1、發(fā)酵制藥后處理 發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液組成情況非常復(fù)雜，處理措施與化學合成法明顯不同。通常情況下，發(fā)酵液中目標物濃度很低，而雜質(zhì)含量卻很高，成份遠較化學反應(yīng)母液情況復(fù)雜，大量菌體細胞、培養(yǎng)基、各種蛋白質(zhì)膠狀物、色素、金屬離子和其它代謝物等混雜其中，使得發(fā)酵液的預(yù)處理對于目標物的最終獲取非常必要。 1 1、發(fā)酵液預(yù)處理的目的是使發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)和某些雜質(zhì)沉淀，以增加濾速，過濾的目的是使菌絲體與發(fā)酵液分離，以便從發(fā)酵液或菌絲體中提取目標物。預(yù)處理階段主要去除兩大類雜質(zhì)：可溶性黏膠狀物質(zhì)（核酸、雜蛋白、不溶性多糖等）和無機鹽（不僅影響成品熾灼殘渣，還會影響離子交換法提取目標物的收率）。 確定預(yù)處理方法前

2、， 首先要明確目標物存在于胞內(nèi)（菌體）還是胞外（發(fā)酵液），以確定棄去和收集的對象；還要結(jié)合目標物的穩(wěn)定性等特點，選擇預(yù)處理的 pHpH 溫度和化學試劑等。 對于菌絲體及雜蛋白的處理一般可采用等電點沉淀、變性沉淀、沉淀劑沉淀、加入絮凝劑、加入凝聚劑、吸附以及酶解法去除不溶性多糖等措 施，對提取效果和成品質(zhì)量影響較大的無機雜質(zhì)主要是 Ca2Ca2 太 Mg2Mg2+ +Fe3+Fe3+等高價金屬離子，可采用離子交換法、沉淀法等措施去除。加入的預(yù)處理試劑除要考慮到處理效果外，還要考慮低毒性、利于環(huán)保以及易于從終產(chǎn)品中除去等因素，申報時應(yīng)說明所采取的措施及加入的試劑，必要時在成品質(zhì)量研究中檢測其殘留量

3、。 液一固分離是發(fā)酵液預(yù)處理的重要步驟，通常采用板框壓濾、真空過濾以及離心分離等措施，過濾是各種措施中普遍存在的一個環(huán)節(jié)，為提高過濾效果、提高濾液質(zhì)量，通常加入助濾劑，選擇助濾劑時除考慮其效果和成本外，無毒，惰性，不與濾液和目標物產(chǎn)生化學反應(yīng)對于終產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性尤為重要。 預(yù)處理后的濾液是生產(chǎn)過程中重要的中間產(chǎn)物，類似于化學反應(yīng)中的中間體，有必要制訂其質(zhì)量控制標準，比如，一般情況下要澄清、有一定濃度、pHpH 適中，需要說明的是，后續(xù)的提取工藝不同，對濾液的質(zhì)量要求不同，如離子交換法提取目標物時對無機離子、澄清度等方面要求較嚴格，溶媒法提取時要求濾液蛋白含量較低?？傊?jīng)預(yù)處理后的濾液控制

4、標準應(yīng)根據(jù)其 后的提取工藝綜合確定 2 2、目標物的提取是采用物理或化學手段從發(fā)酵液或菌絲體中得到目標物的濃縮液或粗制品。常用的提取方法有溶媒萃取法、離子交換法、吸附法以及沉淀法。具體采用何種提取方法需結(jié)合目標物化學結(jié)構(gòu)特征、產(chǎn)品組份情況、擬采用的終產(chǎn)品精制工藝、終產(chǎn)品質(zhì)量要求以及對終產(chǎn)品安全性的影響等因素綜合考慮。 溶媒萃取法在目前的微生物藥物尤其抗生素生產(chǎn)中的應(yīng)用較為普遍，特點是產(chǎn)品純度、顏色等質(zhì)量特征較好，盡管離子交換技術(shù)已比較發(fā)達，但還不能完全替代溶媒萃取法。需要注意的是一定要關(guān)注溶劑的安全性，選用毒性低的溶劑如常用乙酸乙酯、乙酸丁酯和丁醇等，用到的溶劑要在質(zhì)量標準中進行殘留量的嚴格控

5、制， 一般不選用 1 1 類和 2 2類溶劑；另外，所用溶劑對目標物應(yīng)具有較好的溶解性和選擇性，少量即可提取完全，并使目標物和雜質(zhì)良好分離。乳化現(xiàn)象是溶媒萃取法中需要克服障礙，如使用去乳化劑，應(yīng)考慮其安全性以及從終產(chǎn)品中的殘留情況，必要時檢測其殘留量。 離子交換法因成本低、設(shè)備簡單、不用 或少用有機溶劑等優(yōu)點，已成為提取抗生素的重要方法之一，如許多氨基糖昔類抗生素和多粘菌素等多用此法提取。但有時產(chǎn)品質(zhì)量特征稍不如意，另外，此種提取過程中 pHpH 變化較大，不適于穩(wěn)定性較差目標物如青霉素等的提取。解吸附時常用水、稀酸、鹽或其他絡(luò)合劑等，一般說來,酸性吸附堿性洗脫，堿性吸附酸性洗脫，為防止洗脫過

