1、瑞利光散射光譜法研究牛血紅蛋白與鏑（）的相互作用 常?？?張莉作者簡介：常希?。?945-），男，教授，博士研究生導(dǎo)師。通訊聯(lián)系人，09318912422(辦) 09313730483(手機)，E-mail:penny515122 王邃 楊芳(蘭州大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)摘 要 在近生理條件pH=7.40時，牛血紅蛋白和Dy（）的光散射強度均十分微弱，當兩者相互作用后，光散射強度急劇增強，最大散射峰分別位于380nm和470nm處，并研究了此反應(yīng)的影響因素和適宜的反應(yīng)條件；在此條件下結(jié)合紫外可見吸收光譜，發(fā)現(xiàn)牛血紅蛋白與Dy（）在不同濃度條件下相互作用，均是定量作用，并有

2、很好的線性關(guān)系，但其光散射光譜和紫外光譜的峰值變化均有不同，我們可以推斷出稀土離子濃度不同，血紅蛋白與Dy（）的作用機理不同，并探討了其作用機理。關(guān)鍵詞 牛血紅蛋白，Dy（），瑞利光散射，紫外可見吸收光譜0引言蛋白質(zhì)是生命體所必不可少的生命基礎(chǔ)物質(zhì)，是生命機體進行各種生理活動的主要承擔(dān)者。蛋白質(zhì)的功能與其結(jié)構(gòu)構(gòu)象密切相關(guān)，有什么樣的結(jié)構(gòu)就有什么樣的功能，反之亦然。蛋白質(zhì)某種功能的激活或維持往往與一些生命元素或有益元素的作用密切相關(guān)，而這些元素大多是金屬元素。研究金屬元素同蛋白質(zhì)的相互作用，特別是金屬元素在近生理環(huán)境條件下同蛋白質(zhì)的相互作用及作用前后蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化，闡明某種金屬元素的作用機理，

3、從而為從分子水平上研究微量元素對人體健康的影響，預(yù)防中毒及環(huán)境污染治理等有重要意義。目前，研究蛋白質(zhì)與金屬離子作用的方法，常見于熒光法1，紫外差光譜法2，微透析取樣法3等。本文運用瑞利光散射這一新技術(shù)4研究了稀土元素鏑（）與牛血紅蛋白相互作用的光譜特征、適宜的反應(yīng)條件和影響因素，并在此反應(yīng)條件下結(jié)合紫外可見吸收光譜研究了稀土元素鏑（）與牛血紅蛋白的相互作用，初步探討了其相互作用的機理。1 實驗部分1.1 儀器與試劑RF-540型熒光分光光度計（日本島津公司）；UV-240型紫外可見分光光度計（日本島津公司）；SHZ-88-1臺式水浴恒溫振蕩器（中國江蘇）；pHS-10C型酸度計（中國蕭山）。

4、牛血紅蛋白（Hb）,上海生物化學(xué)研究所, 配成1mg·ml-1的溶液，置于4的冰箱保存。氧化鏑，用濃鹽酸加熱小心溶解，待蒸發(fā)近干，配制成1 mg·ml-1的儲備液，實驗時稀釋成1.0×10-3 mol·L-1的溶液。緩沖溶液為硼酸-硼砂-NaCl、乙酸-乙酸鈉，常法配置，并在pHS-10C型酸度計上校正其準確的pH值。配制1 mol·L-1和0.1 mol·L-1的NaCl溶液。1.2 實驗方法于10ml的比色管中依次加入1.0×10-3 mol·L-1的Dy（）溶液、pH=7.40的硼酸-硼砂-NaCl的緩沖溶液

5、和一定量的牛血紅蛋白溶液，并用緩沖溶液稀釋至刻度，置于水浴振蕩器中恒溫反應(yīng)一定時間，然后用RF-540熒光儀在300600nmex=em時掃描得瑞利光散射光譜。2 實驗結(jié)果 2.1 光譜特征Hb、Dy（）溶液及Hb和Dy（）混合后的RLS光譜見圖1。由圖可見，Hb和Dy（）的RLS信號很弱，但在Hb溶液中加入一定量的Dy（）后能引起RLS信號急劇增強，并在380nm和470nm處產(chǎn)生較強的RLS信號（圖1）。故出現(xiàn)的增強RLS現(xiàn)象自于Hb和Dy（）的相互作用。在弱堿性條件下，帶正電荷的Dy（）與蛋白質(zhì)中的帶負電荷的部分氨基酸殘基5通過靜電作用，使Dy（）聚集在蛋白質(zhì)分子表面，從而形成大的顆粒，

