1、活性氧清除劑對實驗性視神經(jīng)炎作用的研究進展    【摘要】 活性氧簇(ROS)是神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘及血腦屏障破壞的媒介。ROS包括過氧化物及笑氣（NO），由浸潤的炎癥細胞釋放，其代謝產(chǎn)物包括過氧化氫（H2O2）、過（氧化）亞硝酸鹽及羥基。在實驗性視神經(jīng)炎的動物模型中，發(fā)生了神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘及血腦屏障的破壞，這和炎癥細胞釋放的ROS增加有密切關(guān)系，因此活性氧清除劑在保護炎癥中的視神經(jīng)免受氧化應(yīng)激損傷方面顯得尤為重要。本文針對近年來活性氧清除劑對實驗性視神經(jīng)炎的治療研究作一綜述，從而也從病因上對視神經(jīng)炎的治療進行探討。   

2、0;【關(guān)鍵詞】 活性氧簇清除劑視神經(jīng)炎 Progress of the therapy research of the active oxygen scavenger to experimental optic neuritis    Abstract Reactive oxygen species (ROS) are mediators of demyelination and disruption of the blood-brain barrier (BBB). Reactive oxygen species include superoxide

3、and nitric oxide, released by infiltrating inflammatory cells, and their metabolites hydrogen peroxide (H2O2), peroxynitrite, and hydroxyl radical. Demyelination and disruption of the BBB occurs in nerve system of the experimental optic neuritis, which has great relationship with the release of the

4、ROS by inflammatory cell. Thus the active oxygen scavenger plays an important role in the protection of the optic nerve in the inflammation from the injury of oxidative stress. The following article is a review of the therapy research of the active oxygen scavenger on experimental optic neuritis, th

5、ereby trys to find an active therapy of optic neuritis from the pathogenesis.    ? KEYWORDS: reactive oxygen species; scavenger; optic neuritis 0引言    視神經(jīng)炎指視神經(jīng)任何部位發(fā)炎的總稱，臨床上根據(jù)發(fā)病部位不同，分為視盤炎及球后視神經(jīng)炎。局部病灶感染、全身傳染性疾病、代謝障礙和中毒、脫髓鞘病是其四大病因。然而，臨床上約有半數(shù)的病例查不出病因。目前針對視神經(jīng)炎尚無確切有

6、效的治療方法，雖然很多文獻報道大劑量甲基強的松龍沖擊療法對于視神經(jīng)炎有較好療效，但許多有經(jīng)驗的臨床醫(yī)生仍發(fā)現(xiàn)即使采用這種療法，還是有許多病人預(yù)后很差，甚至視力喪失。這是因為對于視神經(jīng)炎詳盡的致病機理不明，目前的治療并未從病因入手，導(dǎo)致療效不確切1。    1實驗性變應(yīng)性腦脊髓炎動物模型    在建立視神經(jīng)炎的動物模型中，常采用實驗性變應(yīng)性腦脊髓炎模型（EAE）。因為視神經(jīng)在EAE及多發(fā)性硬化（MS）中常常被侵襲，且在這兩種疾病中，和髓鞘成型有關(guān)的少突神經(jīng)膠質(zhì)是免疫損傷的主要目標(biāo)。血腦屏障滲透性的改變在EAE誘導(dǎo)的脫

7、髓鞘的病因中扮演了主要角色，同樣的，這種改變也發(fā)生在免疫介導(dǎo)的疾病視神經(jīng)炎及MS上2,3。血腦屏障的破壞導(dǎo)致炎癥細胞及有害因子侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起脫髓鞘作用4，表現(xiàn)為微管和神經(jīng)微絲的水腫變性進而溶解。視神經(jīng)炎患者活檢標(biāo)本的病理檢查發(fā)現(xiàn)的炎癥反應(yīng)及脫髓鞘作用也同樣在EAE病人的視神經(jīng)上被發(fā)現(xiàn)，EAE動物的視覺誘發(fā)電位同視神經(jīng)炎及MS的患者一樣顯示潛伏期增長。核磁共振成像顯示造影增強及脫髓鞘改變在患者及EAE的視神經(jīng)上表現(xiàn)相似。正因為與人類視神經(jīng)炎如此相似，EAE才成為我們理想的模型用于證明我們的猜想，即增強細胞對于炎癥應(yīng)答產(chǎn)生的自由基的防御能力能保護視神經(jīng)抵抗脫髓鞘及血腦屏障的破壞。 

