1、多廿烷醇對(duì)健康受試者體內(nèi)分離而得的低密度脂蛋白（LDL）在體外氧化修飾易感性的作用Roberto Menéndez, Rosa Más, Ana MA. Amor, Rosa MA. González, Julio C. Fernández, Idania Rodeiro, Mirta Zayas & Sonia Jiménez古巴Havana，PO Box 6880，國家科學(xué)研究中心天然產(chǎn)物中心目的：本研究旨在研究多廿烷醇對(duì)健康受試者體內(nèi)的低密度脂蛋白（LDL）在體外脂質(zhì)過氧化易感性的作用。方法：為研究多廿烷醇（5毫克或10毫克/天）

2、對(duì)低密度脂蛋白氧化的作用，進(jìn)行了一項(xiàng)雙盲，隨機(jī)安慰劑對(duì)照包含69名受試者的試驗(yàn)。低密度脂蛋白-膽固醇在基線以及8周后分離并進(jìn)行體外低密度脂蛋白-膽固醇氧化測(cè)試。我們?cè)诩尤脬~離子的無細(xì)胞系統(tǒng)中以及在巨噬細(xì)胞介導(dǎo)氧化的更好的生理系統(tǒng)中測(cè)試低密度脂蛋白-膽固醇脂質(zhì)過氧化易感性。結(jié)果：基線狀態(tài)下，所有組別中的所有變量均相似。經(jīng)過8周的5毫克/天或10毫克/天多廿烷醇治療后，共軛雙烯體生成的延滯期產(chǎn)生基于劑量的顯著增加，5毫克/天的劑量下，均值±標(biāo)準(zhǔn)差從83.79±29.16分鐘增至94.90±25.50分鐘；10毫克/天的劑量下，均值±標(biāo)準(zhǔn)差從82.74

3、7;17.16分鐘增至129.9±35.71分鐘，而安慰劑組為見明顯變化。10毫克/天多廿烷醇顯著降低共軛雙烯體的生成。療程結(jié)束后，給藥組與安慰劑組比較后發(fā)現(xiàn)具明顯的差異，通過硫代巴比妥酸反應(yīng)物法(ThiobarbituricAcidReactiveSubstanceAssay,TBARS 測(cè)定多廿烷醇對(duì)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)氧化的抑制作用。10毫克/天多廿烷醇顯著降低丙二醛（MDR）的生成，從8.50±0.91降至5.76±1.01納摩爾每毫克蛋白質(zhì)。與安慰劑組相比，5毫克/天或10毫克/天多廿烷醇給藥組具明顯差異，多廿烷醇分別降低總膽固醇10.5%（5毫克/天）和12.

4、4%（10毫克/天），低密度脂蛋白-膽固醇16.7%和20.2%。同時(shí)，多廿烷醇（10毫克/天）增加高密度脂蛋白-膽固醇15.2%。5例受試者退出試驗(yàn)，不是由于遭受到不良反應(yīng)。未見臨床上或與藥物相關(guān)的血液生化紊亂。結(jié)論：本研究表明多廿烷醇以臨床劑量給藥來降膽固醇（5毫克/天或10毫克/天）可降低低密度脂蛋白-膽固醇體外脂質(zhì)過氧化易感性。關(guān)鍵字：銅離子介導(dǎo)氧化，健康受試者，LDL脂質(zhì)過氧化，巨噬細(xì)胞介導(dǎo)氧化，多廿烷醇前言冠心?。–HD）與血清中總膽固醇濃度的升高，尤其是低密度脂蛋白-膽固醇（LDL-C）的關(guān)系已多次證明1-3，高膽固醇血癥患者進(jìn)行藥物治療降低膽固醇的良好效果也已證實(shí)可信1,4，一

