1、L o g o細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法藥分教研室 丁曉紅三、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法v（一）概述v 1.內(nèi)毒素(Endotoxin)： 即革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖，其毒性成分為類脂A，菌體死亡崩解后釋放出來。v 2.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法：本法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。v 3.什么是鱟試劑？鱟試劑是由海洋生物鱟的血液變形細(xì)胞溶解物制成的無菌冷凍干燥品，含有能被微量細(xì)菌內(nèi)毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固蛋白原，能夠準(zhǔn)確、快速地定性或定量檢測樣品中是否含有細(xì)菌內(nèi)毒素和（1,3）-葡聚糖激。 v 鱟的圖片鱟的長相既像蝦又像蟹，人稱之

2、為“馬蹄蟹”,是一類與三葉蟲(現(xiàn)在只有化石)一樣古老的動物。 鱟的血液中含有銅離子，它的血液是藍(lán)色的。這種藍(lán)色血液的提取物鱟的血液中含有銅離子，它的血液是藍(lán)色的。這種藍(lán)色血液的提取物“鱟試鱟試劑劑”，可以準(zhǔn)確、快速地檢測人體內(nèi)部組織是否因細(xì)菌感染而致?。辉谥扑幒褪称?，可以準(zhǔn)確、快速地檢測人體內(nèi)部組織是否因細(xì)菌感染而致?。辉谥扑幒褪称饭I(yè)中，可用它對毒素污染進(jìn)行監(jiān)測。工業(yè)中，可用它對毒素污染進(jìn)行監(jiān)測。 v 4.檢查方法：包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗。當(dāng)測定結(jié)果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)。v 5.檢查的意

3、義：注射劑熱原或細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是保證注射劑安全性的重要質(zhì)量指標(biāo)。v （二）凝膠法v 1.原理：通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來檢測或半定量內(nèi)毒素的方法。(限量、陽性對照、靈敏度、溶劑、稀釋倍數(shù)限量、陽性對照、靈敏度、溶劑、稀釋倍數(shù)）v 內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位(EU)表示。 v 該法優(yōu)點：快速、靈敏。 v 2.2.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查過程中用到的標(biāo)準(zhǔn)品和試劑v 細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品（RSE）：系自大腸桿菌提取精制得到的內(nèi)毒素。用于標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度。v 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）：系以細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)定，確定其質(zhì)量的相當(dāng)效價。1ng工作標(biāo)準(zhǔn)

4、品效價應(yīng)不小于2EU，不大于50EU。用于鱟試劑靈敏度的復(fù)核、干擾試驗及設(shè)置的各種陽性對照陽性對照。v 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水）：系指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水。是細(xì)菌內(nèi)毒素檢查專用水。v 鱟試劑和鱟試劑靈敏度：a、鱟試劑的生產(chǎn)：利用鱟血制備而成。 v 鱟試劑的種類：美洲鱟試劑（LAL）、中國鱟試劑（TAL）、圓尾鱟試劑（CAL）。v B、鱟試劑的規(guī)格：是指每支鱟試劑的裝量，如：0.1ml、0.5ml。一般來說，規(guī)格是多少就用多少細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶。如：0.1ml就用0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶。v C、鱟試劑標(biāo)示靈敏度：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的規(guī)定條件下，使鱟試劑

5、產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度，用EU/ml表示，如：入=0.5EU/ml。v 細(xì)菌內(nèi)毒素的限值（L）：哺乳動物對細(xì)菌內(nèi)毒素的量有一定的耐受力，只有內(nèi)毒素超過一定的限度，才會引起熱原反應(yīng)。因此內(nèi)毒素的檢查是一個限量檢查，只要不超過限值，產(chǎn)品就合格。確定限值的方法從質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文中查出。v 最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）：供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進(jìn)行內(nèi)毒素限值的測定。 MVD=CL/入。L：內(nèi)毒素限值；c：供試品溶液濃度，當(dāng)L以EU/ml表示時，c=1.0ml/ml；當(dāng)L以EU/mg或EU/u表示時， c的單位為mg/ml或u/ml，如：供試

6、品為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD=1例如：稱取例如：稱取m mg g供試品供試品VmlVml移取注射液移取注射液xmlxmlVmlVmlMVDMVD？C C最大有效最大有效L Lm/v=Lm/v=Lc c樣樣入入,c,c樣樣入入/L/LEU/mgEU/mgLx/v=LLx/v=LMVD MVD 入入,MVD,MVD入入/L/LEU/mlEU/mlv 3.檢查方法v （1）檢查程序：實驗試劑、儀器及用具等的準(zhǔn)備；（除內(nèi)毒素除內(nèi)毒素）v 確定藥品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值L；v 選擇鱟試劑的靈敏度入；v 計算供試品的最大有效稀釋倍數(shù)或最低有效濃度；v 鱟試劑靈敏度的復(fù)核復(fù)核；v 藥品與鱟試劑的相容性的初

