1、本科學(xué)生綜合性實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓名：學(xué)號(hào)：學(xué)院：專(zhuān)業(yè)、班級(jí)：實(shí)驗(yàn)課程指導(dǎo)教師及職稱(chēng)開(kāi)課學(xué)期至學(xué)年上學(xué)期云南師范大學(xué)教務(wù)處編印實(shí)驗(yàn)序號(hào)及名稱(chēng) ： 實(shí)驗(yàn)二、 宮頸癌 HeLa 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間 ： 2013.11.62013.11.20實(shí)驗(yàn)室：睿智三 424一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?：（一）細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備工作（清洗）能獨(dú)立地進(jìn)行用于細(xì)胞培養(yǎng)的個(gè)中器皿的清洗與消毒， 掌握干熱滅菌法、 濕熱滅菌法和濾過(guò)除菌法的操作，了解化學(xué)消毒法的使用方法。（二）、培養(yǎng)基的配制熟練掌握 RPMI 1640 培養(yǎng)基的配制方法（三）、細(xì)胞傳代培養(yǎng)1、 熟練掌握細(xì)胞傳代培養(yǎng)的操作方法。2、觀察外培細(xì)胞在不同時(shí)期的形態(tài)變化及生長(zhǎng)狀況。（四）、死活

2、細(xì)胞的鑒別掌握死活細(xì)胞的鑒別原理及方法。二、儀器、材料和試劑（一）細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備工作（清洗）1、儀器超凈工作臺(tái)、干燥箱、高壓鍋、過(guò)濾器2、材料紫外燈、微孔濾膜（直徑 25mm）：孔徑為 0.22um 3、試劑75%酒精、重鉻酸鉀、濃硫酸、NaOH等（二）、培養(yǎng)基的配制1、儀器超凈工作臺(tái)、微孔過(guò)濾器（0.22um）、高壓滅菌鍋、蒸餾水器、磁力攪拌器、天平、超低溫冰箱、二氧化碳培養(yǎng)箱2、材料細(xì)胞培養(yǎng)瓶、微量加樣器、250ml 和 125ml 試劑瓶、量筒、離心管、pH 試紙、培養(yǎng)細(xì)胞3、試劑HCl、 NaOH、 酚紅RPMI 1640干粉小牛血清、青霉素、鏈霉素、L- 谷氨酰胺NaHCO3、胰酶三蒸

3、水（三）、細(xì)胞傳代培養(yǎng)1、儀器超凈工作臺(tái)、微量加樣器（移液槍?zhuān)?、倒置顯微鏡、高壓滅菌鍋、蒸餾水器、超低溫冰箱、二氧化碳培養(yǎng)箱2、材料細(xì)胞培養(yǎng)瓶、滴管、培養(yǎng)細(xì)胞（四）、死活細(xì)胞的鑒別1、 材料： HeLa 細(xì)胞株2、試劑： 0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液（生理鹽水配制why？）三、實(shí)驗(yàn)原理、裝置示意圖：（一）細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備工作（清洗）清洗與消毒是組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的第一步，是組織培養(yǎng)中工作量最大，也是最基本的步驟。體外培養(yǎng)細(xì)胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對(duì)清潔和無(wú)菌操作的要求程度很高。 細(xì)胞培養(yǎng)不好與清洗不徹底有很大關(guān)系。滅菌手段的選擇也十分重要， 對(duì)不同的物品需采用不同的滅菌方法。 假如選用的方法不對(duì)，即使達(dá)到了

4、無(wú)菌卻使被滅菌藥品喪失了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、生物學(xué)特性或其他使用價(jià)值也不行。（二）、培養(yǎng)基的配制組織培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基一般是由合成培養(yǎng)基和小牛血清配制而成。合成培養(yǎng)基有商品出售，它是根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的需要按一定配方制成的粉狀物質(zhì)。其主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、 無(wú)機(jī)離子和其他輔助物質(zhì)。 它的酸堿度和滲透壓與活體內(nèi)細(xì)胞外液相似。小牛血清含有一定的營(yíng)養(yǎng)成分， 更重要的是它含有細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的生長(zhǎng)因子、激素、貼附因子等，是合成培養(yǎng)基所無(wú)法替代的。此外它還能中和有毒物質(zhì)的毒性。（三）、細(xì)胞傳代培養(yǎng)細(xì)胞傳代培養(yǎng)：當(dāng)原代培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞系細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后（一般形成致密單層），則需要再做培養(yǎng)。即將培養(yǎng)的細(xì)胞分