5、系列證據(jù)表明低密度脂蛋白-膽固醇的氧化修飾提供了血漿中低密度脂蛋白-膽固醇與動(dòng)脈粥樣硬化形成的重要聯(lián)系5,6。低密度脂蛋白-膽固醇的氧化是一個(gè)脂質(zhì)過氧化過程，其中的不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)過氧化物，然后變?yōu)橐恍┎伙柡腿?。這些成分在低密度脂蛋白-膽固醇微粒中形成，且被認(rèn)為與載體蛋白B（apo B）的氨基酸側(cè)鏈共價(jià)結(jié)合，修飾其帶正電荷氨基酸殘基，這將降低載體蛋白B對(duì)低密度脂蛋白-膽固醇的親和力總而增加對(duì)清道夫受體的親和力7。氧化的低密度脂蛋白-膽固醇由巨噬細(xì)胞攝取形成脂質(zhì)負(fù)荷細(xì)胞，為早期動(dòng)脈粥樣硬化的標(biāo)志8。修飾低密度脂蛋白-膽固醇（oLDL-C）的其他特性可增加動(dòng)脈硬化，也由于其對(duì)單核細(xì)胞的趨向性

6、9、對(duì)血管壁內(nèi)皮細(xì)胞毒性10以及抑制一氧化氮介導(dǎo)的血管舒張11而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成。oLDL-C的一系列致動(dòng)脈粥樣硬化特性妨礙了預(yù)防人類冠心病治療策略的形成。多廿烷醇為從甘蔗蠟中提純的高級(jí)脂肪醇混合物,在動(dòng)物模型中12,13、健康受試者14以及型高膽固醇血癥患者15-29中證實(shí)具降膽固醇效果。臨床前研究表明給血脂正常大鼠口服多廿烷醇給藥四周，發(fā)現(xiàn)可部分防止體內(nèi)外微粒體脂質(zhì)的過氧化以及抑制含LDL-C+VLDL-C脂蛋白片段的過氧化31。多廿烷醇顯著延長(zhǎng)氧化的延滯期而減少雙烯體的生成，降低最大值，而且多廿烷醇降低LDL-C+VLDL-C脂蛋白片段中丙二醛（MDA）的形成并降低銅介導(dǎo)氧化后脂蛋

7、白中賴氨酸基團(tuán)的反應(yīng)活性，可起到保護(hù)脂蛋白基團(tuán)的作用。本研究目的在于觀察多廿烷醇作為降低膽固醇藥物以正常劑量范圍給藥，對(duì)健康受試者體內(nèi)的低密度脂蛋白-膽固醇體外脂質(zhì)過氧化易感性的作用。方法共69名血脂正常（血清膽固醇水平<5.2毫摩爾/升，甘油三酯<2.2毫摩爾/升），年齡在20-60歲之間的男性和女性參與本研究。當(dāng)前吸煙者、酗酒者、慢性病以及在招募期內(nèi)有急性病的人員均不得參加本次研究；此外，研究前三個(gè)月內(nèi)服用抗氧化劑或維他命以及懷孕的婦女也需排除。在研究中，不得使用任何已知具抗氧化作用的藥物或補(bǔ)充品。試驗(yàn)設(shè)計(jì)本研究遵守赫爾辛基宣言(the Declaration of Helsi

8、nki并經(jīng)國家科學(xué)研究中心的倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。受試者上交書面知情同意書后參與研究。同時(shí)已記錄下一般數(shù)據(jù)并進(jìn)行臨床檢查。滿足參與研究標(biāo)準(zhǔn)的受試者隨機(jī)分組，雙盲條件下使用安慰劑（n=23）或5毫克/天多廿烷醇（n=24）或10毫克/天多廿烷醇（n=22）。要求受試者晚飯后服用片劑，每天一次，為期8周，在基線時(shí)以及8周給藥后進(jìn)行脂質(zhì)過氧化測(cè)試、血液測(cè)試、臨床檢查以及要求反饋產(chǎn)生不良反應(yīng)等。234nm下的吸光度 孵育時(shí)間（分鐘） 孵育時(shí)間（分鐘）血液樣本為過夜禁食(12小時(shí)后空腹采集并盡快測(cè)定脂質(zhì)，血液生化安全性指標(biāo)以及脂質(zhì)過氧化分析。，血清中的總膽固醇，甘油三酯和血液中的化學(xué)物質(zhì)（葡萄糖，谷丙轉(zhuǎn)氨酶A

