸脫氫酶,磷酸轉(zhuǎn)乙?；?乙醛脫氫酶,乙酸激酶,乙醇脫氫酶,乙酸,乙醇,E.coli與志賀氏菌的區(qū)別：葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)：E.coli、產(chǎn)氣腸桿菌甲酸CO2+H2（甲酸氫解酶、H+）志賀氏菌無(wú)此酶，故發(fā)酵G不產(chǎn)氣。,CO2+H2,鑒別腸道細(xì)菌的V.P.試驗(yàn),鑒別原理縮合脫羧2丙酮酸乙酰乳酸乙酰甲基甲醇?jí)A性條件2,3-丁二醇二乙酰（與培養(yǎng)基中精氨酸的胍基結(jié)合）紅色化合物,-CO2,鑒別腸道細(xì)菌的產(chǎn)酸產(chǎn)氣、甲基紅（M.R）試驗(yàn),產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn)：Escherichia與Shigella在利用葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，前者具有甲酸氫解酶，可在產(chǎn)酸的同時(shí)產(chǎn)氣，后者則因無(wú)此酶，不具有產(chǎn)氣的能力。甲基紅試驗(yàn)：大腸桿菌與產(chǎn)氣氣桿菌在利用葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，前者可產(chǎn)生大量的混合酸，后者則產(chǎn)生大量的中性化合物丁二醇，因此在發(fā)酵液中加入甲基紅試劑時(shí)，前者呈紅色，后者呈黃色。,大腸桿菌：產(chǎn)酸較多，使pH4.5產(chǎn)氣桿菌：pH4.5,IMViC試驗(yàn)：,=吲哚（I）、甲基紅（M）、V.P.試驗(yàn)（Vi）檸檬酸鹽利用（C）共四項(xiàng)試驗(yàn)。用以將大腸桿菌與其形狀十分相近的腸桿菌屬的細(xì)菌鑒別開(kāi)來(lái)。,b丁二醇發(fā)酵（2，3-丁二醇發(fā)酵）腸桿菌、沙雷氏菌、歐文氏菌等,丙酮酸,乙酰乳酸,3-羥基丁酮,乙二酰,紅色物質(zhì),（乙酰乳酸脫氫酶）,（OH-、O2）,中性,丁二醇,精氨酸胍基,其中兩個(gè)重要的鑒定反應(yīng)：1、VP實(shí)驗(yàn)2、甲基紅（M.R）反應(yīng)產(chǎn)氣腸桿菌：V.P.試驗(yàn)（+），甲基紅（-）E.coli：V.P.試驗(yàn)（-），甲基紅（+）,V.P.試驗(yàn)的原理：,4）丙酮-丁醇發(fā)酵嚴(yán)格厭氧菌進(jìn)行的唯一能大規(guī)模生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)品。（丙酮、丁醇、乙醇混合物，其比例3：6：1）丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutyricum),2丙酮酸,2乙酰-CoA,乙酰-乙酰CoA,丙酮+CO2,（CoA轉(zhuǎn)移酶）,丁醇,縮合,5）氨基酸的發(fā)酵產(chǎn)能（stickland反應(yīng)）發(fā)酵菌體：生孢梭菌、肉毒梭菌、斯氏梭菌、雙酶梭菌等。特點(diǎn)：氨基酸的氧化與另一些氨基酸還原相偶聯(lián)；產(chǎn)能效率低（1ATP）氫供體（氧化）氨基酸：Ala、Leu、Ile、Val、His、Ser、Phe、Tyr、Try等。氫受體（還原）氨基酸：Gly、Pro、Arg、Met、Leo、羥脯氨酸等。,氧化丙氨酸,丙酮酸,-NH3,乙酰-CoA,乙酸+ATP,甘氨酸,-NH3,還原,檸檬酸發(fā)酵,一、菌種：能產(chǎn)生檸檬酸的菌種很多，但以霉菌為主，其中又以黑曲霉產(chǎn)生檸檬酸的能力較強(qiáng)，并能利用多種碳源，故常是生產(chǎn)上使用的菌種。二、發(fā)酵機(jī)理：細(xì)胞內(nèi)有三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)；檸檬酸合成酶活力較高，而烏頭酸酶或異檸檬酸脫氫酶可被某些因素，如金屬離子的缺乏，受到抑制，這有利于檸檬酸的積累。三、工藝流程：發(fā)酵液的pH值對(duì)檸檬酸生成影響很大；pH23時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物主要是檸檬酸；pH值中性或堿性時(shí)，會(huì)產(chǎn)生較多草酸和葡萄糖酸；可往培養(yǎng)基中加入亞鐵氰化鉀或采取育種手段改造菌種，使烏頭酸酶或異檸檬酸脫氫酶缺失或盡量降低活性，以阻礙TCA循環(huán)的正常進(jìn)行，從而增加檸檬酸的積累。,谷氨酸發(fā)酵,一、谷氨酸發(fā)酵菌種：Corynebacteriumpekinense北京棒狀桿菌Corynebacteriumglutamicum谷氨酸棒狀桿菌Brevibacteriumflavum黃色短桿菌二、發(fā)酵機(jī)理：谷氨酸以-酮戊二酸為碳架；當(dāng)以糖質(zhì)為發(fā)酵原料時(shí)，合成途徑包括EMP,HMP,TCA循環(huán),乙醛酸循環(huán)等；谷氨酸產(chǎn)生菌的-酮戊二酸氧化酶活力很弱或缺少，而谷氨酸脫氫酶的活力要很高；生物素是谷氨酸產(chǎn)生菌必需的一種維生素，在谷氨酸生物合成中起著重要作用，缺乏或量太高都會(huì)使谷氨酸合成受阻。