5、散后，以適當(dāng)比例轉(zhuǎn)移到另一個(gè)或幾個(gè)容器中擴(kuò)大培養(yǎng)，此過(guò)程為傳代培養(yǎng)。一般將傳代培養(yǎng)的積累次數(shù)作為傳代細(xì)胞的代數(shù)。貼壁細(xì)胞指的是體外培養(yǎng)條件下，必須貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)的細(xì)胞，貼壁后一般呈纖維樣細(xì)胞或上皮樣細(xì)胞兩種形態(tài)。貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層厚，繼續(xù)生長(zhǎng)的空間不足，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分也消耗較多，同時(shí)代謝廢物也有較多堆積，需進(jìn)行分瓶培養(yǎng)， 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代擴(kuò)增。對(duì)于貼壁不太緊的細(xì)胞如colo320，可以直接吹散后分瓶。而對(duì)于貼壁較緊的細(xì)胞如HeLa、colo205 貼壁細(xì)胞，則需要以細(xì)胞消化液消化后才能脫落和分散。常用的消化液為胰蛋白酶。胰酶消化的原理： 胰酶是一種蛋白酶， 通過(guò)特定位置上

6、降解蛋白， 使細(xì)胞膜上和培養(yǎng)瓶壁結(jié)合處蛋白降解， 致使兩者分離。 這時(shí)細(xì)胞由于自身內(nèi)部細(xì)胞骨架的張力以及培養(yǎng)液表面張力作用下成為球形。細(xì)胞消化用胰蛋白酶常用的工作液濃度為0.25%，PH 為 7.2-7.4 之間。胰酶消化的程度是一個(gè)關(guān)鍵： 消化過(guò)度會(huì)對(duì)細(xì)胞活性損傷較大，并有部分細(xì)胞漂浮， 隨棄去的胰酶流失， 甚至造成細(xì)胞破碎； 消化不足則細(xì)胞難于從瓶壁吹下，反復(fù)吹打同樣也會(huì)損傷細(xì)胞活性。一般消化時(shí)間為 1 至 3 分鐘，肉眼觀察瓶壁由半透明轉(zhuǎn)為點(diǎn)狀透明時(shí)，棄去胰酶，并加入適量的有血清培養(yǎng)液終止消化，吹打分散。（四）、死活細(xì)胞的鑒別細(xì)胞的存活率是反映細(xì)胞群體生活狀態(tài)的重要指標(biāo)。 多種方法可以鑒

7、別細(xì)胞的死活， 最常用到的方法是染色排除法。其原理是：許多酸性物質(zhì)不容易穿過(guò)活細(xì)胞的質(zhì)膜進(jìn)入胞內(nèi)，卻能滲入死亡的細(xì)胞內(nèi)，使其著色，以此來(lái)區(qū)別死活細(xì)胞。四、實(shí)驗(yàn)方法、步驟、現(xiàn)象及注意事項(xiàng)：（一）細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備工作（清洗）1、清洗1）新玻璃器皿的清洗先用自來(lái)水刷洗，再浸泡5%稀鹽酸中和玻璃表面的堿性物質(zhì)和有害物質(zhì)。2）使用過(guò)的玻璃器皿的清洗（1）立即進(jìn)入清水，避免干涸難洗；（2）用洗滌劑清洗玻璃器皿，自來(lái)水清洗數(shù)遍，倒置自然干燥；（3）浸酸性洗液過(guò)夜；（4）從洗液撈出自來(lái)水沖洗1015 次去除酸性洗液，蒸餾水刷洗3 次，倒置烘干；（5）包裝（牛皮紙或不透水紙） ；（6）高壓（ 15 磅 20min)