8、   2活性氧簇（ROS）對神經(jīng)系統(tǒng)的破壞作用    ROS包括過氧化物及笑氣（NO），由浸潤的炎癥細胞釋放，其代謝產(chǎn)物包括過氧化氫（H2O2）、過（氧化）亞硝酸鹽及羥基。ROS是神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘及血腦屏障破壞的媒介。為探索急性實驗性變應(yīng)性腦脊髓模型中，ROS與血腦屏障滲透性改變之間的關(guān)系，曾對此模型的視神經(jīng)上的H2O2進行定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在視乳頭，高電子密度的鈰?過氧化氫反應(yīng)產(chǎn)物和血管內(nèi)的粒細胞一同出現(xiàn)，在有髓鞘的球后視神經(jīng)，鈰?過氧化氫反應(yīng)產(chǎn)物出現(xiàn)在血管腔內(nèi)并圍繞著血管外及間質(zhì)聚集的炎癥細胞，反應(yīng)產(chǎn)物還出現(xiàn)在視乳頭及球后視神

9、經(jīng)的鄰近軸索質(zhì)膜及神經(jīng)膠質(zhì)細胞的細胞外間隙。這種鈰?過氧化氫反應(yīng)產(chǎn)物血管周圍及血管內(nèi)的分布揭示H2O2可能在改變EAE血管滲透性的發(fā)病機理上扮演了重要的角色5。對EAE豚鼠有髓鞘的球后視神經(jīng)、無髓鞘的視乳頭及視神經(jīng)鞘上的鈰?過氧化氫反應(yīng)產(chǎn)物進行一系列的定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在抗原致敏后的第3d，鈰?過氧化氫反應(yīng)產(chǎn)物顆粒在有髓鞘的球后視神經(jīng)上達到最大量，但是在抗原致敏714d后減少。在抗原致敏后的第314d，反應(yīng)產(chǎn)物在無髓鞘的視乳頭及視神經(jīng)鞘上聚集。前者說明在有髓鞘的球后視神經(jīng)，H2O2因?qū)λ枨实倪^氧化作用消耗掉，從而導(dǎo)致抗原致敏后714d的脫髓鞘過程。后者說明過氧化氫反應(yīng)產(chǎn)物在無髓鞘的視乳頭及視神

10、經(jīng)鞘上聚集就像對H2O2向球后視神經(jīng)及周圍神經(jīng)彌散提供了一個容器，造成了在EAE及MS中視神經(jīng)的頻繁受侵6。而對EAE豚鼠視乳頭及球后視神經(jīng)的鈰?過氧化氫反應(yīng)產(chǎn)物和血管周圍外滲的免疫金標(biāo)記的血清白蛋白進行共同定位發(fā)現(xiàn)，在血管周圍及鄰近的細胞間隙，免疫金標(biāo)記的血清白蛋白常常和鈰?過氧化氫反應(yīng)產(chǎn)物同時出現(xiàn)，而在血管周圍沒有鈰?過氧化氫反應(yīng)產(chǎn)物及炎癥細胞聚集的地方，免疫金標(biāo)記的血清白蛋白常常出現(xiàn)在血管腔內(nèi)。免疫金標(biāo)記的血清白蛋白常常和鈰?過氧化氫反應(yīng)產(chǎn)物同時出現(xiàn)的血管占61.8%，而兩者沒有同時出現(xiàn)的血管占9.5%，此結(jié)果在統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異，進一步說明在實驗性視神經(jīng)炎中，在破壞的血腦屏障病灶處發(fā)現(xiàn)

11、的H2O2，可能是改變血管滲透性的一個致病因素7。另有報道活性氧笑氣（NO）在神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性脫髓鞘疾病中因為會引起軸索變性，所以成為影響神經(jīng)沖動傳導(dǎo)的重要因素8,9。    3活性氧清除劑對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用    活性氧清除劑包括過氧化氫酶（catalase）及過氧化物歧化酶，后者歧化過氧化物生成過氧化氫，而catalase能將過氧化氫分解成無毒的水及分子氧10。有報道細胞外catalase及過氧化物歧化酶的基因轉(zhuǎn)染改善了大鼠的由抗原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎11。catalase存在于幾乎所有需氧細胞的過氧化物酶體中，因此對