9、LT，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶AST和肌酐）用Boehringer Mannheim (Mannheim, 德國生產(chǎn)的試劑盒采用酶法來進(jìn)行測(cè)定。高密度脂蛋白-膽固醇（HDL-C）水平作為膽固醇含量可通過測(cè)定-脂蛋白沉淀32的上層清夜而獲得，低密度脂蛋白-膽固醇含量用Friedewald公式計(jì)算而得33，實(shí)驗(yàn)室分析均在內(nèi)外科研究中心的自動(dòng)分析儀上（Hitachi）進(jìn)行，整個(gè)研究進(jìn)行系統(tǒng)的質(zhì)量控制。低密度脂蛋白-膽固醇氧化評(píng)價(jià)技術(shù)低密度脂蛋白-膽固醇的分離。過夜禁食(12小時(shí)后空腹靜脈采集血液樣品至含有適量10%EDTA水溶液的塑料管中，最終可得濃度為0.1%（w/v）的血液樣品。收集后立即離心分離獲取血漿

10、，加入蔗糖（最終濃度為6克/升）以防止低密度脂蛋白-膽固醇凝集，-80條件下冷藏34。樣品儲(chǔ)存約三周。根據(jù)Terpsta等人35所述，凝結(jié)的EDTA-血漿快速解凍后用密度梯度超速離心機(jī)制備低密度脂蛋白-膽固醇（Beckman L7 超速離心機(jī)，Beckman SW40轉(zhuǎn)子285000g（最大），22小時(shí)）且氨基酸不著黑色。分離得到的低密度脂蛋白在4黑暗條件下于200倍體積的磷酸緩沖液中（PBS，0.01M磷酸鹽，0.15M氯化鈉，pH7.4）透析24小時(shí)，在此過程中更換緩沖液兩次并在使用前用氮?dú)獯祾?。低密度脂蛋?膽固醇根據(jù)改良的Lowry法36測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度而獲得。Cu2+誘導(dǎo)的低密度脂蛋

11、白-膽固醇氧化動(dòng)力學(xué)。過夜透析后的低密度脂蛋白-膽固醇（50微克/毫升蛋白質(zhì)）在5微摩爾（最終濃度）CuSO4存在的情況下進(jìn)行氧化。低密度脂蛋白-膽固醇氧化的動(dòng)力學(xué)過程通過六位自動(dòng)進(jìn)樣溫控（37）Ultrospec plus 分光光度計(jì)（LKB）在234波長(zhǎng)下連續(xù)監(jiān)測(cè)吸光度的變化來進(jìn)行，共軛二烯烴曲線中所得的數(shù)據(jù)以時(shí)程曲線表示。吸光度隨時(shí)間的變化分為三個(gè)不同的階段：（1）延滯期，吸光度不增加或僅略微增加，（2）生成階段，吸光度快速增加至最大值（3）分解階段，共軛雙烯體達(dá)到最大值后，慢慢分解形成醛類。作曲線生成階段較陡部分的切線并延長(zhǎng)至水平軸（時(shí)間），Cu2+加入后的時(shí)間點(diǎn)與水平軸的交點(diǎn)的區(qū)間即

12、為延滯時(shí)間，以分鐘表示。增加速率通過作生成階段曲線的切線計(jì)算而得，共軛雙烯體的摩爾消光系數(shù)為29500M-1.cm-1，共軛雙烯體的生成速率以每分鐘每毫克低密度脂蛋白-膽固醇生成的納摩爾量來表示。每個(gè)低密度脂蛋白-膽固醇氧化實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行三次，延滯期經(jīng)為期3周的檢查，低密度脂蛋白-膽固醇從儲(chǔ)存不同時(shí)間的血漿庫里分離獲得，并重復(fù)測(cè)定延滯時(shí)間。單個(gè)LDL-C溶液的批間變異系數(shù)為2.48%，四天內(nèi)獲得的批內(nèi)變異系數(shù)為3.88%。試驗(yàn)開始前，驗(yàn)證從五名受試者體內(nèi)分離而得并儲(chǔ)存于試驗(yàn)條件下的不同血漿樣品的穩(wěn)定性，儲(chǔ)存3周的血液樣品延滯期的測(cè)定結(jié)果變異范圍為3.0%-5.8%（均值，4.4%）。表1.參與研