6、導(dǎo)致劇烈RLS增強。圖1 Hb與Dy（）相互作用的RLS光譜Fig.1 The Rayleigh light scattering (RLS) spectraof Hemoglobin and Dysprosium（） Hb 0.1 mg·ml-1 ; Dy（） 3.0×10-5 mol·L-1; pH=7.40 1. Hb; 2. Dy（）; 3. Hb-Dy（）. 2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化2.2.1 反應(yīng)時間與穩(wěn)定性室溫下，Hb和Dy（）混合在震蕩器中反應(yīng)兩個小時后，RLS在380nm和470nm的峰值基本不變，反應(yīng)趨于穩(wěn)定，且在30mins 穩(wěn)定，隨后稍有下降

7、。實驗控制在2小時為最佳反應(yīng)時間。2.2.2 反應(yīng)溫度的影響 隨著溫度的升高，IRLS降低。這是因為離子締合物之間的靜電引力和疏水作用均是弱結(jié)合力，溫度上升增加了分子的熱運動，從而降低了離子締合的作用力，所以IRLS隨溫度的增加而降低。實驗控制在25下進行。2.2.3 酸度的影響酸度對Hb-Dy（）體系的RLS強度的影響結(jié)果見圖2。由圖2可見，當溶液的pH改變時，Hb-Dy（）體系的RLS強度有所不同。當pH=6.08.0時，Hb-Dy（）體系的RLS強度穩(wěn)定且靈敏度很高。這是因為在pH=6.08.0時血紅蛋白帶有較多的負離子可以與Dy（）很好的結(jié)合，RLS強度較強；而在酸性條件下血紅蛋白帶有

8、正電荷不能與帶有正電荷的Dy（）發(fā)生靜電結(jié)合，RLS強度很??；當pH8.0時，RLS強度同樣很小，這是因為堿性太大不利于蛋白質(zhì)與Dy（）很好的結(jié)合。本文選擇pH=7.4的硼酸-硼砂-NaCl的緩沖溶液控制體系酸度。圖2 酸度對RLS強度的影響Fig.2 Dependence of the RLS intensity on the pH2.2.4 Dy（）濃度的選擇Hb濃度固定在0.1 mg·ml-1，當Dy（）濃度較小時，方法的靈敏度較低，這是由于Hb不能與Dy（）充分結(jié)合。當其濃度在2.0×10-5 6.0×10-5 mol·L-1范圍內(nèi)變化時，靈敏度

9、最大且穩(wěn)定，并且在其范圍內(nèi)Hb與Dy（）結(jié)合的RLS強度隨Dy（）濃度的增大而增強。繼續(xù)增大Dy（）濃度，散射光強度減弱，從而導(dǎo)致靈敏度降低。實驗選擇Dy（）濃度在2.0×10-5 6.0×10-5 mol·L-1 。2.2.5 強電解質(zhì)的影響加入氯化鈉進行離子強度實驗。表明在NaCl濃度低于0.5 mol·L-1時，RLS強度隨離子強度的增加而略有增大，這是由于在蛋白質(zhì)溶液中加入NaCl的濃度很小時，鹽的離子與蛋白質(zhì)分子中的離子和極性基團作用，降低了蛋白質(zhì)分子的活度系數(shù)，使其溶解度增加，牛血紅蛋白分子的四個側(cè)鏈更好的伸展，從而有利于Dy（）在與蛋白質(zhì)側(cè)

10、鏈上的堆積與結(jié)合，導(dǎo)致RLS強度隨離子強度的增加而略有增大；當NaCl濃度大于0.5 mol·L-1時，RLS強度隨離子強度的增加而略有減小，這時由于過高的鹽離子濃度與水這種偶極子作用，破壞了蛋白質(zhì)分子表面的水化層，反而使蛋白質(zhì)的溶解度降低，這樣就降低了Dy（）與蛋白質(zhì)作用的機會6, 7。2.2.6 試劑加入順序的影響因為Dy（）與蛋白質(zhì)作用所形成的締合物的RLS強度與pH有很大關(guān)系。因此，實際的加入順序?qū)喓衔锏腞LS強度也有很大影響。其原因是如果Dy（）先與蛋白質(zhì)在酸性條件下作用，這時Dy（）與蛋白質(zhì)都帶正電荷不能有效結(jié)合，必將導(dǎo)致締合物的RLS強度降低。因此，應(yīng)先用緩沖溶液調(diào)節(jié)