8、 或干熱（ 160 度 2h) 滅菌；（7）備用。2、膠塞處理1）新膠塞應(yīng)先用清水清洗之后再用0.2%NaOH煮沸 1020min。2）自來(lái)水清洗 10 次3）用 1%稀鹽酸浸泡 30min。4）自來(lái)水清洗 10 次，蒸餾水刷洗10 次。晾干5）舊膠塞不必用酸堿處理可直接用洗滌劑煮沸清洗數(shù)次，過(guò)蒸餾水，晾干，包裝高壓滅菌，可使用。3、塑料制品的清洗1）用洗滌劑清洗，自來(lái)水沖洗數(shù)遍2）強(qiáng)（次強(qiáng)）酸洗液浸泡26h.3）自來(lái)水沖洗 10 次以上，蒸餾水刷洗10 次4）浸泡在 70%乙醇 0.51h, 備用。5）用前從乙醇中取出，在超級(jí)工作臺(tái)內(nèi)紫外線照射1h。4、Tip 和 Tube 的清洗1）新的國(guó)

9、產(chǎn) Tip 和 Tube 如用于非 RNA提取時(shí)可用蒸餾水刷洗，晾干，高壓滅菌后使用。2）使用過(guò)的 Tip 和 Tube 用后浸泡在 0.2mol/L NaOH 或 0.2mol/L HCl溶液中，清水洗過(guò)，自來(lái)水清洗 10 次晾干，進(jìn)洗液224h。晾干，放入飯盒高壓滅菌，備用。5、洗液的配制常用的洗液是硫酸 - 重鉻酸鉀溶液。洗液可根據(jù)需要配制不同的濃度 （每 4 個(gè)同學(xué)配制 120ml強(qiáng)洗液：重鉻酸鉀6.3g 、濃硫酸 100ml、蒸餾水 20ml）成分強(qiáng)酸洗液強(qiáng)酸洗液重鉻酸鉀63g3150g120g60006濃硫酸1000ml50000ml200ml10000m蒸餾水200ml10000

10、ml1000ml50000ml配制方法：1）將重鉻酸鉀放入大燒杯中，加入蒸餾水放在石棉網(wǎng)上加熱至沸騰并攪拌，使重鉻酸鉀充分溶解。2）將重鉻酸鉀倒入酸缸中，然后緩慢加入濃硫酸并用一長(zhǎng)玻璃棒不斷攪拌，充分溶解。注意：操作時(shí)注意安全， 穿戴好耐酸手套和圍裙， 防止洗液飛濺到衣物皮膚上，不慎飛濺到皮膚應(yīng)立即用大量清水沖洗。6、消毒和滅菌 :1）射線消毒滅菌主要使用 X、60Co進(jìn)行消毒滅菌，用于牛血清或塑料制品。2）紫外線消毒一般用無(wú)臭氧型紫外燈。一般20min，71%細(xì)菌消滅； 40min 后 79%細(xì)菌消滅， 60min 后 86%細(xì)菌消滅。紫外線照射時(shí)間照射再長(zhǎng)也不能100%滅菌，最多只能達(dá)到

11、90%。3）干熱滅菌主要用于玻璃器皿的滅菌。將用于細(xì)胞培養(yǎng)的器皿放入干燥箱內(nèi)，加熱至160 度，保溫90120min。用于 RNA提取實(shí)驗(yàn)的用品則需要180 度，保溫 58h.4）濕熱滅菌也稱(chēng)高壓蒸汽滅菌， 是最有效的一種滅菌方法。 主要應(yīng)用布類(lèi)、 橡膠、金屬器械、玻璃器皿、塑料以及加熱后不發(fā)生沉淀的無(wú)機(jī)溶液。5）濾過(guò)滅菌用于培養(yǎng)用液和各種不能高壓滅菌的溶液。7、化學(xué)消毒法1）70%（75%）酒精消毒2）0.1%新潔爾滅消毒3）來(lái)蘇兒水消毒4）0.5%過(guò)氧乙酸消毒5）乳酸蒸汽消毒6）37%甲醛加高錳酸鉀消毒7）煮沸消毒（二）、培養(yǎng)基的配制1、準(zhǔn)備 ( 清洗與滅菌）2、合成培養(yǎng)基（ RPMI 1