7、選實驗（無干擾濃度初選）；v 供試品的干擾實驗的驗證（正式干擾試驗）；v 供試品日常的內(nèi)毒素限量檢查。v 在實際操作過程中，（1）（4）順序可變，（5）（8）順序不能變。v (2)實驗準(zhǔn)備v A、除去干擾：試驗所用器皿需經(jīng)處理，以除去可能存在的外源性內(nèi)毒素，常用的方法是250干烤至少1小時，也可用其它確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素的適宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明無內(nèi)毒素并且對試驗無干擾的器械。試驗操作過程應(yīng)防止微生物的污染。v B、材料與器具：細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、鱟試劑、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水、漩渦混合器、371試管恒溫儀、稀釋、移液容器、試管架或試管浮板、酒精燈、

8、消毒酒精棉球、剪刀、砂輪、鑷子、封口膠布標(biāo)記紙等。v (3)鱟試劑靈敏度的復(fù)核試驗v A、復(fù)核的條件：本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，用EU/ml表示。當(dāng)使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結(jié)果的改變時，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗。v B、操作： 0.1ml/0.1ml/支規(guī)格鱟試劑原安瓿支規(guī)格鱟試劑原安瓿1818支支 復(fù)溶復(fù)溶0.1ml0.1ml內(nèi)毒素檢查用水內(nèi)毒素檢查用水4 4支支4 4支支4 4支支4 4支支2 2支支2.0 2.0 內(nèi)毒素溶液內(nèi)毒素溶液1.0 1.0 內(nèi)毒素溶液內(nèi)毒素溶液0.5 0.5 內(nèi)毒素溶液內(nèi)毒素溶液0

9、.25 0.25 內(nèi)毒素溶液內(nèi)毒素溶液內(nèi)毒素檢查用水內(nèi)毒素檢查用水0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品或國家標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品或國家標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)毒素檢查用水溶解內(nèi)毒素檢查用水溶解15min15min稀稀釋釋373711保溫保溫1h1h呈陽性呈陽性呈陰性呈陰性結(jié)果有效結(jié)果有效計算鱟試計算鱟試劑靈敏度劑靈敏度)4/(lg1Xc)4/(lg1Xc)4/(lg1Xc )4/(lg1Xc 式中：式中：X X為反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值為反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值(lg)(lg)。反應(yīng)終點濃度是。反應(yīng)終點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后

10、一個呈陽性結(jié)果的濃度。指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度。 當(dāng)當(dāng)cc在在0.50.52.02.0時，方可用于內(nèi)毒時，方可用于內(nèi)毒素檢查，并以素檢查，并以C C 為該批鱟試劑靈敏度為該批鱟試劑靈敏度v (4)(4)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查細(xì)菌內(nèi)毒素檢查- -凝膠法凝膠法- -干擾試驗干擾試驗v 按表制備溶液按表制備溶液A A、B B、C C和和D D，使用的供試品溶液應(yīng)為未檢驗出內(nèi)毒素且，使用的供試品溶液應(yīng)為未檢驗出內(nèi)毒素且不超過最大有效稀釋倍數(shù)（不超過最大有效稀釋倍數(shù)（MVDMVD）的溶液，按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗項）的溶液，按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗項下操作。下操作。v 編號編號 內(nèi)毒素濃度內(nèi)

11、毒素濃度/ /配制配制內(nèi)毒素的溶液內(nèi)毒素的溶液 稀釋用液稀釋用液 稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù) 所含內(nèi)毒素所含內(nèi)毒素的濃度的濃度 平行管數(shù)平行管數(shù) A A 無無/ /供試品溶液供試品溶液 2 2B B 2/2/供試品溶液供試品溶液 供試品溶液供試品溶液 1 12 24 48 8 22110.50.50.25 0.25 4 44 44 44 4 C C 2/2/檢查用水檢查用水 檢查用水檢查用水 1 12 24 48 822110.50.50.250.254 44 44 44 4D D 無無/ /檢查用水檢查用水 2 2 干擾試驗結(jié)果判定干擾試驗結(jié)果判定v 前提：前提：A A和和D D的所有平行管都為陰性，

12、并且系列溶液的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C C的結(jié)果在鱟試劑的結(jié)果在鱟試劑靈敏度復(fù)核范圍內(nèi)時，試驗方為有效。靈敏度復(fù)核范圍內(nèi)時，試驗方為有效。v 按下列計算系列溶液按下列計算系列溶液C C和和B B的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（EsEs和和EtEt）。）。v Es=lg-1Es=lg-1（Xs/4)Xs/4)v Et=lg-1 Et=lg-1（Xt/4)Xt/4)v 式中式中 EsEs、EtEt分別為系列溶液分別為系列溶液C C和溶液和溶液B B反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值(lg)(lg)。v 當(dāng)當(dāng)EsEs在在0.52(0.52(包括包括0.5 0.

