1、shRNA干擾載體構(gòu)建SOP目錄第一部分 RNA干擾原理及shRNA設(shè)計4第二部分 酶切與回收7第三部分 退火與連接9第四部分 轉(zhuǎn)化與涂平板11第五部分 挑菌與菌液PCR13第六部分 質(zhì)粒提取15第一部分 RNA干擾原理及shRNA設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)1. 目的：了解RNA干擾原理，設(shè)計shRNA干擾序列2. 儀器與設(shè)備：需要能夠連接Internet的個人計算機，引物設(shè)計相關(guān)軟件(如Primer Premier 5)。3. 操作步驟3.1 RNA干擾原理1) RNAi概述： RNA干擾（RNA interference, RNAi）是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-

2、stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。簡單的說是指一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。當(dāng)細胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達沉默，是一種特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing)。由于RNAi具有高度的序列專一性和有效的干擾，可以特異地將特定的基因沉默，從而獲得基因功能喪失或基因表達量的降低，因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強有力的研究工具。RNAi技術(shù)可廣泛應(yīng)用到包括功能學(xué)，藥物靶點篩選，細胞信號傳導(dǎo)通路分析，疾病治療等等。2) RNAi原

3、理：RNA干擾包括起始階段和效應(yīng)階段(inititation and effector steps)。在起始階段，小分子RNA被切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。證據(jù)表明；一個稱為Dicer的酶，是RNase III家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因,病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，形成19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個片段的3端都有2個堿基突出。在RNAi效應(yīng)階段，siRNA雙鏈結(jié)合一個核酶復(fù)合物從而形成所謂RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-in

4、duced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一個ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過程。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄體上，并在距離siRNA 3端12個堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機制尚不明了，但每個RISC都包含一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶。3) RNAi示意圖(見圖1)3.2 shRNA設(shè)計1) shRNA: 即short hairpin RNA(短發(fā)卡RNA) ，包含兩個短反向重復(fù)序列(其中一個與目的基因互補)，中間由一個loop序列分隔，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。shRNA在體內(nèi)可以被加工成siRNA從而降解目的基因

5、.。示意圖見圖2。2) shRNA作用原理：見圖3。3) shRNA設(shè)計原則：l 克隆到shRNA表達載體中的shRNA包括兩個短反向重復(fù)序列，中間由一莖環(huán)(loop)序列分隔的，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由pol啟動子控制。隨后在連上5-6個T作為RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄終止子；l 兩個互補的寡核苷酸兩端須帶有限制性酶切位點；l StrataGENE發(fā)現(xiàn)29個寡核苷酸較之原先推薦的23個寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因；l 在啟動子下游的酶切位點下方緊連一個C，使插入片段和啟動子有一定空間間隔以確保轉(zhuǎn)錄的發(fā)生；l shRNA目的序列的第一個堿基必須是G以確保RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。如果選擇的目的序列不以G開頭，必須

6、在緊連正義鏈的上游加一個G；l ShRNA插入片段中的莖環(huán)應(yīng)當(dāng)靠近寡核苷酸的中央。不同大小和核苷酸序列的莖環(huán)都被成功的運用過。其中包含一個獨特的限制性酶切位點的莖環(huán)利于檢測帶有shRNA插入片段的克隆。在比較了眾多不同長度和序列的莖環(huán)，5'TCAAGAG3'序列最為有效(AMBION use)；l 5-6個T必須放置在shRNA插入片段尾部以確保RNA聚合酶III終止轉(zhuǎn)錄(stop)；l 在正義鏈和反義鏈序列上不能出現(xiàn)連續(xù)3個或以上的T，這可能導(dǎo)致shRNA轉(zhuǎn)錄的提前終止；l 從轉(zhuǎn)錄本(mRNA)的AUG起始密碼開始，尋找“AA或者NA”二連序列，并記下其3'端的19個