生物素通過(guò)影響細(xì)胞膜的通透性而影響谷氨酸發(fā)酵。,一、谷氨酸發(fā)酵的菌種擴(kuò)大培養(yǎng)斜面菌種一級(jí)種子培養(yǎng)二級(jí)種子培養(yǎng)發(fā)酵罐1，斜面菌種的培養(yǎng)菌種的斜面培養(yǎng)必須有利于菌種生長(zhǎng)而不產(chǎn)酸，并要求斜面菌種絕對(duì)純，不得混有任何雜菌和噬菌體，培養(yǎng)條件應(yīng)有利于菌種繁殖，培養(yǎng)基以多含有機(jī)氮而不含或少含糖為原則。(1)斜面培養(yǎng)基組成葡萄糖0.1%，蛋白胨1.0%，牛肉膏1.0%，氯化鈉0.5%，瓊脂2.02.5%，pH7.07.2（傳代和保藏斜面不加葡萄糖）。(2)培養(yǎng)條件3334，培養(yǎng)1824h。,2，一級(jí)種子培養(yǎng)一級(jí)種子培養(yǎng)的目的在于大量繁殖活力強(qiáng)的菌體，培養(yǎng)基組成應(yīng)以少含糖分，多含有機(jī)氮為主，培養(yǎng)條件從有利于長(zhǎng)菌考慮。(1)培養(yǎng)基組成葡萄糖2.5%，尿素0.5%，硫酸鎂0.04%，磷酸氫二鉀0.1%，玉米漿2.53.5%(按質(zhì)增減)，硫酸亞鐵、硫酸錳各2ppm，pH7.0。(2)培養(yǎng)條件用1000mL三角瓶裝入培養(yǎng)基200mI，滅菌后置于沖程7.6cm、頻率96次/min的往復(fù)式搖床上振蕩培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度3334。,(3)一級(jí)種子質(zhì)量要求種齡：12h，pH值：6.40.1光密度：凈增OD值0.5以上殘?zhí)牵?.5以下無(wú)菌檢查：(-)噬菌體檢查：(-)鏡檢：菌體生長(zhǎng)均勻、粗壯，排列整齊革蘭氏陽(yáng)性反應(yīng)。,3，二級(jí)種子培養(yǎng)為了獲得發(fā)酵所需要的足夠數(shù)量的菌體，在一級(jí)種子培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進(jìn)而擴(kuò)大到種子罐的二級(jí)種子培養(yǎng)。種子罐容積大小取決于發(fā)酵罐大小和種量比例。(1)培養(yǎng)基組成,(2)培養(yǎng)條件接種量：0.81.0培養(yǎng)溫度：3234培養(yǎng)時(shí)間：78h通風(fēng)量：50L種子罐1:0.5攪拌轉(zhuǎn)速340rmin；250L種子罐1:0.3攪拌轉(zhuǎn)速300rmin500L種子罐1:0.25攪拌轉(zhuǎn)速230rmin,(3)二級(jí)種子的質(zhì)量要求種齡：78hpH：7.2左右OD值凈增0.5左右無(wú)菌檢查(-)噬菌體檢查(-),四、呼吸（respiration）從葡萄糖或其他有機(jī)物質(zhì)脫下的電子或氫經(jīng)過(guò)系列載體最終傳遞給外源O2或其他氧化型化合物并產(chǎn)生較多ATP的生物氧化過(guò)程。有氧呼吸（aerobicrespiration）無(wú)氧呼吸（anaerobicrespiration）1有氧呼吸原核微生物：細(xì)胞膜上真核微生物：線(xiàn)粒體內(nèi)膜上2個(gè)產(chǎn)能的環(huán)節(jié)：Kreb循環(huán)、電子傳遞。,TCA循環(huán)的生理意義：（1）為細(xì)胞提供能量。（2）三羧酸循環(huán)是微生物細(xì)胞內(nèi)各種能源物質(zhì)徹底氧化的共同代謝途徑。（3)三羧酸循環(huán)是物質(zhì)轉(zhuǎn)化的樞紐。,（1）TCA循環(huán)、檸檬酸循環(huán)或Krebs循環(huán),TCA的補(bǔ)充途徑I乙醛酸循環(huán)（TCA循環(huán)支路）,（異檸檬酸裂合酶）,（乙酰-CoA合成酶）,（蘋(píng)果酸合成酶）,乙酰-CoA,異檸檬酸,琥珀酸+乙醛酸,乙酸,蘋(píng)果酸,Ii丙酮酸、PEP等化合物固定CO2的方法Iii厭氧、兼性厭氧微生物獲得TCA中間產(chǎn)物方式,（2）電子傳遞鏈1）電子傳遞鏈載體:NADH脫氫酶黃素蛋白輔酶Q（CoQ）鐵-硫蛋白及細(xì)胞色素類(lèi)蛋白在線(xiàn)粒體內(nèi)膜中以4個(gè)載體復(fù)合物的形式從低氧化還原勢(shì)的化合物到高氧化還原勢(shì)的分子氧或其他無(wú)機(jī)、有機(jī)氧化物逐級(jí)排列。