11、酸度，再加蛋白質(zhì)。按照這種順序進行實驗，結(jié)果表明有以下好處：（1）RLS強度最大；（2）反應(yīng)達到平衡的速度快，并且RLS強度穩(wěn)定的時間長。2.2.7 共存物質(zhì)的影響干擾試驗表明，該方法對金屬離子、氨基酸、糖類允許濃度較高，達10-3 mol/L數(shù)量級。2.3 Dy（）與Hb相互作用的光譜圖2.3.1 隨Dy（）濃度變化的Hb-Dy（）體系光譜圖不同濃度的Dy()與Hb在25反應(yīng)兩小時的RLS光譜如圖3（上述實驗表明，此條件為反應(yīng)最佳條件）。由圖3可見，RLS強度（470nm處）隨離子濃度的增大而增強。將散射強度I470nm(I470nm= I I0，I0為Hb的散射強度)對離子濃度作圖（圖4）

12、，發(fā)現(xiàn)有很好的線性關(guān)系，說明Dy()與Hb的結(jié)合反應(yīng)是定量進行的。同時，不同濃度的Dy()與Hb在25反應(yīng)兩小時的紫外可見吸收光譜如圖5。由圖5可見，紫外可見吸收光譜在210nm附近和410nm附近有吸收，通常蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜8在210-250nm有吸收，這由于多種因素引起的,如蛋白質(zhì)中芳香族和其它殘基的吸收及由于某些氫鍵的吸收或者與其它構(gòu)象和螺旋有關(guān)的相互作用；在400nm附近處有一個soret帶，這是血紅素的-*躍遷帶9。在210nm附近處的吸收峰隨著Dy()濃度的增加而增強，并且略有紅移現(xiàn)象，說明Dy()與Hb的部分氨基酸殘基發(fā)生結(jié)合；但是410nm附近處的吸收峰幾乎沒有變化。 圖3

13、 Hb-Dy（）體系的RLS光譜 圖4 RLS強度與Dy（）的線性關(guān)系Fig.3 The Rayleigh light-scattering (RLS) spectra Fig4.The relation between RLS of HemoglobinDysprosium（） spectra intensity and Dy（）Hb. 0.1 mg·ml-1; pH=7.40; Dy（）的濃度：1. 0.0；2. 2.5×10-5 mol·L-1；3. 3.0×10-5 mol·L-1；4. 3.5×10-5 mol·L

14、-1； 5. 4.5×10-5 mol·L-1；6. 5.5×10-5 mol·L-1 .圖5 Hb-Dy（）體系的紫外可見吸收光譜 Fig.5 Absorption spectrum of Hb-Dy（） Hb 0.1 mg·ml-1; pH=7.40; Dy（）的濃度：1. 0.0；2. 2.0×10-5 mol·L-1；3. 4.0×10-5 mol·L-1；4. 6.0×10-5 mol·L-1.2.3.2 隨Hb濃度變化的Hb-Dy（）體系光譜圖不同濃度的Hb與Dy()在25

15、反應(yīng)兩小時的RLS光譜如圖6（上述實驗表明，此條件為反應(yīng)最佳條件）。由圖6可見，在410nm處有一個峰谷，并且其峰谷隨著Hb濃度的增大而降低。將散射強度I410nm(I410nm= I I0 ，I0為Hb的散射強度)對Hb的濃度作圖（圖7），發(fā)現(xiàn)有很好的線性關(guān)系，說明Dy()與Hb的結(jié)合反應(yīng)是定量進行的。同時，不同濃度的Hb與Dy()在25反應(yīng)兩小時的紫外可見吸收光譜如圖8。由圖8可見，紫外可見吸收光譜在210nm附近和410nm附近有吸收，在210nm附近處的吸收峰隨著Hb的濃度的增大而增強，并且出現(xiàn)紅移現(xiàn)象；與上述反應(yīng)不同的是在410nm附近處的吸收也發(fā)生了相應(yīng)的變化，此處的吸收峰隨著Hb

16、濃度的增大而增強。 圖6 Hb-Dy（）體系的RLS光譜 圖7 RLS強度與Hb的線性關(guān)系Fig.6 The Rayleigh light-scattering (RLS) spectra Fig4.The relation between RLS of HemoglobinDysprosium（） spectra intensity and HbDy（）3.0×10-5 mol·L-1 ; pH=7.40; Hb的濃度：1. 0.06 mg·ml-1；2. 0.75 mg·ml-1；3. 0.09 mg·ml-1；4. 0.12 mg

17、3;ml-1； 圖8 Hb-Dy（）體系的紫外可見吸收光譜 Fig.8 Absorption spectrum of Hb-Dy（） Dy（）3.0×10-5 mol·L-1 ; pH=7.40; Hb的濃度：1. 0.0；2. 0.03 mg·ml-1；3. 0.06 mg·ml-1；4. 0.09 mg·ml-1； 5. 0.12 mg·ml-1； 6. 0.15 mg·ml-1.3討論3.1 RLS光譜與吸收光譜圖9為Hb-Dy（）體系的瑞利光散射光譜和紫外吸收光譜。從圖中可以看出，RLS的峰在380nm和470nm處