7、堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。正義鏈和反義鏈都采用這19個堿基(不包括AA或者NA重復(fù))來設(shè)計。圖1 RNAi原理圖2 shRNA示意圖 圖3 shRNA作用原理4) shRNA設(shè)計舉例l 以人源基因VEGFC為例，選取干擾靶點序列為：GCCGATGCATGTCTAAACTl 在該序列兩端加上酶切位點，中間插入Loop環(huán)，設(shè)計shRNA片段：BamH I 靶點序列 環(huán)結(jié)構(gòu) 靶點反義序列 Hind IIIGATCC GCCGATGCATGTCTAAACT TTCAAGAGA AGTTTAGACATGCATCGGCTTTTTT A G CGGCTACGTACAGATTTGA AAGTTCT

8、CT TCAAATCTGTACGTAGCCGAAAAAA TTCGAl 正反向Oligo序列分別為：H-VEGFC-sh-F:5-GATCCGCCGATGCATGTCTAAACTTTCAAGAGAAGTTTAGACATGCATCGGCTTTTTTA-3H-VEGFC-sh-R:5-AGCTTAAAAAAGCCGATGCATGTCTAAACTTCTCTTGAAAGTTTAGACATGCATCGGCG-3 將該Oligo片段正反向一起混合退火后，即可直接與載體進行連接，構(gòu)建shRNA干擾載體。第二部分 干擾載體pRNAT-U6.1概述標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)實驗名稱shRNA干擾載體構(gòu)建SOP S2

9、：干擾載體pRNAT-U6.1概述起草人修訂人何章榮修訂日期2015.7審核人審核日期批準(zhǔn)人批準(zhǔn)日期頒發(fā)部門1. 目的：了解干擾載體pRNAT-U6.1的特點2. pRNAT-U6.1載體概述l 帶有U6啟動子，保證shRNA的高表達；l 帶有GFP標(biāo)簽，可用于檢測轉(zhuǎn)染效率；l 帶有多克隆位點；l 帶有新霉素(Neomycin)抗性，可用于篩選穩(wěn)定細胞株3. pRNAT-U6.1載體圖譜圖1 pRNAT-U6.1載體圖譜第三部分 酶切與回收標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)實驗名稱shRNA干擾載體構(gòu)建SOP S3： 酶切與回收起草人修訂人何章榮修訂日期2015.7審核人審核日期批準(zhǔn)人批準(zhǔn)日期頒發(fā)部門1.

10、 目的：通過酶切可以獲得帶酶切位點的線性化質(zhì)粒載體，使用試劑盒對其進行回收。2. 試劑與材料名稱公司貨號限制性內(nèi)切酶Thermo1.5mL tubeAxygen0.2mL PCR tubeAxygenCycle Pure Kit OMEGAD6492-013. 儀器與設(shè)備名稱公司貨號MAXYGENE Thermal CyclerAxygenMaxyGeneGradient移液器大龍掌上離心機其林貝爾LX-200恒溫水浴鍋精宏DK-804. 操作步驟4.1 酶切以Thermo內(nèi)切酶為例，準(zhǔn)備好冰盒，將所需試劑從冰箱中取出后置于冰上，待試劑融化后，在0.2mL離心管中加入：10×buff

11、er Tango 5L 內(nèi)切酶HindIII 1L 內(nèi)切酶BamHI 1L shRNA干擾質(zhì)粒pNAT-U6.1 1g ddH2O up to 50L蓋緊管蓋，離心15s。將0.2mL離心管置于離心管架上，放入37水浴鍋中，酶切1h(時間長短根據(jù)酶的反應(yīng)效率而異，可參考產(chǎn)品說明書)。也可以直接使用PCR儀進行酶切反應(yīng)。Notes: l 根據(jù)酶的特點，可能要求用到BSA，可根據(jù)說明書進行操作。雙酶切時，如果僅其中一種酶需要用到BSA，則也需要在酶切體系中加入BSA，因為BSA不會影響內(nèi)切酶的活性。l 若兩個位點的內(nèi)切酶使用相同緩沖液(即在該種緩沖液里酶活性最高)，可加入兩種酶同時進行反應(yīng)l 若使