,2）原核微生物電子傳遞鏈特點(diǎn)：最終電子受體多樣：O2、NO3-、NO2-、NO-、SO42-、S2-、CO32-等；電子供體：H2、S、Fe2+、NH4+、NO2-、G、其他有機(jī)質(zhì)等；含各種類(lèi)型細(xì)胞色素：a、a1、a2、a4、b、b1、c、c1、c4、c5、d、o等；末端氧化酶：cyta1、a2、a3、d、o，H2O2酶、過(guò)氧化物酶；呼吸鏈組分多變存在分支呼吸鏈：細(xì)菌的電子傳遞鏈更短并PO比更低，在電子傳遞鏈的幾個(gè)位置進(jìn)入鏈和通過(guò)幾個(gè)位置的末端氧化酶而離開(kāi)鏈。E.coli（缺氧）CoQcyt.b556cyt.ocyt.b558cyt.d（抗氰化物）細(xì)胞色素0分支對(duì)氧親和性低，是一種質(zhì)子泵，在氧供應(yīng)充足的條件下工作；細(xì)胞色素d分支對(duì)氧有很高的親和性，因此在氧供應(yīng)不足的情況下起作用。電子傳遞多樣：CoQcyt.也可不經(jīng)過(guò)此途徑。,3）氧化磷酸化產(chǎn)能機(jī)制化學(xué)偶聯(lián)假說(shuō)、構(gòu)象偶聯(lián)假說(shuō)、化學(xué)滲透假說(shuō)化學(xué)滲透學(xué)說(shuō)-英國(guó)生物化學(xué)家PeterMitchell于1961年提出的。該假說(shuō)認(rèn)為電子傳遞鏈的組成導(dǎo)致質(zhì)子從線(xiàn)粒體的基質(zhì)向外移動(dòng)，電子向內(nèi)傳遞。質(zhì)子傳遞可能是由于載體環(huán)或特定的質(zhì)子泵的作用，驅(qū)動(dòng)泵的能量來(lái)自電子傳遞。來(lái)自被氧化底物上的一對(duì)電子沿傳遞鏈轉(zhuǎn)移時(shí)所產(chǎn)生的跨膜的電化學(xué)梯度（即質(zhì)子動(dòng)勢(shì)Protonmotiveforce,PMF)是ATP合成的原動(dòng)力。當(dāng)質(zhì)子動(dòng)勢(shì)驅(qū)動(dòng)被轉(zhuǎn)移至膜間空鍵的質(zhì)子返回線(xiàn)粒體基質(zhì)中時(shí)，所釋放的能量推動(dòng)ADP磷酸化生成ATP。質(zhì)子推動(dòng)力（p）取決于跨膜的質(zhì)子濃度（pH）和內(nèi)膜兩側(cè)的電位差（）。,特點(diǎn)：a常規(guī)途徑脫下的氫，經(jīng)部分呼吸鏈傳遞；b氫受體：氧化態(tài)無(wú)機(jī)物（個(gè)別：延胡索酸）c產(chǎn)能效率低。硝酸鹽呼吸（反硝化作用）即硝酸鹽還原作用特點(diǎn)：a有其完整的呼吸系統(tǒng)；b只有在無(wú)氧條件下，才能誘導(dǎo)出反硝化作用所需的硝酸鹽還原酶A、亞硝酸還原酶等c兼性厭氧細(xì)菌：銅綠假單胞、地衣芽孢桿菌等。,2無(wú)氧呼吸（厭氧呼吸）,硝酸鹽作用,同化性硝酸鹽作用：NO3-NH3-NR-NH2異化性硝酸鹽作用：無(wú)氧條件下，利用NO3-為最終氫受體NO3-NO2NON2ON2反硝化意義：1）使土壤中的氮（硝酸鹽NO3-）還原成氮?dú)舛В档屯寥赖姆柿Γ?）反硝化作用在氮素循環(huán)中起重要作用。,亞硝酸還原酶,氧化氮還原酶,氧化亞氮還原酶,硝酸鹽還原酶,硫酸鹽呼吸（硫酸鹽還原）厭氧時(shí)，SO42-、SO32-、S2O32-等為末端電子受體的呼吸過(guò)程。特點(diǎn)：a、嚴(yán)格厭氧；b、大多為古細(xì)菌c、極大多專(zhuān)性化能異氧型，少數(shù)混合型；d、最終產(chǎn)物為H2S；SO42-SO32-SO2SH2Se、利用有機(jī)質(zhì)（有機(jī)酸、脂肪酸、醇類(lèi)）作為氫供體或電子供體；f、環(huán)境：富含SO42-的厭氧環(huán)境（土壤、海水、污水等）,硫呼吸（硫還原）,以元素S作為唯一的末端電子受體。電子供體：乙酸、小肽、葡萄糖等碳酸鹽呼吸（碳酸鹽還原）以CO2、HCO3-為末端電子受體產(chǎn)甲烷菌利用H2作電子供體（能源）、CO2為受體，產(chǎn)物CH4；產(chǎn)乙酸細(xì)菌H2/CO2進(jìn)行無(wú)氧呼吸，產(chǎn)物為乙酸。,其他類(lèi)型無(wú)氧呼吸以Fe3+、Mn2+許多有機(jī)氧化物等作為末端電子受體的無(wú)氧呼吸。延胡索酸琥珀酸+1ATP。被砷、硒化合物污染的土壤中，厭氧條件下生長(zhǎng)一些還原硫細(xì)菌。,利用Desulfotomaculumauripigmentum還原AsO43-生產(chǎn)三硫化二砷（雌黃）作用：生物礦化和微生物清污,第二節(jié)微生物特有的合成代謝途徑一、細(xì)菌的光合作用真核生物：藻類(lèi)及其他綠色植物產(chǎn)氧原核生物：藍(lán)細(xì)菌光能營(yíng)養(yǎng)型生物不產(chǎn)氧（僅原核生物有）：光合細(xì)菌1、光合細(xì)菌類(lèi)群1）產(chǎn)氧光合細(xì)菌好氧菌各種綠色植物、藻類(lèi)藍(lán)細(xì)菌：專(zhuān)性光能自養(yǎng)。(H2S環(huán)境中，只利用光合系統(tǒng)I進(jìn)行不產(chǎn)氧作用)。,2）不產(chǎn)氧光合細(xì)菌a、紫色細(xì)菌只含菌綠素a或b。紫硫細(xì)菌（著色菌科）（舊稱(chēng)紅硫菌科）含紫色類(lèi)胡蘿卜素，菌體較大。