13、究受試者的基線特征（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）安慰劑5毫克/天多廿烷醇，n=2410毫克/天多廿烷醇，n=22總數(shù)n=69年齡（歲）體重（千克）性別（男/女）LDL-C甘油三酯HDL-C40±1064.2±10.49/144.40±0.662.99±0.631.21±0.420.96±0.2538±1065.4±11.511/134.60±0.723.19±0.671.14±0.490.98±0.2240±1167.9±17.28/144.64±0

14、.552.65±0.661.06±0.450.96±0.22NSNSNS1NSNSNSNS39±1065.8±13.228/14（n）受試者人數(shù)；NS表示與安慰劑相比無顯著差異（曼-惠特尼U檢驗(yàn)）NS1與安慰劑相比無顯著差異（費(fèi)歇爾恰當(dāng)概率試驗(yàn)）表2.用安慰劑或多廿烷醇治療的受試者脂質(zhì)情況（每毫摩爾）組基線8周%總膽固醇安慰劑多廿烷醇-5多廿烷醇-10LDL-C安慰劑多廿烷醇-5多廿烷醇-10HDL-C安慰劑多廿烷醇-5多廿烷醇-10甘油三酯安慰劑多廿烷醇-5多廿烷醇-104.40±0.664.60±0.724.64

15、7;0.582.99±0.633.19±0.673.28±0.630.96±0.250.98±0.220.96±0.221.21±0.421.14±0.491.06±0.454.57±0.554.10±0.63*+4.06±0.64*+3.12±0.512.65±0.66*+2.64±0.67*+0.94±0.211.07±0.28*+1.08±0.21*+1.37±0.661.03±0.49+0

16、.90±0.39*+a+4.4-10.5+-12.4+7.3-16.7+-20.2+-1.8+9.0+15.2+17.6-9.7b-9.4b%變化百分率（-）降低；（+）增加，*P<0.01;*P<0.001;*P<0.0001。與基線進(jìn)行比較（Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)）b P=0.05，+P<0.05，+P<0.01;+P<0.0001。與安慰劑進(jìn)行比較（曼-惠特尼U檢驗(yàn)），a顯著性差異，顯著性水平P<0.016（Bonferroni校正）。細(xì)胞介導(dǎo)低密度脂蛋白-膽固醇氧化。根據(jù)Whalley等人37所述，透析后，無EDTA低密度脂蛋白-

17、膽固醇樣品立即進(jìn)行細(xì)胞介導(dǎo)的氧化試驗(yàn)，常駐巨噬細(xì)胞由雄性BalC小鼠分離而得。用不含Ca2+ 和Mg2+的冰Dulbecco磷酸緩沖液(PBSA對(duì)小鼠（20-30克）進(jìn)行腹腔灌洗而獲得巨噬細(xì)胞，將細(xì)胞置于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔約含1×106個(gè)細(xì)胞并在CO2且37條件下孵育。培養(yǎng)基由9份體積的達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbcco's modifed Eagle's medium）以及1份體積的每毫升含有50微克慶大霉素的胎牛血清組成。兩小時(shí)后，用達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）沖洗巨噬細(xì)胞數(shù)次即可用于實(shí)驗(yàn)。低密度脂蛋白-膽固醇（100微克/毫升）與巨噬細(xì)胞

18、（改良的巨噬細(xì)胞）或無細(xì)胞的孔（作對(duì)照）中混合孵育20小時(shí)。培養(yǎng)基（0.5毫升/孔）由每毫升含有50微克慶大霉素的HamsF-10培養(yǎng)基組成。孵育結(jié)束后，加入DETA和2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（抗氧化劑）（最終濃度分別為20M和2mM）以防止進(jìn)一步氧化，除去培養(yǎng)基并離心除去脫落的細(xì)胞（250g，10分鐘，4）。如前所述，用硫代巴比妥酸反應(yīng)物法(ThiobarbituricAcidReactiveSubstanceAssay,TBARS分析培養(yǎng)基中的低密度脂蛋白-膽固醇38，新鮮稀釋的1,1,3,3-四乙氧基丙烷用作標(biāo)準(zhǔn)參照物。TBARS以MDA當(dāng)量（每毫克蛋白質(zhì)含有納摩爾MDA）表示。每個(gè)低密度

