畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）題目赤芍中芍藥苷的提取工藝研究指導(dǎo)老師專業(yè)班級(jí)生物技術(shù)及應(yīng)用0701姓名學(xué)號(hào)2010年5月30日摘要本論文研究了赤芍中的芍藥苷的提取與精制工藝，通過考察芍藥苷的純度和回收率，對(duì)提取和精制芍藥苷的工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明采用70乙醇回流提取3次，再依次采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3種溶劑萃取，用硅膠柱層析進(jìn)行純化，純化操作條件為氯仿甲醇81、床層高度與直徑比為185、負(fù)載量為207MG/G硅膠。使用該工藝可從赤芍中得到純度大于970的芍藥苷產(chǎn)品，總回收率超過870。關(guān)鍵詞赤芍；芍藥苷；正丁醇；HPLC目錄引言11材料與方法111實(shí)驗(yàn)材料112實(shí)驗(yàn)試劑113實(shí)驗(yàn)儀器214試驗(yàn)方法2141分析方法21411TCL分析方法21412HPLC定量2142提取工藝流程3143提取和純化方法32結(jié)果分析421回流提取過程中的芍藥苷提取情況422萃取過程中的芍藥苷提取情況523純化過程中的芍藥苷情況5231DA201大孔吸附樹脂的純化情況5232D101大孔吸附樹脂的純化情況5233硅膠的純化情況63結(jié)論74展望7參考文獻(xiàn)8引言芍藥苷為赤芍的主要藥效成分，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、解痙、解毒、抗炎、抗過敏、血管擴(kuò)張等藥理活性，并有活血、化瘀、補(bǔ)陰等功效1,2。芍藥苷為白色粉末，MP172C，分子式C23H28O11，是一種蒎烷單萜苷3，在堿性溶液中不穩(wěn)定，產(chǎn)生一定量的苯甲酸，放置后部分變成紅棕色樹脂物質(zhì)，遇硫酸顯紫褐色，紫外燈254NM下顯暗斑。國(guó)內(nèi)外對(duì)赤芍的化學(xué)成分和藥材的溶劑提取進(jìn)行了較多的研究4。從赤芍中提取芍藥苷工藝過程的研究都是以提取少量樣品用于鑒定、分析、藥理研究為目的，因此過程較繁雜，且未對(duì)制備過程中芍藥苷的回收率進(jìn)行考察5。為了更好地利用赤芍資源，本論文通過考察芍藥苷的純度和回收率，對(duì)提取和精制芍藥苷的工藝進(jìn)行了優(yōu)化。本論文的研究結(jié)果對(duì)芍藥苷的大規(guī)模制備有一定的指導(dǎo)意義。1材料與方法11實(shí)驗(yàn)材料赤芍藥材，產(chǎn)于購(gòu)自河北安國(guó)藥材市場(chǎng)，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)陳孔榮教授鑒定符合2005版中國(guó)藥典對(duì)赤芍的要求。飲片厚度小于6MM6。參考中國(guó)藥典2005版的測(cè)定方法對(duì)藥材中芍藥苷的含量進(jìn)行了分析，結(jié)果為52（WT）。12實(shí)驗(yàn)試劑正丁醇（AR，杭州大方化學(xué)試劑廠）。芍藥苷對(duì)照品中國(guó)藥品生物制品檢定所。硅膠100200目，青島海洋化工廠分廠甲醇（色譜純，MERCK公司）石油醚、甲醇等其它有機(jī)溶劑均為分析純。D201大孔吸附樹脂13實(shí)驗(yàn)儀器AGILENT1100高效液相色譜儀（含G1354A四元梯度洗脫泵；G1322A在線脫氣裝置；G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器，UVVIS檢測(cè)器，G1316A柱溫箱），AGINLENT1100色譜工作站；DIAMONSILC18柱（25046MM，5M；DIKMA）電子分析天平（梅特勒托利多儀器上海有限公司）架盤藥物天平馬頭牌BPII型，稱量范圍05G500G，上海醫(yī)用激光儀器廠。蛇形冷凝管加熱套TC15套式恒溫器，控溫范圍50200，浙江新醫(yī)療器械廠。500ML圓底燒瓶；50ML容量瓶；1000ML的分液漏斗旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀14實(shí)驗(yàn)方法141分析方法1411TLC定性方法硅膠GF254板，以氯仿甲醇（51）為展開劑，紫外顯色（254NM），芍藥苷的比移值RF為036。