S沉積胞內(nèi)。氫供體：H2S、H2或有機(jī)物。H2SSSO42-；少數(shù)暗環(huán)境以S2O32-作為電子供體。,氧化鐵紫硫細(xì)菌（Chromatium屬）利用FeS,或Fe2+氧化產(chǎn)生Fe(OH)3沉淀,紫色非硫細(xì)菌（紅螺菌科）：舊認(rèn)為不能利用硫化物作為電子供體；現(xiàn)知大多數(shù)亦能利用硫化物，但濃度不能高。b、綠色細(xì)菌（綠硫細(xì)菌）含較多的菌綠素c、d或e，少量a。電子供體：硫化物或元素硫，S沉積胞外（類(lèi)似紫色非硫細(xì)菌）；暗環(huán)境中不進(jìn)行呼吸代謝，還可同化乙酸、丙酸、乳酸等簡(jiǎn)單有機(jī)物。,2、細(xì)菌光合色素1）葉綠素（chlorophyll）：680、440nm2）菌綠素a、b、c、d、e、g。a：與葉綠素a基本相似；850nm處。b：最大吸收波長(zhǎng)8401030。3）輔助色素：提高光利用率類(lèi)胡蘿卜素：藻膽素：藍(lán)細(xì)菌獨(dú)有藻紅素（550nm）、藻藍(lán)素（620640nm）藻膽蛋白：與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的藻膽素。,3、細(xì)菌光合作用1）循環(huán)光合磷酸化細(xì)菌葉綠素將捕獲的光能傳輸給其反應(yīng)中心葉綠素P870，P870吸收光能并被激發(fā)，使它的還原電勢(shì)變得很負(fù)，被逐出的電子經(jīng)過(guò)由脫鎂菌綠素(bacteriopheophytin，Bph)、CoQ、細(xì)胞色素b和c組成的電子傳遞鏈傳遞返回到細(xì)菌葉綠素P870，同時(shí)造成了質(zhì)子的跨膜移動(dòng)，提供能量用于合成ATP。特點(diǎn)：a、光驅(qū)使下，電子自菌綠素上逐出后，經(jīng)過(guò)類(lèi)似呼吸鏈的循環(huán)，又回到菌綠素；b、產(chǎn)ATP和還原力H分別進(jìn)行，還原力來(lái)自H2S等無(wú)機(jī)物；c、不產(chǎn)氧（O2）。,光驅(qū)使下，電子自菌綠素上逐出后，經(jīng)過(guò)類(lèi)似呼吸鏈的循環(huán)，又回到菌綠素產(chǎn)ATP和還原力分別進(jìn)行.,紫色細(xì)菌循環(huán)光合磷酸化過(guò)程,外源電子供體H2S等無(wú)機(jī)物氧化放出電子，最終傳至失電子的光合色素時(shí)與ADP磷酸化偶聯(lián)產(chǎn)生ATP。特點(diǎn)：只有一個(gè)光合系統(tǒng)，光合作用釋放的電子僅用于NAD+還原NADH，但電子傳遞不形成環(huán)式回路。,綠硫細(xì)菌和綠色細(xì)菌,2）非循環(huán)光合磷酸化特點(diǎn)：a、電子傳遞非循環(huán)式；b、在有氧的條件下進(jìn)行；c、存在兩個(gè)光合系統(tǒng)d、ATP、還原力、O2同時(shí)產(chǎn)生當(dāng)光反應(yīng)中心I的葉綠素P700吸收光量子能量后釋放的電子，經(jīng)過(guò)黃素蛋白和鐵氧還蛋白(Fd)傳遞給NAD+（NADP）生成NADH（NADPH）+H(還原力)，而不是返回氧化型P700。光合系統(tǒng)II將電子提供給氧化型P700，并產(chǎn)生ATP。光合系統(tǒng)II天線(xiàn)色素吸收光能并激發(fā)P680放出電子，然后還原脫鎂葉綠素a(脫鎂葉綠素a是2個(gè)氫原子取代中心鎂原子的葉綠素a)，經(jīng)過(guò)由質(zhì)體醌(plastoquinone，PQ)、Cyt.b、Cyt.f和質(zhì)體藍(lán)素(plastocyanin，PC)組成的電子傳遞鏈到氧化型P700（不返回氧化型P680），而氧化型P680從水氧化成02過(guò)程中得到電子。在光系統(tǒng)中，電子由PQ經(jīng)Cyt.b傳遞給Cyt.f時(shí)與ADP磷酸化偶聯(lián)產(chǎn)生ATP。,藍(lán)細(xì)菌等的產(chǎn)氧光合作用非循環(huán)光合磷酸化過(guò)程,3）依靠菌視紫紅質(zhì)的光合作用無(wú)葉綠素或菌綠素參與的獨(dú)特的光合作用，是迄今為止最簡(jiǎn)單的光合磷酸化反應(yīng)。極端嗜鹽古細(xì)菌菌視紫紅質(zhì)：以“視黃醛”（紫色）為輔基。與葉綠素相似，具質(zhì)子泵作用。與膜脂共同構(gòu)成紫膜；埋于紅色細(xì)胞膜（類(lèi)胡蘿卜素）內(nèi)。,ATP合成機(jī)理：視黃醛吸收光，構(gòu)型改變，質(zhì)子泵到膜外，膜內(nèi)外形成質(zhì)子梯度差和電位梯度差，是ATP合成的原動(dòng)力，驅(qū)動(dòng)ATP酶合成ATP。,二、細(xì)菌化能自養(yǎng)作用化能無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌：通常是化能自養(yǎng)型細(xì)菌，一般是好氧菌。