12、640 ）的配制配制 100ml RPMI 1640 母液：1）每 4 小組合稱(chēng) RPMI 1640 干粉 1.04g ，溶于 100ml 的 3DW。2）置于攪拌器上攪拌40 分鐘，直到液體變?yōu)槌吻鍨橹埂?）通入 CO2，使液體變?yōu)榻瘘S色，說(shuō)明培養(yǎng)基完全溶好。4）溶好以后置于超凈臺(tái)中進(jìn)行0.22um 濾過(guò)除菌，分裝至試劑瓶中。5）瓶口封好， -20 或 4貯存。3、小牛血清的處理1）新買(mǎi)的新生小牛血清一定要滅活；2）將新生小牛血清不開(kāi)封置于56水浴鍋中 30min, 期間要不時(shí)輕輕晃動(dòng)， 使受熱均勻，防止沉淀析出。3）已滅活的血清貯存于4。4、生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配制1）雙抗：（100000u/ml

13、 ）(1)160 萬(wàn)單位青霉素 / 瓶+8ml 3DW = 20 萬(wàn)單位 /ml(2)1g 鏈霉素 +5ml 3DW = 200000ug/ml(3) 各取以上的液體 5ml 混合，使其濃度為 10 萬(wàn)單位 /ml ，0.22um 過(guò)濾至 1.5ml 離心管，-20 貯存。2）谷氨酰胺儲(chǔ)備液（ 200mM）：(1)1.5g的谷氨酰胺溶于50ml3DW中（ 30mg/ml=200mM),0.22um過(guò)濾至 1.5ml 離心管中。(2)-20 貯存。注： 200mM=200mmol/L（毫摩爾每升 )3) 飽和 NaHCO3的配制(1) 每組稱(chēng)取 10g 的 NaHCO3溶于 200ml 3DW

14、中，過(guò)濾除菌后分裝于 50ml 試劑瓶。(2)4 保存4) RPMI 1640 生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配制50 毫升儲(chǔ)備液濃度終濃度RPMI 1640 培養(yǎng)液44谷氨酰胺0.530mg/ml0.3mg/ml雙抗雙抗100000u/ml100u/ml小牛血清510%NaHCO3調(diào) pH至 7.0（三）、細(xì)胞傳代培養(yǎng)1、RPMI 1640生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配制50 毫升儲(chǔ)備液濃度終濃度RPMI 1640 培養(yǎng)液44谷氨酰胺0.530mg/ml0.3mg/ml雙抗雙抗100000u/ml100u/ml小牛血清510%NaHCO3調(diào) pH至 7.02、傳代培養(yǎng)步驟（以下均為無(wú)菌操作）從培養(yǎng)箱中取出原代培養(yǎng)細(xì)胞并置于超

15、凈工作臺(tái)， 棄去培養(yǎng)液， 加入 0.6ml 的 0.25%胰酶溶液，以使細(xì)胞貼壁面充分浸潤(rùn)， 當(dāng)見(jiàn)到細(xì)胞貼壁面的瓶壁出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時(shí)， 棄去胰酶溶液，并加入適量培養(yǎng)液終止消化，吹打分散。細(xì)胞計(jì)數(shù)：取 5ul 細(xì)胞懸浮液加入等量臺(tái)盼藍(lán)染液， 混勻后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞的成活率。如果樣本成活率高，無(wú)污染即可用于傳代。 ( 計(jì)數(shù)結(jié)果： 4.5 ×106 個(gè)/ml) 。將細(xì)胞分裝至新鮮的培養(yǎng)液中，使細(xì)胞的最終數(shù)量調(diào)節(jié)至1×1053×105 個(gè) /mL。置于 37二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。具體操作：每?jī)蓚€(gè)小組共用一個(gè)培養(yǎng)瓶配制100ml 的生長(zhǎng)培養(yǎng)基每人取 10ml 培養(yǎng)基到自己的細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)向細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)接種400ul 的 HeLa細(xì)胞株原液放入二氧化碳培養(yǎng)箱，旋松瓶蓋根據(jù)細(xì)胞的數(shù)量看細(xì)胞瓶是否平放或直立放置（四）、死活細(xì)胞的鑒別將細(xì)胞懸液充分混勻后取 20ul 放入干凈的離心管中， 加入