1412HPLC定量色譜條件色譜柱為DIAMONSILC18柱（250MM46MM，5M，迪馬公司），流動(dòng)相為甲醇水（4060），流速10ML/MIN，柱溫30，檢測(cè)UV230NM7,8。芍藥苷的典型HPLC分析結(jié)果如圖11所示。圖11芍藥苷的典型HPLC分析結(jié)果對(duì)照品溶液的配制精確稱取94MG芍藥甙對(duì)照品，置于50ML容量瓶，用甲醇稀釋到刻度，得到0188MG/ML芍藥甙對(duì)照品溶液9,10。芍藥苷線性關(guān)系考察將配置好的芍藥苷對(duì)照品溶液依次進(jìn)樣2，4，8，12，16，20L，芍藥苷的回歸方程為Y6436813704773X，R09999，其中X為進(jìn)樣量（G），Y為峰面積（MAUS）。結(jié)果表明芍藥苷在0376376G呈良好的線形關(guān)系。142提取工藝流程采用的工藝路線如圖12所示，本工藝主要包括醇水溶液回流提取、液液分配、柱層析等工序，其中柱層析是本工藝的關(guān)鍵。圖12芍藥苷提取工藝路線143提取和純化方法赤芍飲片700G（芍藥苷含量為52）用70乙醇回流提取3次，每次的溶劑用量分別為4100ML、3500ML和3500ML，回流時(shí)間分別為20H、15H和15H。合并提取液，過濾，濾液在60以下真空濃縮至糖漿狀的浸膏，稱重后分析芍藥苷含量。赤芍飲片醇水溶液回流提取真空濃縮T60液液分配真空濃縮T60真空濃縮T50柱層析芍藥苷產(chǎn)品將浸膏采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3種溶劑依次萃取11。每次500ML。萃取后的水相用乙酸乙酯萃取2次，每次500ML。乙酸乙酯萃取后的水相用正丁醇萃取3次，每次500ML，合并3次萃取的正丁醇溶液，在60以下真空濃縮得膏狀物稱重，并分析膏狀物中的芍藥苷的含量。提取后的膏狀物分別用DA201大孔吸附樹脂、D101大孔吸附樹脂、硅膠柱層析進(jìn)行芍藥苷的純化工藝研究。對(duì)DA201大孔吸附樹脂的具體純化方法如下采用內(nèi)徑198MM的自制層析柱，床層高度39CM。正丁醇萃取所得的膏狀物配成0396G/ML的水溶液，上樣10ML，用水作洗脫劑洗脫，分瓶收集流出液，用TLC定性，合并含芍藥苷的39瓶收集部分，減壓濃縮至干得到淺黃色固體稱重，用甲醇溶解，采用HPLC定量分析芍藥苷的純度和回收率。對(duì)D101大孔吸附樹脂的具體純化方法如下柱內(nèi)徑198MM，床層高度39CM。正丁醇萃取所得的膏狀物配成0396G/ML的水溶液，上樣10ML，分瓶收集流出液，用TLC定性。分別考察20、30、95的乙醇洗脫對(duì)分離的影響，在加不同濃度的乙醇前，先用蒸餾水洗至洗脫液的芍藥苷的顯色反應(yīng)成無色。測(cè)定洗脫液中的芍藥苷的含量并合并含芍藥苷的39瓶收集部分，減壓濃縮至干得到淺黃色固體稱重，用甲醇溶解，采用HPLC定量分析芍藥苷的純度和回收率。對(duì)硅膠柱層析的具體純化方法如下采用內(nèi)徑30MM的自制層析柱，床層高度555MM（床層體積392ML）。操作過程如下硅膠用氯仿充分浸泡，脫氣后，用濕法裝柱。每克正丁醇萃取所得的膏狀物用10ML洗脫劑溶解后上柱，再用洗脫劑洗脫（氯仿甲醇混合溶液），分瓶收集流出液，用TLC定性，合并含芍藥苷的部分，減壓濃縮至干，稱量后用甲醇溶解，經(jīng)HPLC定量分析。2結(jié)果與分析21回流提取過程中的芍藥苷提取情況700G赤芍飲片提取得到的糖漿狀浸膏共2978G。經(jīng)HPLC分析，浸膏中芍藥苷的含量為119?；亓魈崛」に嚿炙庈盏幕厥章蕿?82，可見采用70乙醇回流提取3次能把赤芍中的芍藥苷基本提取完全。22萃取過程中的芍藥苷提取情況液液分配的目的是將浸膏中的部分雜質(zhì)除去，使芍藥苷得到初步純化。液液分配的關(guān)鍵在于選用合適的溶劑。采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，最后用正丁醇萃取濃縮后得膏狀物1066G。經(jīng)HPLC分析，正丁醇萃取所得膏狀物中芍藥苷的含量為316。萃取過程中芍藥苷的回收率為953。經(jīng)過液液萃取后可使芍藥苷的含量由119提高到316，且芍藥苷的損失只有47。23純化過程中的芍藥苷情況231DA201大孔吸附樹脂的純化情況DA201大孔吸附樹脂的純化結(jié)果見表21。合并含芍藥苷的39瓶收集部分，減壓濃縮至干得到淺黃色固體1929G，用甲醇溶解，經(jīng)HPLC定量分析，芍藥苷的純度為588，回收率905。由此可見，DA201大孔吸附樹脂對(duì)芍藥苷的吸附很弱，用水就可以把芍藥苷洗脫下來，故DA201大孔吸附樹脂不適宜作分離高純度芍藥苷的固定相。