產(chǎn)能的途徑主要是借助于無(wú)機(jī)電子供體(能源物質(zhì))的氧化，從無(wú)機(jī)物脫下-的氫(電子)直接進(jìn)入呼吸鏈通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生ATP。最普通的電子供體是氫、還原型氮化合物、還原型硫化合物和亞鐵離子(Fe2)。利用卡爾文循環(huán)固定C02作為它們的碳源。最重要反應(yīng)：CO2還原成CH20水平的簡(jiǎn)單有機(jī)物，進(jìn)一步合成復(fù)雜細(xì)胞成分大量耗能、耗還原力的過(guò)程。,化能自養(yǎng)細(xì)菌的能量代謝特點(diǎn)：無(wú)機(jī)底物脫下的氫（電子）從相應(yīng)位置直接進(jìn)入呼吸鏈氧化磷酸化產(chǎn)能。電子可從多處進(jìn)入呼吸鏈，所以呼吸鏈有多種多樣。產(chǎn)能效率，即氧化磷酸化效率(P0值)通常要比化能異養(yǎng)細(xì)菌的低。生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)細(xì)胞率低。有以下特點(diǎn)：無(wú)機(jī)底物上脫下的氫(電子)直接進(jìn)入呼吸鏈。,1硝化細(xì)菌能氧化氮的化能無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌桿狀、橢圓形、球形、螺旋形或裂片狀，且它們可能有極生或周生鞭毛。好氧、沒(méi)有芽孢的革蘭氏陰性有機(jī)體，在細(xì)胞質(zhì)中有非常發(fā)達(dá)的內(nèi)膜復(fù)合體。將氨氧化成硝酸鹽的過(guò)程稱(chēng)為硝化作用。,a、亞硝化細(xì)菌NH3+O2+2H+NH2OH+H2O,根據(jù)它們氧化無(wú)機(jī)化合物的不同,也稱(chēng)氨氧化細(xì)菌(產(chǎn)生1分子ATP),2氫細(xì)菌（氧化氫細(xì)菌）能利用氫作為能源的細(xì)菌組成的生理類(lèi)群稱(chēng)氫細(xì)菌或氫氧化細(xì)菌(hydrogenoxidizingbacteria)。兼性化能自養(yǎng)菌主要有假單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、副球菌屬、芽孢桿菌屬、黃桿菌屬(Flavobacterium)、水螺菌屬(Aquaspirillum)、分支桿菌屬(Mycobacterium)和諾卡氏菌屬(Nocardia)等。產(chǎn)能：2H2+O22H2O合成代謝反應(yīng)：2H2+CO2CH2O+H2O。,氫細(xì)菌的自氧作用第一步：產(chǎn)能反應(yīng)，氧化4分子H。產(chǎn)生1分子ATP；第二步：合成代謝反應(yīng)，用所產(chǎn)生的ATP還原C02構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)CH2O和生長(zhǎng)。,在Ralstoniaeutropha中存在兩種氫酶，一種膜結(jié)合氫酶涉及質(zhì)子動(dòng)勢(shì)而細(xì)胞質(zhì)中的氫酶為Calvincycle提供還原力NADH。,3硫細(xì)菌（硫氧化細(xì)菌）,利用H2S、S02、S2O32-等無(wú)機(jī)硫化物進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng),主要指化能自氧型硫細(xì)菌大多數(shù)硫桿菌，脫下的H+（e-）經(jīng)cyt.c部位進(jìn)入呼吸鏈；而脫氮硫桿菌從FP或cyt.b水平進(jìn)入。嗜酸型硫細(xì)菌能氧化元素硫和還原性硫化物外，還能將亞鐵離子(Fe2)氧化成鐵離子(Fe3)。,產(chǎn)能途徑第一階段，H2S、S0和S2O32等硫化物被氧化為SO32第二階段，形成的SO32進(jìn)一步氧化為SO42和產(chǎn)能。1、由細(xì)胞色素亞硫酸氧化酶將SO32直接氧化成為SO42，并通過(guò)電子傳遞磷酸化產(chǎn)能，普遍存在于硫桿菌中。2、磷酸腺苷硫酸(adenosinephosphosulfate，APS)途徑。在這條途徑中，亞硫酸與腺苷單磷酸反應(yīng)放出2個(gè)電子生成一種高能分子APS，放出的電子經(jīng)細(xì)胞電子傳遞鏈的氧化磷酸化產(chǎn)生ATP。由腺苷酸激酶的催化，每氧化1分子SO32產(chǎn)生15分子ATP。,4鐵細(xì)菌和細(xì)菌瀝濾(1)鐵細(xì)菌（多數(shù)為化能自養(yǎng)，少數(shù)兼性厭氧，產(chǎn)能低。）定義：能氧化Fe2成為Fe3并產(chǎn)能的細(xì)菌被稱(chēng)為鐵細(xì)菌(ironbacteria)或鐵氧化細(xì)菌(ironoxidizingbacteria)。包括亞鐵桿菌屬(Ferrobacillus)、嘉利翁氏菌屬(Gallionella)、纖發(fā)菌屬(Leptothrix)、泉發(fā)菌屬(Crenothrix)和球衣菌屬(Sphaerotilus)的成員。