18、，吸收峰在210nm和410nm處，RLS的兩個峰都位于吸收光譜的峰谷。不像共振光散射光譜，共振光散射光譜的峰位于吸收帶附近，而光散射光譜的峰位于吸收光譜的峰谷，光散射光譜的峰谷位于吸收光譜的吸收峰。這種不同現(xiàn)象可以這樣解釋10：根據(jù)共振光散射理論，強度的增加由于在可見吸收區(qū)溶液散射指數(shù)的增加，所以通常這種增加位于吸收帶附近。在Hb-Dy（）體系中，吸收帶沒有散射強度的增加，吸收峰對應(yīng)于光散射的峰谷，所以不是共振散射現(xiàn)象。光散射光譜的峰和峰谷是由于Hb-Dy（）體系對RLS 強度的吸收。這種吸收不但引起光散射光譜的峰和峰谷，還引起RLS 光譜和吸收光譜的這種對稱關(guān)系。圖9 RLS光譜和吸收光譜

19、Fig.9 RLS spectra and absorption spectra1. RLS spectra of Hb-Dy（） 2. RLS spectra of Hb-Dy（） 3. Absorption spectra of Hb-Dy（）3.2 Dy（）濃度和Hb濃度不同對Hb-Dy（）體系影響的比較 依照上述實驗結(jié)果，列出表一以便比較滴加Dy（）和Hb濃度不同時對瑞利散射光譜和紫外吸收光譜的不同影響。從圖中我們可以清楚地看到兩種情況對光譜的不同影響，可以推測是由于它們作用的機理不同，結(jié)合部位不同導(dǎo)致的。（1）、Dy（）濃度增大，Hb濃度不變時：由于Dy（）濃度增大，促進更多的Dy（

20、）通過靜電作用與蛋白質(zhì)中的帶負電荷的部分氨基酸殘基作用，聚集在蛋白質(zhì)表面，而使微粒尺度增大，表現(xiàn)為散射強度在470nm處的峰隨著Dy（）濃度的不斷增大而成線性關(guān)系增強。（2）Hb濃度增大，Dy（）濃度不變時：由于此時Hb濃度較大，濃度不變的Dy（）要與不斷增加濃度蛋白質(zhì)更好更有效的結(jié)合，就會使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，有可能使其部分氨基酸殘基發(fā)生破壞，暴露出能與Dy（）結(jié)合的部位，與濃度不變的Dy（）發(fā)生作用，從而導(dǎo)致微粒尺度變小，表現(xiàn)為散射強度在410nm處的峰谷隨著Hb濃度增大而降低；同時，與前面相比紫外吸收在410nm處的峰也有明顯變化，在400nm附近處是一個soret帶，這是血紅素的-*躍

21、遷帶，此處峰隨著Hb濃度增大而增強，更加說明了兩種情況的結(jié)合部位不同，作用機理不同。由此可見，稀土離子與蛋白質(zhì)結(jié)合，通過改變蛋白質(zhì)微構(gòu)象或干擾蛋白質(zhì)對其他離子結(jié)合兩種程度的不同而發(fā)揮其劑量效應(yīng)11，影響蛋白質(zhì)的功能；也就是說，稀土離子與蛋白質(zhì)結(jié)合的位點與稀土離子的濃度有關(guān)，濃度不同，直接影響稀土離子與蛋白質(zhì)的作用結(jié)合位點，同時也一定會表現(xiàn)出對生理活性的不同影響，這還有待于進一步的研究。表一、Hb-Dy（）體系的光譜比較濃度變化 散射強度變化 紫外吸收變化Dy（）濃度 470nm處的峰強度隨濃 210nm處的吸收峰隨濃度增大，Hb濃度 度增大而增強，并有很 增大而增強，410nm處的不變。 好的

22、線性關(guān)系。 吸收峰隨濃度增大不變。Hb濃度增大 ， 410nm處的峰谷強度隨濃 210nm處的吸收峰隨濃度Dy（）濃度 度增大而降低，并有很 增大而增強，410nm處的不變。 好的線性關(guān)系。 吸收峰隨濃度增大而增強。 參 考 文 獻1 梁宏，邢本剛，吳慶軒，等. 銅（），鐵（）與人血清白蛋白相互作用的熒光光譜研究. 化學(xué)學(xué)報，1999，57（2）:161165.2 楊斌盛. 銪（）離子與人血清脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的紫外差光譜研究. 化學(xué)學(xué)報，1999，57：503509.3 郭明，孔亮，毛希琴，等. 微透析取樣法研究金屬離子與蛋白質(zhì)的競爭結(jié)合作用. 中國科學(xué)（B輯），2000，31（6）：4995

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