12、用不同緩沖液，則可先進行單酶切，回收后再進行第二次酶切，再次回收。l 由于載體上的兩個酶切位點一般相距較近，有些酶需要更多的保護堿基，則同時進行雙酶切可能效率不高。可先加入需要更多保護堿基(或是酶切效率較低)的內(nèi)切酶，反應(yīng)結(jié)束后回收(如果兩種酶使用同一類緩沖液，則可省去回收步驟)，再加入第二種酶進行反應(yīng)。酶切后的載體通過凝膠電泳分離然后回收純化，去除切割下來的小片段，從而降低假陽性。4.2 酶切產(chǎn)物回收以O(shè)MEGA Cycle Pure Kit試劑盒為例。1) 將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至1.5mL 離心管，加入4-5倍酶切產(chǎn)物體積的Buffer CP；如果PCR片段長度小于200bp，則加入6倍體積的B

13、uffer CP；2) 漩渦震蕩混勻，短暫離心，收集管壁上的液體；3) 將混合物加入至試劑盒提供的HiBind DNA吸附柱，10000g，室溫離心1min；4) 棄殘液，加入700L DNA WASH Buffer，10000g，室溫離心1min；5) 重復(fù)步驟4；6) 棄殘液后，13000，室溫離心2min；7) 將HiBind DNA吸附柱置于干凈的1.5mL 離心管，加入15-30L Elution Buffer或ddH2O，室溫放置1-2min，13000，室溫離心2min，收集DNA產(chǎn)物。第四部分 退火與連接標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)實驗名稱shRNA干擾載體構(gòu)建SOP S4：退火與連

14、接起草人修訂人何章榮修訂日期2015.7審核人審核日期批準(zhǔn)人批準(zhǔn)日期頒發(fā)部門1. 目的：將單鏈的shRNA上下游片段進行退火，形成雙鏈DNA片段，隨后連接至酶切后的載體。2. 試劑與材料：名稱公司貨號5×退火緩沖液自制shRNA Oligo片段華大基因ddH2O自制0.2mL PCR TubeAxygenpRNAT-U6.1/Neo質(zhì)粒載體金斯瑞T4 ligase康為生物CW08053. 儀器與設(shè)備名稱公司貨號離心機ThermoPICO 17掌上離心機其林貝爾LX-200MAXYGENE Thermal CyclerAxygenMaxyGeneGradient移液器大龍4. 操作步驟

15、4.1 退火1) 按下表配制5×退火緩沖液：成分終濃度Tris50mM (pH 8.0)NaCl250mMEDTA5mM2) 將合成好的Oligo片段用蒸餾水溶解稀釋至100M，在0.2mL 離心管中按下表加入各成分：Oligo F (100M)4LOligo R (100M)4L5×退火緩沖液2L3) 一共10L，短暫離心后將液體收集至管底，放入PCR儀中，執(zhí)行以下程序：95 5min80 4min75 4min70 4min65 2min60 2min55 2min50 2min45 2min40 2min37 2min 20 20min程序結(jié)束后，可4短時間保存，或-

16、20長期保存。4.3 連接由于shRNA片段已帶有酶切后的粘性末端，故可直接與酶切后的載體進行連接。退火后的混合物稀釋10倍，使用1 10 L移液槍在0.2mL離心管中加入： 10×buffer 1L T4 DNA ligase 0.1L 退火混合物(已稀釋10倍) 1L 酶切后載體 pRNAT-U6.1 3L H2O up to 10L一共10L，輕微吹吸混勻，蓋緊管蓋，離心15s，PCR儀上22反應(yīng)30min。第五部分 轉(zhuǎn)化與涂平板標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)實驗名稱shRNA干擾載體構(gòu)建SOP S5: 轉(zhuǎn)化與涂平板起草人修訂人何章榮修訂日期2015.7審核人審核日期批準(zhǔn)人批準(zhǔn)日期頒發(fā)