12、很多細胞都有保護功能12。catalase的過度表達保護了紋狀體神經(jīng)元免受大腦局部的短暫性缺血損害13，保護了角膜內(nèi)皮細胞因過氧化氫導(dǎo)致的氧化損傷14，也保護了體外培養(yǎng)的海馬及皮質(zhì)神經(jīng)元的壞死15。而過氧化物歧化酶在轉(zhuǎn)基因動物中的過度表達對局部缺血、神經(jīng)興奮性中毒等引起的神經(jīng)損傷具有保護作用16。在EAE中，內(nèi)源性的活性氧清除劑不足以保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)免受ROS誘導(dǎo)的損傷。外源性給予活性氧清除劑能減少實驗性視神經(jīng)炎中血腦屏障的破壞及神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘作用17。    3.1過氧化氫酶 為研究在實驗性視神經(jīng)炎中catalase對于內(nèi)源性H2O2的解毒作用，將致

13、敏后的豚鼠分為對照組和實驗組，實驗組從致敏后的第3d開始每日腹腔內(nèi)注射聚乙二醇?過氧化氫酶（PEG?catalase）,劑量為12 000U/kg，持續(xù)3d，而后改為1 200U/kg，持續(xù)1wk。而對照組注射相同容積的生理鹽水。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在抗原致敏后7，10，14d分別用對比增強核磁共振測得的興趣部位（ROI）的一種造影增強劑釓-DTPA (Gd-DTPA)增強值顯示，實驗組明顯低于對照組，而T2加權(quán)相的信號強度顯示，只有7， 14d的值實驗組明顯低于對照組。同時，鈰?過氧化氫反應(yīng)產(chǎn)物的定量測定揭示，在視乳頭、視神經(jīng)鞘及球后視神經(jīng)上的鈰顆粒計數(shù)實驗組明顯低于對照組。由此得出結(jié)論：PEG?ca

14、talase減少了視神經(jīng)上的過氧化氫反應(yīng)產(chǎn)物但并不能消除它，而實驗組與對照組Gd-DTPA增強值的顯著性差異提示PEG?catalase降低了H2O2對血腦屏障的破壞程度，T2加權(quán)相的信號強度的顯著差異提示PEG?catalase減少了視神經(jīng)的水腫及脫髓鞘作用17。此研究為將H2O2的解毒作為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性脫髓鞘的一種新方法提供了實驗依據(jù)。    但是上述實驗有其局限性，因為catalase是一種大分子蛋白質(zhì)，即使和聚乙二醇（PEG）結(jié)合后，為延長其半衰期，仍需要每日注射17，而在治療過程中隨著血腦屏障完整性的恢復(fù)，限制了其后注射的高分子量的ca

15、talase進入神經(jīng)系統(tǒng)，視神經(jīng)炎的復(fù)發(fā)部分原因就是因為catalase蛋白無法通過逐漸恢復(fù)完整性的血腦屏障，從而影響了其治療效果。因此，必須找到一種新方法，讓活性氧清除劑的作用能夠得到充分發(fā)揮。Catalase基因編碼的轉(zhuǎn)染幫助我們解決了這個難題。病毒介導(dǎo)的基因傳遞為這種治療性基因的轉(zhuǎn)染帶來了希望。將含有catalase人類基因的腺病毒重組體注射入剛被致敏的SJL/J小鼠的右側(cè)視乳頭，不含有catalase人類基因的腺病毒重組體注射入對側(cè)視乳頭作為對照。1mo后，用catalase免疫金標(biāo)記法，對細胞特異性catalase活性進行定量評估發(fā)現(xiàn)，在實驗組視神經(jīng)的內(nèi)皮組織、少突神經(jīng)膠質(zhì)、星形膠質(zhì)

16、細胞及軸突上，catalase活性增加了大約2倍。而catalase對組織損傷的療效則通過以下幾個指標(biāo)來評價：髓鞘(了解脫髓鞘情況)、視乳頭（了解其水腫情況）、微孔滲透程度，通過外伸的免疫金標(biāo)記的血清白蛋白觀察（了解血腦屏障的破壞情況）、H2O2反應(yīng)產(chǎn)物的定量分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，catalase基因免疫接種減少了38%的脫髓鞘作用，29%的視乳頭水腫，34%的微孔滲透，使血腦屏障破壞降低了64%，使H2O2水平下降了61%。所以，此實驗證實以病毒作為載體的catalase基因轉(zhuǎn)染至少對于EAESJL/J小鼠的視神經(jīng)炎具有確切的治療作用，從而推測這也許能成為治療MS及常常與之共同發(fā)生的

