1、星形細(xì)胞瘤中FHIT、PCNA蛋白表達(dá)及意義核心提示： 作者：席崢席煥久 高志安孫梅珍王紅云 【摘要】 目的 研究人腦星形細(xì)胞瘤中FHIT、PCNA蛋白的差異表達(dá)，探討它們之間、它們與病理分級(jí)及復(fù)發(fā)之間的關(guān)系。方法 應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)了50例星形細(xì)胞瘤中不同級(jí)別的FHIT、PCNA蛋白的表達(dá)水平，以10例非腫瘤腦組織作對(duì)照。結(jié)果 非腫瘤腦組織FHIT、PCNA蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為100%、0，星形細(xì)胞瘤中FHIT、PCNA蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為40%、86%；盡管在星形細(xì)胞瘤中FHIT、PCNA蛋白表達(dá)總體差異有顯著性（P0.05），級(jí)與級(jí)、級(jí)與級(jí)間比較差異有顯著性（P0.05）；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分

2、析FHIT、PCNA蛋白呈顯著負(fù)相關(guān)（P0.01）；8例復(fù)發(fā)病例中復(fù)發(fā)前后FHIT、PCNA蛋白表達(dá)差異有顯著性（P0.05）。結(jié)論 星形細(xì)胞瘤中FHIT、PCNA蛋白表達(dá)之間的顯著負(fù)相關(guān)，提示FHIT蛋白可能對(duì)細(xì)胞增殖具有負(fù)性調(diào)控作用。FHIT、PCNA蛋白的表達(dá)水平可能與星形細(xì)胞瘤的病理分級(jí)和復(fù)發(fā)有關(guān)，推測(cè)FHIT、PCNA蛋白的表達(dá)可能與星形細(xì)胞瘤的腫瘤侵襲性相關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 星形細(xì)胞瘤; FHIT蛋白; PCNA蛋白 Expression and significance of FHIT and PCNA proteins in astrocytoma【Abstract】 Objec

3、tive To study the expression of FHIT and PCNA proteins in human brain astrocytoma; To investigate the relationship between the expression of FHIT and PCNA proteins and pathological grading and recurrence in astrocytoma. Methods Immunohistochemistry staining for FHIT and PCNA proteins were performed

4、in 50 cases of astrocytoma and 10 cases of non-tumor brain tissues. Results The total positive rate of FHIT and PCNA proteins were 100% and 0 in non-tumor brain tissues; and 40% and 86% in astrocytoma respectively; Though total variance of FHIT and PCNA proteins expression among tumor grades wasrema

5、rkable (P0.05) , the significant differencesstatistically of FHIT and PCNA proteins were observed in grade-grade,;and grade-grade,(P0.05); The expression of FHIT and PCNA proteins in astrocytoma were significantly negative correlated(P0.01), the significant differences statistically of FHIT and PCNA

6、 proteins were observed in 8 cases of recurrence (P0.05). Conclusion In astrocytoma. there are significantly inverse relations between the expression of FHIT and PCNA proteins. It is suggested that FHIT protein may play a role in the negative regulation of cell proliferation. The expression of FHIT

7、and PCNA proteins in astrocytoma were significantly correlated with pathological grading and relapse likely. Abnormal expression of FHIT and PCNA proteins in astrocytoma may relate to tumor invasive. 【Key words】 astrocytoma；FHIT protein；PCNA protein 1996年Ohta1等人利用外顯子捕獲法（exon trapping）確定并克隆出FHIT基因。該基

8、因定位在3號(hào)染色體短臂3p14.2區(qū)域，跨越人類染色體脆性部位FRA3B，并含有編碼組氨酸三聯(lián)體的功能區(qū)，故命名為脆性組氨酸三聯(lián)體基因（fragile histidine triad, FHIT）。FHIT基因存在于大多數(shù)正常組織中，許多惡性腫瘤存在該基因異常。研究FHIT 基因在各種腫瘤組織中的改變，確認(rèn)其是否為抑癌基因是近年來分子腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。Ji等2發(fā)現(xiàn)用FHIT的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的肺癌細(xì)胞系有很明顯的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞凋亡的增加。同時(shí)，F(xiàn)HIT蛋白表達(dá)增加與細(xì)胞增生減少和凋亡活動(dòng)增加相一致3。但此基因在腫瘤細(xì)胞增殖中的作用，目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道十分有限。本文研究FHIT、PCNA蛋

9、白表達(dá)之間的關(guān)系，以及它們與星形細(xì)胞瘤各種病理級(jí)別和復(fù)發(fā)的關(guān)系，旨在探討星形細(xì)胞瘤的FHIT蛋白的表達(dá)程度與腫瘤細(xì)胞過度增殖之間及復(fù)發(fā)的關(guān)系，為進(jìn)一步了解星形細(xì)胞瘤的生物學(xué)特性，判斷腫瘤的惡性程度和評(píng)估患者預(yù)后復(fù)發(fā)提供參考指標(biāo)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 1 資料與方法 1.1 一般資料 北京市神經(jīng)外科研究所19981999年6月期間收治的隨訪資料完整的50例星形細(xì)胞瘤患者。級(jí)9例，級(jí)18例，級(jí)23例。經(jīng)手術(shù)病理證實(shí),術(shù)前均未采取放療、化療和免疫治療。10例非腫瘤腦組織作為對(duì)照。標(biāo)本經(jīng)常規(guī)處理后5m厚度連續(xù)切片，行HE染色和免疫組化染色。 1.2 主要試劑及儀器 兔抗人多克隆抗體FHIT（工作液），鼠抗人單克