19、脂蛋白-膽固醇氧化試驗(yàn)重復(fù)三次。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Wilcoxon檢驗(yàn) (Wilcoxon signed-rank test進(jìn)行組內(nèi)成對(duì)樣本的比較，用曼-惠特尼U檢驗(yàn)（Mann-Whitney U test）進(jìn)行組間的比較，雙側(cè)檢驗(yàn)的p值<0.05則認(rèn)為具顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，單項(xiàng)測(cè)試中的多重比較用Bonferroni校正（Bonferroni adjustment）法39，為校正多重測(cè)試，選取<0.016(0.05÷3作為顯著性水平。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用CSS統(tǒng)計(jì)程序包（Star Soft, Tulsa. Oklahoma）表3.銅介導(dǎo)的氧化動(dòng)力學(xué)變化組

20、基線8周延滯時(shí)間（分鐘）安慰劑多廿烷醇-5多廿烷醇-10增加速率（毫摩爾雙烯體/分·毫克蛋白質(zhì)）安慰劑多廿烷醇-5多廿烷醇-1088.17±23.3883.79±29.1682.74±17.1611.26±3.5710.23±2.2412.53±3.5689.22±16.6294.90±25.50*129.89±35.71*+11.13±2.099.06±1.75+NS7.80±2.64*+*P<0.01;*P<0.001。與基線進(jìn)行比較（Wilcoxo

21、n檢驗(yàn)）+P<0.05；+P<0.01;+P<0.0001。與安慰劑進(jìn)行比較（曼-惠特尼U檢驗(yàn)），NS，顯著性差異，顯著性水平P<0.016（Bonferroni校正）。結(jié)果表1表明參與研究受試者的主要基線特征?；€狀態(tài)下，所有組匹配良好，69名受試者隨機(jī)分組進(jìn)行雙盲治療，64名完成整個(gè)研究。表2總結(jié)了治療對(duì)脂質(zhì)的作用。所有組成員隨機(jī)分組時(shí)的脂質(zhì)情況相似，多廿烷醇（5毫克/天和10毫克/天）與基線相比，顯著降低總膽固醇含量（P<0.0001）（分別降低10.5和12.4%）以及LDL-C（P<0.0001）(分別降低16.7%和20.0%；多廿烷醇（5毫克/

22、天和10毫克/天）增加HDL-C9.0%和15.2%，變化具顯著差異（5毫克/天P<0.01; 10毫克/天P<0.001）；多廿烷醇（10毫克/天）降低甘油三酯9.4%（P<0.01）。此外，8周的治療后，多廿烷醇組（5毫克/天和10毫克/天）和安慰劑組的血漿中的LDL-C水平降低（分別為P=0.020和P=0.019）；HDL-C增加（P=0.03）；最終的三酯水平降低，多廿烷醇（5毫克/天）的P=0.04，多廿烷醇（10毫克/天）的P=0.011。Bonferroni校正將會(huì)影響顯著性，因而多廿烷醇組（5毫克/天和10毫克/天）和安慰劑組最終血漿中的LDL-C濃度用Bo

23、nferroni校正后無顯著差異（P<0.016）。同樣，多廿烷醇組（5毫克/天）和安慰劑組治療8周后的甘油三酯濃度無顯著差異，而且多廿烷醇組（5毫克/天和10毫克/天）和安慰劑組經(jīng)8周治療后，總膽固醇含量與低密度脂蛋白-膽固醇的變化百分率具明顯不同（P<0.0001）；對(duì)高密度脂蛋白-膽固醇而言，接受多廿烷醇組（5毫克/天的P=0.02；10毫克/天的P=0.0078）后，變化百分率增加；甘油三酯具接近顯著性（P=0.05）。Bonferroni校正將會(huì)影響顯著性，因而多廿烷醇組（5毫克/天）和安慰劑組最終血漿中的HDL-C濃度用Bonferroni校正后無顯著差異。表3可見多廿