17、部門1. 目的：將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后涂平板進行篩選。2. 試劑與材料名稱公司貨號DH5博邁德瓊脂糖 Biowest瓊脂粉 BIOSHARP氨芐青霉素 Axygen胰化蛋白胨 OXOIDL42酵母提取物 OXOIDLP0021NaCl湖南匯虹一次性使用培養(yǎng)皿姜堰市為爾康醫(yī)用品公司1.5mL tubeAxygen0.2mL PCR tubeAxygen3. 儀器與設(shè)備名稱公司貨號恒溫搖床上海浦東物理化學(xué)儀器廠THZ-92C移液器大龍掌上離心機其林貝爾LX-200恒溫水浴鍋精宏DK-80凈化工作臺蘇州凈化SW-CJ-2D磁力加熱攪拌器湘儀78-14. 操作步驟4.1 配制LB培養(yǎng)基w 液

18、體LB培養(yǎng)基：在大燒杯中加入900 ml去離子水，稱取以下試劑加入燒杯中：胰化蛋白胨 10g酵母提取物 5g NaCl 10g用攪拌器攪拌混勻，直至全部溶解。用去離子水定容至1L，121高溫蒸汽滅菌20min。w 固體LB培養(yǎng)基：配置好液態(tài)LB培養(yǎng)基后，加入瓊脂粉至終濃度1.5%，121高溫蒸汽滅菌20min。4.2 轉(zhuǎn)化插入片段和載體連接后，可直接進行轉(zhuǎn)化。1) 打開水浴鍋，調(diào)至42。準(zhǔn)備好冰盒，將裝有大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5(100L)的1.5mL離心管從-80冰箱中取出，迅速置于冰上；2) 待感受態(tài)細胞完全融化后，用1 10 L移液槍將10L連接產(chǎn)物加入1.5mL離心管中，輕微混勻(動作

19、需輕柔)，置于冰上30min；3) 將1.5mL離心管置于42水浴鍋，熱激90s，然后迅速取出，置于冰上5min；4) 超凈臺中操作，在離心管中加入890L不含抗生素的LB培養(yǎng)基，置于37搖床上，200rpm震蕩培養(yǎng)45min；5) 超凈臺中操作，取100L轉(zhuǎn)化液涂布于含抗生素(如氨卞)的LB平板培養(yǎng)基，置于37孵箱，過夜培養(yǎng)。設(shè)置對照：w 對照A將雙酶切后的載體質(zhì)粒直接進行連接反應(yīng)(不加插入片段)，然后進行轉(zhuǎn)化。這個對照可檢測雙酶切是否完全。如果長出克隆，說明雙酶切不完全，部分質(zhì)粒完全沒有酶切或只進行了單酶切，如沒長出克隆，則證明雙酶切完全。w 對照B載體雙酶切后，不進行連接反應(yīng)，直接進行轉(zhuǎn)

20、化。如果長出克隆，說明有殘留的未被任何酶切的原始質(zhì)粒。w 對照C：將未酶切的原始質(zhì)粒直接進行轉(zhuǎn)化，驗證轉(zhuǎn)化過程的正確性。如果長出大量克隆，說明轉(zhuǎn)化成功，否則視為轉(zhuǎn)化失敗。w 對照D：取20L感受態(tài)細胞直接涂布于不含有抗生素的LB平板上，檢測感受態(tài)細胞的活性。如果長出大量克隆，說明感受態(tài)細胞活性好。4.3 涂平板1) 倒平板：將裝有固體LB培養(yǎng)基的三角瓶(去掉封口膜)放入微波爐，加熱使培養(yǎng)基融化，取出后冷卻至55左右(手可觸摸)，在超凈臺內(nèi)操作，加入抗生素(如氨芐青霉素，終濃度100g/mL)，并充分搖勻。將培養(yǎng)基分裝倒入一次性細菌培養(yǎng)皿，每個約10mL，室溫冷卻凝固。可將培養(yǎng)皿用parafil