有些氧化亞鐵硫桿菌(Thiobacillusfrrooxidans)和硫化葉菌的一些成員，除了能氧化元素硫和還原性硫化物外，還能將亞鐵離子(Fe2)氧化成鐵離子(Fe3)，所以它們既是硫細(xì)菌，也是鐵細(xì)菌。大多數(shù)鐵細(xì)菌為專(zhuān)性化能自養(yǎng)，但也有兼性化能自養(yǎng)的。大多數(shù)鐵細(xì)菌還是嗜酸性的。鐵細(xì)菌的細(xì)胞產(chǎn)率也相當(dāng)?shù)?鐵氧化細(xì)菌呼吸鏈的氧化磷酸化的產(chǎn)能途徑,(2)細(xì)菌瀝濾利用嗜酸性氧化鐵和硫細(xì)菌氧化礦物中硫和硫化物的能力，讓其不斷制造和再生酸性浸礦劑，將硫化礦中重金屬轉(zhuǎn)化成水溶性重金屬硫酸鹽而從低品位礦中浸出的過(guò)程。又稱(chēng)細(xì)菌浸出或細(xì)菌冶金。原理：a、浸礦劑的生成2S+3O2+2H2O2H2SO44FeSO4+2H2SO4+O22Fe2（SO4）3+2H2Ob、低品位銅礦中銅以CuSO4形式浸出CuS+2Fe2（SO4）3+2H2O+O2CuSO4+4FeSO4+2H2SO4c、鐵屑置換CuSO4中的銅CuSO4+FeFeSO4+Cu適于次生硫化礦和氧化礦的浸出，浸出率達(dá)70%80%。,1、固氮微生物的種類(lèi)一些特殊類(lèi)群的原核生物能夠?qū)⒎肿討B(tài)氮還原為氨，然后再由氨轉(zhuǎn)化為各種細(xì)胞物質(zhì)。微生物利用其固氮酶系催化大氣中的分子氮還原成氨的過(guò)程稱(chēng)為固氮作用。自生固氮菌：獨(dú)立固氮（氧化亞鐵硫桿菌等）共生固氮菌：與它種生物共生才能固氮形成根瘤及其他形式聯(lián)合固氮菌：必須生活在植物根際、葉面或動(dòng)物腸道等處才能固氮的微生物。根際芽孢桿菌屬；葉面固氮菌屬。,三、固氮作用,2、固氮機(jī)制,1）固氮反應(yīng)的條件aATP的供應(yīng)：1molN21015ATPb還原力H及其載體氫供體：H2、丙酮酸、甲酸、異檸檬酸等。電子載體：鐵氧還蛋白（Fd）或黃素氧還蛋白（Fld）。c固氮酶組分I：真正“固氮酶”，又稱(chēng)鉬鐵蛋白（MF）、鉬鐵氧還蛋白（MoFd）,組分II：,固氮酶還原酶，不含鉬，又稱(chēng)鐵蛋白、固氮鐵氧還蛋白（AzoFd）特性：對(duì)氧極為敏感；需有Mg2+的存在；專(zhuān)一性：除N2外，可還原其他一些化合物C2H2C2H4；2H+H2；N2ON2；HCNCH4+NH3（乙炔反應(yīng)：可用來(lái)測(cè)知酶活）d還原低物N2：NH3存在時(shí)會(huì)抑制固氮作用。,N2+2e+6H+（1824）ATP2NH3+H2+（1824）ADP+1824Pia、固氮酶的形成e組分II組分II（e）MgATP組分I+N2IN2b、固氮階段N2*2NH3+H2即75%還原力用來(lái)還原N2，25%的還原力以H2形式浪費(fèi),2）固氮生化過(guò)程,Fd，F(xiàn)ld,+,固氮酶（1：1復(fù)合物）,固氮生化途徑,3、好氧性固氮菌的防氧機(jī)制,固N(yùn)酶遇氧不可逆失活（組分I，半衰期10；組分II，45”喪失一半活性）（1）自身固N(yùn)菌a呼吸保護(hù)固N(yùn)菌科的固N(yùn)菌以極強(qiáng)的呼吸作用消耗掉環(huán)境中的氧。b構(gòu)象保護(hù)高氧分壓環(huán)境，固氮酶能形成一無(wú)固N(yùn)活性但能防止氧損傷的特殊構(gòu)象。構(gòu)象保護(hù)的蛋白質(zhì)Fe-s蛋白II氧壓增高，固氮酶與Fes蛋白II結(jié)合，構(gòu)象變化，喪失固N(yùn)能力；氧濃度降低，蛋白自酶上解離,(2)藍(lán)細(xì)菌保護(hù)固N(yùn)酶機(jī)制a分化出特殊的還原性異形胞（適宜固氮作用的細(xì)胞）I、厚壁，物理屏障；II、缺乏氧光合系統(tǒng)II，脫氧酶、氫酶活性高；III、SOD活性很高；IV、呼吸強(qiáng)度高b非異形胞藍(lán)細(xì)菌固N(yùn)酶的保護(hù)缺乏獨(dú)特的防止氧對(duì)固N(yùn)酶的損傷機(jī)制。I、固N(yùn)、光合作用在時(shí)間上分隔開(kāi)織線(xiàn)藍(lán)菌屬（黑暗：固N(yùn)；光照：光合作用）II、形成束狀群體（束毛藍(lán)菌屬），利于固N(yùn)酶在微氧環(huán)境下固N(yùn)III、提高胞內(nèi)過(guò)氧化酶、SOD的活力，解除氧毒（粘球藍(lán)菌屬）,I、豆科植物的共生菌以類(lèi)菌體形式存在于根瘤中類(lèi)菌體周膜：豆血紅蛋白，可與氧可逆結(jié)合（高時(shí)結(jié)合，低時(shí)釋放）豆血紅蛋白：蛋白部分由植物基因編碼；血紅素有根瘤菌基因編碼。II、非豆科植物共生菌含植物血紅蛋白（功能相似豆血紅蛋白）Frankin放線(xiàn)菌：營(yíng)養(yǎng)菌絲末端膨大的泡囊類(lèi)似異形胞。