6、程 pHpH 變化過大，避免影響目標物穩(wěn)定性，可選用緩沖液洗脫劑，有時還會用到含有機溶劑的洗脫劑以提高洗脫效果，需要考慮的是洗脫劑對目標物的影響、洗脫劑的安全性及其在終產(chǎn)品中的殘留情況，如 NH4NH4 和鏈霉素反應(yīng)會生成毒性很大的二鏈霉胺，故吸附鏈霉素后的飽和樹脂不可使用氨水洗脫。 吸附法在早期的微生物藥物如青霉素、林可霉素以及維生素 B12B12 等的提取中應(yīng)用較多，吸附劑為活性炭、酸性白土以及弱酸性離子交換樹脂等，按原理可分為物理吸附、化學吸附和交換吸附等類型。因選擇性差、收率不高等缺點，在后來的生產(chǎn)中漸被其它方法取代，但近期隨著大孔網(wǎng)狀聚合物吸附劑的合成和發(fā)展，重又得到重視和應(yīng)用。使用

7、時需要關(guān)注溶液pHpH對目標物穩(wěn)定性的影響以及解吸附劑的安全性及其在終產(chǎn)品中的殘留情況。 沉淀法提取目標物在國內(nèi)應(yīng)用較為廣泛，尤其在四環(huán)類抗生素的生產(chǎn)中應(yīng)用較多，一般可分為間接沉淀和直接沉淀兩種類型。如用到沉淀劑，需要考慮其安全性、對目標物穩(wěn)定性的影響以及在終產(chǎn)品中的殘留情況。另外，沉淀法得到的產(chǎn)品一般顆粒粗大，必要時要經(jīng)過粉碎、重新溶解結(jié)晶等措施，控制產(chǎn)品一定的粒度，保證臨床有效性。 3 3、目標物的精制是指將提取得到的目標物濃縮液或粗制品進一步純化為終產(chǎn)品，所采用的方法與化學合成產(chǎn)物的精制方法大體相同，如濃縮干燥法、結(jié)晶與重結(jié)晶法、鹽析法和晶體洗滌法，鑒于微生物藥物多具有化學結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定以及

8、粗品中含有殘存蛋白、同系物、異構(gòu)體、色素等雜質(zhì)的特點，色譜純化、分子篩純化等方法對于保證終產(chǎn)品純度等質(zhì)量特征以及降低臨床應(yīng)用中的致敏性等具有重要意義，是比較理想的精制方法。目標物的精制是制備工藝的終端步驟，對精制效果、產(chǎn)品質(zhì)量特征乃至臨床安全性的關(guān)系更為直接，采取的措施以及使用的試劑需要引起 密切關(guān)注。 由于制備工藝的特殊性，對于微生物藥物來講，脫色、去熱原是精制其注射用原料藥過程中不可或缺的一個單元操作，對終產(chǎn)品的質(zhì)量特征及臨床安全性至關(guān)重要。色素是本身帶有顏色并能使其它物質(zhì)著色的高分子有機物質(zhì)，一般來說，是發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，與菌種和發(fā)酵條件有關(guān)。雖然在發(fā)酵液預(yù)處理和目標物提取時會除

9、去大部分色素和雜質(zhì)，但仍會有少量殘存物隨目標物一起轉(zhuǎn)移到粗制品或濃縮液中，精制時尤需關(guān)注。熱原也是發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，多是多糖的磷類脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的結(jié)合體，是一種不揮發(fā)的大分子有機物，能夠通過一般過濾器進入濾液，但可被活性炭等吸附，200c200c 加熱 2h2h 或 250c250c 加熱 30min30min 方可徹底破壞，其它方法如強酸、強堿以及強氧化等也可破壞熱原，但鑒于微生物藥物的穩(wěn)定性特點，多數(shù)采用活性炭或二乙胺基乙基葡聚糖凝膠吸附的方法去除熱原，但活性炭應(yīng)事先用酸及無鹽水等適當處理，以除去炭表面的雜質(zhì)，以防止新雜質(zhì)的引入。 注射用無菌原料藥的質(zhì)量要求除應(yīng)具備 一般原料藥的質(zhì)量特征外，還要具備可靠的無菌保證水平、無熱原（細菌內(nèi)毒素）、可見異物和溶液顏色不能超過相關(guān)規(guī)定。由于這類藥物穩(wěn)定性的限制，往往不能采用高溫、高壓的滅菌方式，在精制過程中通常采用過濾除菌、無菌操作等措施保證產(chǎn)品質(zhì)量，需要根據(jù)目標物的具體特點，采用合適的精制工藝，進行滅菌工藝的研究和驗證，并嚴格執(zhí)行 GMGM 要求和根據(jù)相應(yīng)研究制訂的 SOPSOP 小結(jié) 微生物藥物的制備工藝