10、隆抗體PCNA（PC10，工作液），SP試劑盒等均購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。其他為免疫組化常用和必備的試劑和主要儀器。 1.3 實(shí)驗(yàn)方法 常規(guī)免疫組化染色過程。細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為FHIT蛋白表達(dá)陽(yáng)性。參照Greenspan等的半定量法對(duì)染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞百分率進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分為13分判為低表達(dá)（減弱或缺失），4分判為表達(dá)正常4。細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為PCNA蛋白表達(dá)陽(yáng)性（反應(yīng)性星形細(xì)胞、血管周圍淋巴細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞不列入計(jì)數(shù)），用3個(gè)參數(shù)的半定量法對(duì)染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞百分率進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分3分為陰性，3分為陽(yáng)性5。 1.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料應(yīng)用2檢驗(yàn)、Fisher

11、精確概率法、計(jì)量資料比較用LSD方差分析，相關(guān)用等級(jí)相關(guān)(Kendall和Spearman) 檢驗(yàn)。 2 結(jié)果 2.1 FHIT、PCNA蛋白表達(dá)與組別的關(guān)系 如圖13所示隨著星形細(xì)胞瘤的病理級(jí)別升高，F(xiàn)HIT蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率降低, PCNA蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率增高。各級(jí)別星形細(xì)胞瘤FHIT、PCNA蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），級(jí)與級(jí)、級(jí)與級(jí)間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 2.2 FHIT蛋白表達(dá)與PCNA蛋白表達(dá)的關(guān)系 FHIT蛋白表達(dá)陽(yáng)性的20例中有15例同時(shí)有PCNA蛋白的高表達(dá)，而FHIT蛋白表達(dá)陰性的30例中，PCNA蛋白表達(dá)陰性的有2例,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（Cross

12、tabulation Correlations）兩者呈顯著相關(guān)性（P0.01）， r=0.493(Kendall檢驗(yàn))，r=0.563(Spearman檢驗(yàn))，即呈顯著負(fù)相關(guān)。提示FHIT蛋白可能具有對(duì)細(xì)胞增殖的負(fù)性調(diào)控作用。 2.3 星形細(xì)胞瘤中FHIT、 PCNA蛋白表達(dá)與復(fù)發(fā)的關(guān)系 8例復(fù)發(fā)星形細(xì)胞瘤中復(fù)發(fā)前后FHIT、 PCNA蛋白表達(dá)情況見表1。 而未復(fù)發(fā)的42例中FHIT蛋白陰性表達(dá)為15例， PCNA蛋白陽(yáng)性表達(dá)為39例， 結(jié)果提示復(fù)發(fā)后FHIT蛋白陽(yáng)性表達(dá)率降低、 PCNA蛋白陽(yáng)性表達(dá)率增高， 經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P0.05， 推測(cè)FHIT、 PCNA蛋白的表達(dá)與復(fù)發(fā)有關(guān)。表1 星形細(xì)

13、胞瘤中FHIT、PCNA蛋白表達(dá)與復(fù)發(fā)的關(guān)系（略） 3 討論 星形細(xì)胞瘤是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，它的病理分級(jí)是以腫瘤組織內(nèi)從高分化到低分化過程的不同階段人為劃分，并以不同級(jí)別來估計(jì)臨床經(jīng)過及預(yù)后。但是，單以形態(tài)學(xué)為依據(jù)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)不夠準(zhǔn)確、客觀，某些交界性的病例難以確切分級(jí)；且由于腫瘤本身的異質(zhì)性，取材部位的不同可能導(dǎo)致診斷上的誤差。病理學(xué)分級(jí)診斷不能完全反映腫瘤的惡性程度，而腫瘤細(xì)胞增殖活性則能反映腫瘤的生物學(xué)特性及預(yù)后6。 Ohta等1首次發(fā)現(xiàn)一種新的腫瘤抑制基因，即FHIT基因，它在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。FHIT基因全長(zhǎng)1.1Mb，包含F(xiàn)RA3B脆性位點(diǎn)7，編碼分子量為16.8KD的

14、蛋白質(zhì)，即FHIT蛋白。FHIT基因通過其編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)8。FHIT蛋白在腫瘤中的作用尚不完全清楚，可能因其蛋白質(zhì)水解酶活性喪失將導(dǎo)致Ap3A或類似物在體內(nèi)積累，刺激DNA聚合酶合成DNA，使細(xì)胞通過細(xì)胞周期G1期檢測(cè)點(diǎn)進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖而啟動(dòng)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過程。同時(shí)，Ap3A水平升高增強(qiáng)了生長(zhǎng)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，阻斷抑制途徑或凋亡通道導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著星形細(xì)胞瘤惡性程度的增加，F(xiàn)HIT蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率降低。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理星形細(xì)胞瘤級(jí)與級(jí)、級(jí)與級(jí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示星形細(xì)胞瘤中可能存在FHIT基因異?；蚧虮磉_(dá)異常，其異常表達(dá)可能與星形細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展有