,c根瘤菌保護(hù)固N(yùn)酶機(jī)制,四、肽聚糖的合成,1在細(xì)胞質(zhì)中的合成UDP-胞壁酸5肽aGG-UDP，M-UDPG6-P-果糖6-P-葡糖胺N-乙酸葡糖胺-1-磷酸N-乙酰葡糖胺-UDPN-乙酰胞壁酸-UDPbM合成“Park”核苷酸（UDP-M-5肽）UDP作為糖載體D-Val-D-Val為環(huán)絲氨酸（惡唑霉素）阻斷；,N-乙酰胞壁酸合成“Park”核苷酸,親水性化合物,肽聚糖單體亞單位的合成載體：細(xì)菌萜醇（類(lèi)脂載體）C55類(lèi)異戊二烯醇（含11個(gè)異戊二烯單位）穿膜的同時(shí)與G結(jié)合，接上肽橋，此外，類(lèi)脂載體還參與胞外多糖、脂多糖的合成（磷壁酸、纖維素、幾丁質(zhì)、甘露聚糖等）萬(wàn)古霉素，桿菌肽所抑制這些反應(yīng),2細(xì)胞膜中的合成,“Park”核苷酸合成肽聚糖單體,細(xì)胞膜上,細(xì)胞質(zhì),雙糖肽位于細(xì)胞膜外細(xì)胞壁生長(zhǎng)點(diǎn)處,3膜外的合成,a、多糖鏈的伸長(zhǎng)（橫向連接）：肽糖單體+引物（68肽糖單位）多糖鏈橫向延伸1雙糖單位。b、相鄰多糖鏈相聯(lián)（縱向連接）：2D-ValM-4肽+D-Val甲肽尾五甘氨酸肽的游離NH與乙肽尾D-Val（第4個(gè)氨基酸）游離COOH轉(zhuǎn)肽作用：青霉素所抑制。青霉素為D-Val-D-Val結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)肽酶,轉(zhuǎn)糖基（形成-1，4糖苷鍵）,轉(zhuǎn)糖基作用和轉(zhuǎn)肽作用,第三節(jié)微生物次級(jí)代謝與次級(jí)代謝產(chǎn)物一、次級(jí)代謝與次級(jí)代謝產(chǎn)物一般將微生物通過(guò)代謝活動(dòng)所產(chǎn)生的自身繁殖所必需的物質(zhì)和能量的過(guò)程，稱(chēng)為初級(jí)代謝,該過(guò)程所產(chǎn)生的產(chǎn)物即為初級(jí)代謝產(chǎn)物，如氨基酸、核苷類(lèi)，以及酶或輔酶等。次級(jí)代謝是指微生物在一定的生長(zhǎng)時(shí)期，以初級(jí)代謝產(chǎn)物為前體，合成一些對(duì)于該微生物沒(méi)有明顯的生理功能且非其生長(zhǎng)和繁殖所必需的物質(zhì)的過(guò)程。這一過(guò)程的產(chǎn)物，即為次級(jí)代謝產(chǎn)物，如抗生素、激素、生物堿、毒素及維生素等。,次級(jí)代謝與初級(jí)代謝關(guān)系密切，初級(jí)代謝的關(guān)鍵性中間產(chǎn)物往往是次級(jí)代謝的前體，比如糖降解過(guò)程中的乙酰-CoA是合成四環(huán)素、紅霉素的前體；一般菌體的次級(jí)代謝在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期或穩(wěn)定期間進(jìn)行，受環(huán)境條件的影響；次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，因菌株不同而異，但與分類(lèi)地位無(wú)關(guān)；與次級(jí)代謝的關(guān)系密切的質(zhì)粒則控制著多種抗生素的合成。次級(jí)代謝產(chǎn)物在微生物生命活動(dòng)過(guò)程中的產(chǎn)生極其微量，對(duì)微生物本身的生命活動(dòng)沒(méi)有明顯作用，當(dāng)次級(jí)代謝途徑被阻斷時(shí)，菌體生長(zhǎng)繁殖仍不會(huì)受到影響，因此，它們沒(méi)有一般性的生理功能，也不是生物體生長(zhǎng)繁殖的必需物質(zhì)，但對(duì)其它生物體往往具有不同的生理活性作用，因此，人們利用這些具有各種生理活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)具有應(yīng)用價(jià)值的藥物。,二、次級(jí)代謝的調(diào)節(jié)1初級(jí)代謝對(duì)次級(jí)代謝的調(diào)節(jié)次級(jí)代謝與初級(jí)代謝類(lèi)似，它在調(diào)節(jié)過(guò)程中也有酶活性的激活和抑制及酶合成的誘導(dǎo)和阻遏。2含氮化合物對(duì)次級(jí)代謝的調(diào)節(jié)作用菌體內(nèi)的谷氨酰胺合成酶(GS)的水平與抗生素的產(chǎn)量間呈正相關(guān)性，丙氨酸脫氫酶(ADH)水平與利福霉素SV合成則呈負(fù)的相關(guān)性，而ADH和GS同化氨途徑受培養(yǎng)基中氨濃度的調(diào)節(jié)，因此，氨濃度的調(diào)節(jié)影響抗生素的產(chǎn)量。3誘導(dǎo)作用及產(chǎn)物的反饋抑制,一、微生物代謝產(chǎn)物的利用利用微生物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的眾多代謝產(chǎn)物生產(chǎn)各種發(fā)酵產(chǎn)品。