17、視神經(jīng)炎的一種有效方法18。因為用腺病毒重組體接種后蛋白質(zhì)表達的轉(zhuǎn)導(dǎo)相對較慢，需要數(shù)周才能達到最高水平，故用含catalase人類基因的有復(fù)制缺陷的腺病毒再次實驗，發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)表達的轉(zhuǎn)導(dǎo)在接種數(shù)日后即發(fā)生，1mo后，與對照組相比，catalase基因免疫接種減少了30%的脫髓鞘作用，25%的視乳頭水腫，26%的微孔滲透，使血腦屏障破壞降低了61%，使H2O2水平下降了81%。在實驗組視神經(jīng)的內(nèi)皮組織、少突神經(jīng)膠質(zhì)、星形膠質(zhì)細胞及軸突上，catalase活性增加了大約2倍，從而推測對于急性視神經(jīng)炎的患者，利用這種病毒作為基因轉(zhuǎn)染的載體進行治療也許更適用19。   &

18、#160;3.2過氧化物歧化酶 目前在研究活性氧清除劑對實驗性視神經(jīng)炎的治療中，對catalase研究得較多，而對另一種活性氧清除劑過氧化物歧化酶的研究相對較少。大概是因為其作用是歧化過氧化物生成H2O2, H2O2仍然是一種活性氧，因此并未從根本上起到解毒作用，所以過氧化物歧化酶療效可能不如catalase確切。盡管如此，為研究錳-過氧化物歧化酶（Mn-SOD）及銅/鋅-過氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）對EAE中視神經(jīng)的保護作用。Qi等20對EAE豚鼠及正常豚鼠視神經(jīng)上的Mn-SOD、Cu/Zn-SOD及過氧化氫反應(yīng)產(chǎn)物進行對照觀察發(fā)現(xiàn)，在EAE豚鼠的視神經(jīng)切片上，光鏡下顯示Mn-SOD

19、陽性細胞分布在血管周圍，電鏡下顯示只有Mn-SOD免疫金標(biāo)記顆粒出現(xiàn)在視神經(jīng)細胞的線粒體中，而Cu/Zn-SOD免疫金標(biāo)記顆粒在EAE豚鼠及正常豚鼠視神經(jīng)細胞的胞質(zhì)及細胞核中都有分布。相對于正常豚鼠，在EAE豚鼠的視神經(jīng)切片上，小膠質(zhì)細胞/吞噬細胞中免疫金標(biāo)記顆粒在星形膠質(zhì)細胞中升高8倍，在小膠質(zhì)細胞/吞噬細胞中升高13倍。增加的小膠質(zhì)細胞/吞噬細胞中免疫金標(biāo)記顆粒出現(xiàn)在過氧化氫反應(yīng)產(chǎn)物附近，而沒發(fā)現(xiàn)EAE豚鼠的視神經(jīng)中有Cu/Zn-SOD免疫金標(biāo)記顆粒的增加。此結(jié)果說明，在星形膠質(zhì)細胞及小膠質(zhì)細胞/吞噬細胞中Mn-SOD的增加在一定程度上保護了這些細胞免受氧化損傷，而在少突膠質(zhì)細胞及軸突中M

20、n-SOD的低水平表達增加了它們對氧化損傷的易感性從而導(dǎo)致脫髓鞘作用。此后，Qi等21用腺病毒介導(dǎo)的核酶降低小鼠線粒體中的SOD2mRNA , 使其編碼的Mn-SOD表達降低，ROS的水平上升，最終導(dǎo)致視神經(jīng)變性。此實驗進一步證實了超氧化物歧化酶在視神經(jīng)保護中的作用。    4結(jié)語    目前活性氧清除劑對于實驗性視神經(jīng)炎的療效已得到肯定。實驗性變應(yīng)性腦脊髓炎動物模型的建立為我們對于視神經(jīng)炎發(fā)病學(xué)及治療學(xué)的研究提供了可行性。但是因為現(xiàn)在的研究還只局限于動物模型，缺少臨床實驗依據(jù)，活性氧清除劑臨床應(yīng)用及其具體的給藥時

21、機、方式、劑量及藥物療效等還需進一步研究。 【參考文獻】 1 Guy J. New therapies for optic neuropathies: development in experimental models. Curr Opin Ophthalmol ,2000 ;11(6):421-4292 Rovaris M, Mastronardo G, Gasperini C, Prandini F, Yousry TA, Filippi M. MRI evolution of new MS lesions enhancing after different doses of gadol

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