21、m封口后，倒置放入4冰箱保存?zhèn)溆谩?) 用移液器吸取100L菌液滴至固體培養(yǎng)基表面，用彎曲的玻璃棒(事先酒精燈灼燒后冷卻)將菌液涂布均勻，待菌液吸收干燥后，將培養(yǎng)皿置于37恒溫箱，倒置培養(yǎng)(倒有培養(yǎng)基的一面在上)。Notes: 以上需在超凈工作臺中操作，實驗結(jié)束后及時清理工作臺面。倒平板時，一定要在培養(yǎng)基冷卻后再加入抗生素，以免溫度過高導(dǎo)致抗生素失效。第六部分 挑菌與菌液PCR標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)實驗名稱shRNA干擾載體構(gòu)建SOP S6: 挑菌與菌液PCR起草人修訂人何章榮修訂日期2015.7審核人審核日期批準(zhǔn)人批準(zhǔn)日期頒發(fā)部門1. 目的挑取菌落克隆培養(yǎng)，用菌液直接進行PCR，鑒定目的片段

22、是否已插入載體。2. 試劑與材料名稱公司貨號瓊脂糖 Biowest瓊脂粉 BIOSHARP氨芐青霉素 Axygen胰化蛋白胨 OXOIDL42酵母提取物 OXOIDLP0021NaCl湖南匯虹一次性使用培養(yǎng)皿姜堰市為爾康醫(yī)用品公司1.5mL tubeAxygen0.2mL PCR tubeAxygenHS Mix 東盛生物P2082DNA marker 東盛生物3. 儀器與設(shè)備名稱公司貨號恒溫搖床上海浦東物理化學(xué)儀器廠THZ-92C移液器大龍掌上離心機其林貝爾LX-200恒溫水浴鍋精宏DK-80凈化工作臺蘇州凈化SW-CJ-2D磁力加熱攪拌器湘儀78-1MAXYGENE Thermal Cyc

23、lerAxygenMaxyGeneGradient4. 操作步驟1. 挑菌1) 待平板的菌落長至足夠大達到可挑的水平(肉眼可見，直徑約0.5mm以上)；2) 準(zhǔn)備好若干個1.5mL離心管，各加入500uL含抗生素的LB培養(yǎng)基；3) 用鑷子夾取滅菌的牙簽(或10L槍頭)挑取平板上的單菌落，在離心管內(nèi)的培養(yǎng)基中蘸洗幾下，蓋緊管蓋后再將牙簽丟棄于臺外的收集箱中(若用10L槍頭，可將槍頭留在離心管內(nèi))；4) 接種過菌落的離心管在37搖床中振蕩培養(yǎng)，搖速250rpm；注意試管要在搖床上放好，有適當(dāng)?shù)膬A斜角度（45°左右）。Notes: 以上需在超凈工作臺中操作，實驗結(jié)束后及時清理工作臺面。2.

24、 菌液PCR1) 挑取菌落在37搖床培養(yǎng)4-5h至培養(yǎng)基呈渾濁狀后，將離心管取出，取1L；2) 在0.2mL離心管中加入：HS PCR mix 10L Forward primer(10uM) 1L Reverse primer(10uM) 1L 菌液 1LddH2O 7L3) 一共10uL， 輕微吹吸混勻，蓋緊管蓋，離心15s。打開PCR儀，將離心管置于PCR儀上，蓋緊保護蓋，PCR程序設(shè)置如下：95 10min 30 cycles95 30s55 30s (退火溫度根據(jù)引物Tm值不同而定)72 30s(延伸時間隨目的產(chǎn)物長度及酶的合成效率不同而定) 72 7min 4) PCR程序結(jié)束后，