表21DA201用水洗脫的洗脫液體積和顏色表瓶號(hào)12345678910體積（ML）45422825353531393734芍藥苷檢測(cè)無無有有有有有有有無232D101大孔吸附樹脂的純化情況采用不同濃度的乙醇進(jìn)行洗脫，D101大孔吸附樹脂的純化結(jié)果見圖21，流動(dòng)相組成對(duì)柱層析分離過程的影響如表22所示，表中洗脫體積為芍藥苷全部洗脫出時(shí)收集到的洗脫液的體積（不包括開始用水沖洗的體積）。從表22可見，隨著乙醇濃度的增加，芍藥苷純度和洗脫體積顯著下降，回收率增加。但即使采用20乙醇洗脫，產(chǎn)品純度也只有800。D101的純化效果也不是很理想。05000100001500020000250003000035000400000200400600800洗脫體積（ML峰面積20乙醇30乙醇95乙醇圖21不同乙醇濃度的洗脫曲線表22乙醇濃度對(duì)柱層析分離過程的影響乙醇濃度203095純度800622527回收率912966991洗脫體積（ML）711374217233硅膠的純化情況從表23可見，隨著流動(dòng)相中甲醇含量的增加，產(chǎn)品純度和洗脫體積顯著下降，產(chǎn)品回收率增加。當(dāng)氯仿甲醇體積比為81時(shí)，既能保證一次性過柱產(chǎn)品純度大于970，又能達(dá)到使用較少洗脫液的目的（約為47個(gè)床層體積）。表23流動(dòng)相組成對(duì)柱層析分離過程的影響氯仿甲醇體積比101816141純度980976930917回收率923930964998洗脫體積（ML）294318531560734在流動(dòng)相氯仿甲醇體積比81下，對(duì)負(fù)載量對(duì)分離結(jié)果的影響進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表24所示。從表可見，隨著進(jìn)料量的增加，產(chǎn)品純度下降，而回收率卻顯著上升。如果要求通過一次柱層析達(dá)到970以上的產(chǎn)品，不能有很高的負(fù)載量，合適的負(fù)載量為207MG/G硅膠。回收率上升的原因可能是硅膠對(duì)芍藥苷有一定的吸附，每克硅膠的吸附量為一定值，與進(jìn)樣量關(guān)系不大引起的。表24負(fù)載量的優(yōu)化結(jié)果負(fù)載量（MG正丁醇濃縮樣品/G硅膠）103207310620純度978976959915回收率9279309459853結(jié)論本論文提出了一條從赤芍中提取芍藥苷的工藝，該工藝包括醇水溶液回流提取、液液分配、柱層析等工序。具體如下赤芍飲片700G（芍藥苷含量為52）用70乙醇回流提取3次，每次的溶劑用量分別為4100ML、3500ML和3500ML，回流時(shí)間分別為20H、15H和15H。合并提取液，過濾，濾液在60以下真空濃縮至糖漿狀的浸膏。將浸膏采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3種溶劑依次萃取。每次500ML。萃取后的水相用乙酸乙酯萃取2次，每次500ML。乙酸乙酯萃取后的水相用正丁醇萃取3次，每次500ML，合并3次萃取的正丁醇溶液，在60以下真空濃縮得膏狀物。再將膏狀物用硅膠柱層析進(jìn)行純化，純化操作條件為流動(dòng)相氯仿甲醇81、床層高度與直徑比為185、負(fù)載量為207MG/G硅膠。使用該工藝可從赤芍中得到純度大于970的芍藥苷產(chǎn)品，總回收率超過870。4展望利用二次（或多次）柱層析和增加負(fù)載量等措施，有可能進(jìn)一步降低柱層析的成本。通過多次柱層析可制備純度大于990的芍藥苷產(chǎn)品。參考文獻(xiàn)1國(guó)家藥典委員會(huì)中國(guó)藥典,部S北京化學(xué)工業(yè)出版社,20001252袁昌齊主編天然藥物資源開發(fā)利用M南京江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,20001031053徐紅梅,劉青云,戴敏等赤芍總甙抗血栓作用研究J安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2000,19146474邵長(zhǎng)風(fēng),陳堅(jiān),楊吉田等中藥止痛膠囊中芍藥苷的HPLC含量測(cè)定J中草藥,1999,30118228235楊玉華,陳燕均古漢養(yǎng)生精片中芍藥苷的含量J中國(guó)中藥雜志,1997,2221651666郭春燕,張萬明,王治寶等HPLC法測(cè)定桃紅四物湯中芍藥苷和梓