13、5 和和22）及）及0.5Es2Es0.5Es2Es（包括（包括0.5Es0.5Es和和2Es2Es）時，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。若供試品溶液在小于時，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。若供試品溶液在小于MVDMVD的的稀釋倍數(shù)下對試驗有干擾，應(yīng)將供試品溶液進(jìn)行不超過稀釋倍數(shù)下對試驗有干擾，應(yīng)將供試品溶液進(jìn)行不超過MVDMVD的進(jìn)一步的進(jìn)一步稀釋，再重復(fù)干擾試驗。稀釋，再重復(fù)干擾試驗。v 注：注：A A為供試品溶液；為供試品溶液；B B為干擾試驗系列；為干擾試驗系列；C C為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對照系列；照系列；D D為陰性對照。為陰性對照。v （5 5）檢查方法）檢

14、查方法v 取內(nèi)毒素的工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，用水稀釋至取內(nèi)毒素的工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，用水稀釋至2 2入濃度溶液入濃度溶液 v 取檢品取檢品S S，計算，計算MVD MVD v 把它稀釋成把它稀釋成SMVD SMVD v 取鱟試劑取鱟試劑8 8支（支（0.1ml/0.1ml/支），支），2 2支作為樣品檢查管支作為樣品檢查管(S1(S1、S2)S2)，2 2支標(biāo)支標(biāo)記為陽性對照，記為陽性對照，2 2支為陽性產(chǎn)品對照，支為陽性產(chǎn)品對照，2 2支標(biāo)記為陰性對照支標(biāo)記為陰性對照舉例舉例- -清開靈注射液中清開靈注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查v 設(shè)檢品為設(shè)檢品為S S，L=1.0EU/mlL=1.0EU/

15、ml，選用效價為，選用效價為0.06EU/0.06EU/支、入支、入=0.06EU/ml=0.06EU/ml的鱟試劑，使用的細(xì)菌內(nèi)毒素的工作標(biāo)準(zhǔn)品的的鱟試劑，使用的細(xì)菌內(nèi)毒素的工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價為效價為10 EU/10 EU/支。參數(shù)及支。參數(shù)及MVDMVD已經(jīng)過預(yù)試驗驗證。已經(jīng)過預(yù)試驗驗證。v 操作步驟操作步驟（1 1）?。┤?nèi)毒素的工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，用水稀釋至內(nèi)毒素的工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，用水稀釋至2 2入濃度溶液，即入濃度溶液，即E0.12.E0.12.v （2 2）計算最大稀釋倍數(shù)）計算最大稀釋倍數(shù)MVD=L/MVD=L/入入=1.0/0.06=16=1.0/0.06=16倍倍v （3 3）取檢

16、品）取檢品S S，把它稀釋呈，把它稀釋呈SMVDSMVD：0.2mlS+3.0ml0.2mlS+3.0ml水水 SMVD16SMVD16v （4 4）取鱟試劑）取鱟試劑8 8支（支（0.1ml/0.1ml/支），兩支作為樣品檢支），兩支作為樣品檢查管查管(S1(S1、S2)S2)，2 2支標(biāo)記為陽性對照，支標(biāo)記為陽性對照，2 2支為陽性產(chǎn)支為陽性產(chǎn)品對照，品對照，2 2支標(biāo)記為陰性對照，如下圖所示支標(biāo)記為陰性對照，如下圖所示s1s1s2s2陽性對照陽性對照陽性產(chǎn)品對照陽性產(chǎn)品對照陰性對照陰性對照0.1ml0.1ml水水+0.1ml +0.1ml SMVD16SMVD160.1ml0.1ml水水+0.1ml +0.1ml SMVD16SMVD160.1ml0.1ml水水+0.1ml E2+0.1ml E2入入0.1mlE20.1mlE2入入+0.1ml SMVD16+0.1ml SMVD160.2ml0.2ml水水v （5 5）封閉管口，搖勻，放入）封閉管口，搖勻，放入373711的恒溫水浴保溫的恒溫水浴保溫60602 2分鐘，取出觀察結(jié)果，記錄結(jié)果。分鐘，取出觀察