25、瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果，有目的條帶的克隆即可送公司進行測序鑒定。測序正確則說明載體構(gòu)建成功，可將該克隆擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，以待后續(xù)試驗使用。第七部分 質(zhì)粒提取標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)實驗名稱shRNA干擾載體構(gòu)建SOP S7: 質(zhì)粒提取起草人修訂人何章榮修訂日期2015.7審核人審核日期批準(zhǔn)人批準(zhǔn)日期頒發(fā)部門1. 目的從菌液中提取質(zhì)粒，以供下游實驗(酶切，轉(zhuǎn)染等)使用。2. 試劑與材料名稱公司貨號高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒 天根生物DP107無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒 天根生物DP117異丙醇 湖南匯虹無水乙醇湖南匯虹50ml離心管瓊脂粉 BIOSHARP氨芐青霉素 Amresco0339胰化蛋

26、白胨 OXOIDL42酵母提取物 OXOIDLP0021NaCl湖南匯虹3. 儀器與設(shè)備名稱公司貨號恒溫搖床上海浦東物理化學(xué)儀器廠THZ-92C移液器大龍掌上離心機其林貝爾LX-200恒溫水浴鍋精宏DK-80凈化工作臺蘇州凈化SW-CJ-2D磁力加熱攪拌器湘儀78-1離心機ThermoPICO 17高速冷凍離心機湘儀H2050R4. 操作步驟4.1 質(zhì)粒小提以天根公司試劑盒“高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒(DP107)”為例：1) 柱平衡步驟：向吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）加入500 L的平衡液BL，12,000 rpm (13,400×g ) 離心1 min，倒掉收集管中的廢液，

27、將吸附柱重新放回收集管中。（請使用當(dāng)天處理過的柱子）2) 取5-15 ml過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管中，12,000 rpm (13,400×g ) 離心1 min，盡量吸除上清。注意：菌液較多時可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中, 菌體量以能夠充分裂解為佳，過多的菌體裂解不充分會降低質(zhì)粒的提取效率。3) 向留有菌體沉淀的離心管中加入500 L溶液P1 （請先檢查是否已加入RNase A），使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉淀。注意：請務(wù)必徹底懸浮細菌沉淀，如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。4) 向離心管中加入500 L溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6

28、-8次使菌體充分裂解。注意：溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免污染基因組DNA。此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠，所用時間不應(yīng)超過5 min，以免質(zhì)粒受到破壞。如果未變得清亮，可能由于菌體過多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。5) 向離心管中加入700 L溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12,000 rpm (13,400×g ) 離心10 min，此時在離心管底部形成沉淀。注意：P3加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。6) 將上一步收集的上清液分次加入過濾柱CS（過濾柱放入收集管中），12,000 rpm (13,

29、400×g )離心2 min，小心地將離心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中），（如果過濾柱中有殘余的液體說明步驟5吸取的上清中雜質(zhì)過多，可以延長離心的時間；如果離心后收集管底部有少量的沉淀，盡量地吸取上清）。7) 12,000 rpm (13,400×g ) 離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP4放入收集管中。向吸附柱CP4中加入500 L去蛋白液PD，12,000 rpm (13,400×g )離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP4放入收集管中。8) 向吸附柱CP4中加入600 L漂洗液PW（請先檢查是否已加

30、入無水乙醇），12,000 rpm (13,400×g ) 離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP4放入收集管中。注意：加入漂洗液PW后，如果室溫靜置2-5 min，有助于更好地去除雜質(zhì)。9) 重復(fù)操作步驟9。10) 將吸附柱CP4重新放回收集管中置于12,000 rpm (13,400×g ) 離心2 min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。注意：漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實驗。為確保下游實驗不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱CP4開蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。11) 將吸附柱CP4置于一個干凈的離心管中

31、，向吸附膜的中間部位懸空滴加100-300 L洗脫緩沖液TB， 室溫放置2 min， 12,000 rpm (13,400×g ) 離心1 min將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。注意：洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于100 L，體積過小影響回收效率。且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20，以防DNA降解，洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用ddH2O做洗脫液，應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會降低洗脫效率。為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2 min，12,000 rpm (13,400×g ) 離心2 min，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。