15、關(guān)。 細(xì)胞的增殖失控是惡性腫瘤的重要特征之一9。PCNA是真核細(xì)胞DNA合成必不可少的一種36kDa核蛋白，PCNA的表達(dá)和合成與細(xì)胞的增殖周期相關(guān)。新近研究證實(shí)它是DNA聚合酶的輔助蛋白，參與細(xì)胞增殖過程中DNA的合成，它在G1期開始增加，S期含量最高，G2期開始下降，M期含量最低。對(duì)DNA復(fù)制的調(diào)節(jié)起著重要作用，其含量和表達(dá)程度反映了細(xì)胞的增殖狀態(tài)，其過度表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，是腫瘤惡性程度的重要指標(biāo)10。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著星形細(xì)胞瘤惡性程度的增加，PCNA蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率升高。提示細(xì)胞在受到各種致癌因素作用后PCNA出現(xiàn)過表達(dá)，DNA的合成量增加，細(xì)胞增殖活性增高，最終導(dǎo)致癌變，與有關(guān)文獻(xiàn)

16、報(bào)道相似11。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理星形細(xì)胞瘤級(jí)與級(jí)、級(jí)與級(jí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明星形細(xì)胞瘤中惡性程度越高，腫瘤細(xì)胞的增殖活性越高。提示了PCNA蛋白可能與星形細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。 星形細(xì)胞瘤的級(jí)和級(jí)是腫瘤惡性發(fā)展進(jìn)程中的不同階段，難以截然分開，可能正是這個(gè)原因使得這兩種蛋白在級(jí)與級(jí)之間差異皆無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析認(rèn)為FHIT蛋白與PCNA蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（P0.01），這與Morikawa12等報(bào)道一致。提示惡性程度高的星形細(xì)胞瘤有較高的細(xì)胞增殖率，可能與FHIT蛋白缺失有關(guān)。許多學(xué)者用酵母雙雜交法篩選到與FHIT蛋白相互作用的蛋白，它的序列與人泛素結(jié)合酶9完全相同，已知酵母的泛素結(jié)合

17、酶9與S期及M期細(xì)胞周期蛋白的降解有關(guān)，因此推測(cè)FHIT蛋白可能通過泛素結(jié)合酶來調(diào)控細(xì)胞周期。同時(shí)檢測(cè)點(diǎn)異?？赡軐?dǎo)致受損傷的DNA順利進(jìn)入S期，而不能得以修復(fù)，從而促使細(xì)胞轉(zhuǎn)化或增殖失控或凋亡受阻。因此提示FHIT蛋白可能具有對(duì)細(xì)胞增殖的負(fù)性調(diào)控作用。FHIT基因缺失或突變可能導(dǎo)致FHIT蛋白表達(dá)降低或喪失，從而導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖。 在臨床實(shí)踐中，我們常常發(fā)現(xiàn)同一病理級(jí)別的星形細(xì)胞瘤患者其預(yù)后可能不同，從病理組織學(xué)角度有時(shí)難以解釋。Beppu對(duì)20例低級(jí)別星形細(xì)胞瘤PCNA免疫組化染色的結(jié)果，經(jīng)多變量分析統(tǒng)計(jì)處理顯示PCNA是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后判斷指標(biāo)13，與譚平國(guó)5等的報(bào)道一致。本試驗(yàn)8例復(fù)發(fā)病

18、例中復(fù)發(fā)前后FHIT蛋白陽(yáng)性表達(dá)率降低，PCNA蛋白陽(yáng)性表達(dá)率升高。經(jīng)Fisher精確檢驗(yàn)（P0.05單側(cè)），提示FHIT蛋白和PCNA蛋白的表達(dá)水平可能與復(fù)發(fā)有關(guān)，因而這兩種蛋白表達(dá)水平有可能作為判斷復(fù)發(fā)的參考指標(biāo)。 因此，聯(lián)合檢測(cè)FHIT蛋白和PCNA蛋白的表達(dá)，對(duì)了解星形細(xì)胞瘤的生物學(xué)行為及判斷預(yù)后復(fù)發(fā)有重要的臨床參考價(jià)值。 隨著研究的逐步深入，會(huì)對(duì)FHIT基因與腫瘤的關(guān)系有更清晰的認(rèn)識(shí)，為腫瘤的分子生物學(xué)研究提供新的思路，為開展腫瘤的基因治療提供依據(jù)。當(dāng)然，F(xiàn)HIT蛋白對(duì)細(xì)胞增殖的負(fù)性調(diào)控原理及FHIT基因的抑癌機(jī)制等問題還存在不少爭(zhēng)議，將是今后研究的方向和重點(diǎn)。 【參考文獻(xiàn)】 1 O

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