按照積累產(chǎn)物類(lèi)型：初級(jí)代謝產(chǎn)物，如氨基酸、核苷類(lèi)，以及酶或輔酶；次級(jí)代謝產(chǎn)物，抗生素、激素、生物堿、毒素及維生素等。按照發(fā)酵類(lèi)型：自然發(fā)酵：酒精、乳酸等，代謝控制發(fā)酵：終端產(chǎn)物:賴(lài)氨酸、鳥(niǎo)苷酸、腺苷酸等；中間產(chǎn)物:檸檬酸、-酮戊二酸、琥珀酸、高絲氨酸、肌苷酸、黃苷酸等；,第四節(jié)微生物代謝與生產(chǎn)實(shí)踐,1發(fā)酵條件的控制人們通過(guò)對(duì)微生物菌種營(yíng)養(yǎng)和培養(yǎng)條件的控制生產(chǎn)所要的目的產(chǎn)品:1）培養(yǎng)條件：溫度、pH值、滲透壓的控制；2）營(yíng)養(yǎng)成分的控制：葡萄糖濃度、碳氮比、生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)離子等；3）溶解氧的控制：通氣量，攪拌等。,產(chǎn)黃青霉（Penicilliumchrysogenum）的青霉素發(fā)酵過(guò)程根據(jù)不同生理代謝過(guò)程的溫度特點(diǎn)分四段控制其培養(yǎng)溫度：3025200小時(shí)5小時(shí)40小時(shí)125小25時(shí)165小時(shí)結(jié)果：青霉素產(chǎn)量比保持在30恒溫培養(yǎng)提高了14.7。,2代謝調(diào)節(jié)的控制,（1）應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株以解除正常的反饋調(diào)節(jié)賴(lài)氨酸發(fā)酵（高絲氨酸缺陷型菌株）,在這個(gè)代謝工程的設(shè)計(jì)中，是利用阻斷分支途徑的高絲氨酸的合成，來(lái)解除(Lys+Thr)的反饋調(diào)節(jié)。即造成高絲氨酸缺陷型(Hser一)，就可解除末端產(chǎn)物對(duì)限速酶的反饋抑制。,谷氨酸棒桿菌Corynebacteriumglutamicum（高絲氨酸缺陷型菌株）：不能合成高絲氨酸脫氫酶（HSDH),就不能產(chǎn)生蘇氨酸和甲硫氨酸，從而產(chǎn)生大量的賴(lài)氨酸。,（2）選育細(xì)胞膜缺損突變株油酸缺陷型、甘油缺陷型，或生物素缺陷型,利用油酸缺陷型菌株，限量添加油酸，限制細(xì)胞膜磷脂中不飽和脂肪酸的合成而使細(xì)胞膜缺損，利于代謝產(chǎn)物滲漏而提高谷氨酸的產(chǎn)量。生物素缺陷型原理在脂肪酸生物合成途徑中，由乙酰輔酶A羧化成丙二酸單酰輔酶A的反應(yīng)是一個(gè)限速步驟，該反應(yīng)由乙酰輔酶A羧化酶系催化，包括生物素羧化酶，羧基轉(zhuǎn)移酶和生物素羧基載體蛋白CCP，并且需要生物素作輔酶。選育生物素營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，使細(xì)胞中的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的合成受阻，從而影響到磷脂的合成。在培養(yǎng)時(shí)限量添加生物素或含生物素的原料，可以控制膜的厚度來(lái)調(diào)節(jié)透性。,3微生物代謝與代謝工程,近年來(lái)，基因工程的不斷發(fā)展，也為微生物代謝在發(fā)酵生產(chǎn)的應(yīng)用提供了新的方法。人們通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)和DNA重組技術(shù),可以定向地對(duì)細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行修飾或引入新的反應(yīng)，以改進(jìn)產(chǎn)物的生成或改變細(xì)胞的代謝特性。但這些改進(jìn)都是與微生物的基因調(diào)控和代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的。利用DNA重組技術(shù)改變微生物代謝流，擴(kuò)展和構(gòu)建新的代謝途徑，或通過(guò)關(guān)聯(lián)酶將兩個(gè)代謝途徑連接形成新的代謝流的研究，取得了令人矚目的進(jìn)展。,克隆來(lái)自細(xì)菌的木糖異構(gòu)酶基因，克隆來(lái)自柄狀畢赤酵母（Pichiastipitis）的木糖還原酶和木糖醇脫氫酶基因。,引入木糖代謝途徑（戊糖代謝生產(chǎn)乙醇的代謝工程）酵母菌Saccharomyces的代謝工程,二、微生物代謝活性的利用1生物轉(zhuǎn)化生物轉(zhuǎn)化是指利用生物體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酶使底物進(jìn)行有機(jī)反應(yīng)。生物轉(zhuǎn)化一般采用微生物細(xì)胞或微生物酶作催化劑，故又稱(chēng)作微生物轉(zhuǎn)化。微生物轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要領(lǐng)