24、烷醇對(duì)銅介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化參數(shù)的影響作用。基線水平，所有組LDL-C數(shù)值較相似（延滯期以及增加速率）。多廿烷醇組（5毫克/天P<0.01；10毫克/天P<0.001）與基線值相比，延滯期產(chǎn)生與劑量相關(guān)的顯著增加，而安慰劑組保持不變。多廿烷醇組（10毫克/天）與安慰劑相比，顯著增加延滯期的長(zhǎng)度（P<0.001）；多廿烷醇組（5毫克/天）與安慰劑相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異。此外，服用多廿烷醇（5毫克/天）與安慰劑相比，可降低（P=0.018）共軛雙烯體生成的速率。但是使用Bonferroni校正將會(huì)影響顯著性水平。服用多廿烷醇（10毫克/天）與基線（P<0.001）和安慰劑（P<

25、;0.01）相比，可顯著降低共軛雙烯體生成的速率。通過測(cè)定TBARS的生成，多廿烷醇（5毫克/天和10毫克/天）可劑量依賴性地降低低密度脂蛋白-膽固醇在巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的脂質(zhì)氧化易感性（表4）。因此，與基線相比，多廿烷醇5毫克/天和10毫克/天給藥組的TBARS累積降低（5毫克/天P值為0.027，10毫克/天的P值為0.012）。然而，8周以后，用Bonferroni校正，多廿烷醇（5毫克/天）給藥后，TBARS水平未明顯下降（P<0.016），但與安慰劑組相比，多廿烷醇5毫克/天和10毫克/天給藥組的MDA生成顯著下降（P<0.01）。表4. 多廿烷醇（5毫克/天和10毫克/天）降

26、低巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的低密度脂蛋白-膽固醇（LDL-C）脂質(zhì)氧化易感性作用組TBARS（納摩爾 MDA/毫克蛋白質(zhì) ）基線TBARS（納摩爾 MDA/毫克蛋白質(zhì) ）8周安慰劑多廿烷醇-5多廿烷醇-108.48±0.788.55±0.298.50±0.919.15±0.667.49±1.03*+5.76±1.01*a+*P<0.05。與基線進(jìn)行比較（Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)），a顯著性差異，顯著性水平P<0.016（Bonferroni校正），+P<0.01與安慰劑進(jìn)行比較（曼-惠特尼U檢驗(yàn)）。治療具有良好的耐受性，體重、

27、收縮壓和舒張壓、ALAT、ASAT和葡糖糖水平無明顯變化，因而，上述結(jié)果表明沒有與藥物相關(guān)的紊亂，5名受試者退出研究，沒有人是因?yàn)樵馐懿涣挤磻?yīng)而退出。3名受試者退出實(shí)驗(yàn)是因?yàn)樗麄冞`反了協(xié)議。4名受試者產(chǎn)生了輕微的不良反應(yīng)：2名嗜睡（1例來自安慰劑組，1例來自多廿烷醇5毫克/天組），一例產(chǎn)生乏力（安慰劑組）。另一例有頭痛癥狀（多廿烷醇5毫克/天組）。討論本研究證明了在常規(guī)劑量?jī)?nèi)服用多廿烷醇（5毫克/天和10毫克/天），作為降脂藥物使用可降低低密度脂蛋白-膽固醇在金屬離子以及巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化的敏感性。用于測(cè)定低密度脂蛋白-膽固醇氧化的方法有效且在基線狀態(tài)和8周治療后安慰劑組的銅催化時(shí)程曲線以及巨噬細(xì)胞生成的MDA經(jīng)證實(shí)具重現(xiàn)性。此外，延滯時(shí)間的基線水平和增加速率與前人所述相似5,40，也可驗(yàn)證本研究為描述低密度脂蛋白-膽固醇氧化所采