32、注意事項 l 溶液P1在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的RNase A全部加入），混勻，置于2-8保存。l 使用前先檢查平衡液BL、溶液P2和P3是否出現(xiàn)渾濁，如有渾濁現(xiàn)象，可在37水浴中加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清。l 注意不要直接接觸溶液P2和P3，使用后應(yīng)立即蓋緊蓋子。l 所有離心步驟均為使用臺式離心機室溫下進行離心，速度為12,000 rpm (13,400×g )。l 提取的質(zhì)粒量與細菌培養(yǎng)濃度、質(zhì)?？截悢?shù)等因素有關(guān)。如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)粒或大于10kb的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，同時按比例增加P1、P2、P3的用量，洗脫緩沖液應(yīng)在65-70預(yù)熱?？梢赃m當(dāng)?shù)难娱L吸附

33、和洗脫的時間，以增加提取效率。l 實驗前使用平衡液BL處理吸附柱，可以最大限度激活硅基質(zhì)膜，提高得率。l 用平衡液BL處理過的柱子最好當(dāng)天使用，放置時間過長會影響效果。4.2 質(zhì)粒大提以天根公司產(chǎn)品“無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(DP117)”為例：使用前請先在漂洗液PW中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶上的標(biāo)簽。1) 柱平衡步驟：向吸附柱CP6中（吸附柱放入50ml收集管中）加入2.5 ml的平衡液BL，8,000 rpm (8,228×g)離心2 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（用平衡液處理過的柱子最好立即使用）。2) 取100 ml （根據(jù)培養(yǎng)菌體的濃度選擇合適

34、的量，低拷貝推薦用200 ml）過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管，室溫8,000 rpm (8,228×g)離心3 min收集細菌，盡量吸除上清。注意：菌液較多時可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中, 菌液量以能夠充分裂解為佳，菌液過多會導(dǎo)致裂解不充分從而降低質(zhì)粒的提取效率。盡量吸除上清，為確保上清液全部吸取，請用干凈的吸水紙吸去瓶壁上的水滴。3) 向留有菌體沉淀的離心管中加入8 ml溶液P1（請先檢查是否已加入RNase A），使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉淀。注意：請務(wù)必徹底懸浮細菌沉淀，如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解效果，導(dǎo)致提取量和純度偏低。對于低拷貝質(zhì)粒，加大

35、菌體用量的同時按比例增加P1、P2、P4的用量。4) 向離心管中加入8 ml溶液P2，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，室溫放置5 min。注意：溫和地混勻，不要劇烈震蕩，以免污染基因組DNA。此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠，如果未變得清亮，可能由于菌體過多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。 5) 向離心管中加入8 ml溶液P4，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，至溶液出現(xiàn)白色分散絮狀沉淀。然后室溫放置10 min左右。8,000 rpm (8,228×g)離心5-10 min，使白色沉淀離至管底。注意：加入溶液P4后應(yīng)立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果離心后倒入過濾器CS1中的溶液有白色沉淀也不會影

36、響過濾。如果菌體過多（>100 ml），推薦延長離心時間至20-30 min。6) 將全部上清小心倒入過濾器CS1中（請避免倒入大量沉淀而阻塞過濾器），慢慢推動推柄過濾，濾液收集在干凈的50 ml的管中（自備）。7) 向濾液中加入0.3倍濾液體積的異丙醇（加入異丙醇過多容易導(dǎo)致RNA污染），上下顛倒混勻后轉(zhuǎn)移到吸附柱CP6中（吸附柱放入50 ml收集管中）。注意：過濾后濾液會損失，根據(jù)損失的不同請加入不同體積的異丙醇。吸附柱CP6的最大容積為15 ml，所以需要分2次過柱。8) 室溫8,000 rpm (8,228×g)離心2 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP6重新放回收集管中。注意：將第7步中所得溶液分2次過柱，每次均按以上條件操作。9) 向吸附柱CP6中加入10 ml漂洗液PW（請先檢查是否已加入無水乙醇），8,000 rpm (8,228×g)離心2