1、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)的研究進(jìn)展 10-10-14 14:48:00 作者：陳金水，倪斌編輯：studa20【摘要】 脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)的治療是醫(yī)學(xué)界的一個(gè)難題，目前還沒有很好的治療方法。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)有促進(jìn)SCI修復(fù)的作用，為治療SCI帶來了新的希望。本文就GDNF對(duì)SCI修復(fù)的作用有關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。 【關(guān)鍵詞】 脊髓損傷；膠質(zhì)細(xì)胞；神經(jīng)營養(yǎng)因子；修復(fù) 【Abstract】 There is no goo

2、d treament for spinal cord injury (SCI).Many experiments have confirmed that glial cell linederived neurotrophic factor(GDNF) can promote injured spinal cord repair.GDNF will be a new method to repair injured spinal cord,especially combined with other methods such as cell transplant,gene therapy.In

3、the review,we summarize the latest research progress on the promotion of spinal cord repairing with glial cell linederived neurotrophic factor. 【Key words】spinal cord injury；glial cell；neurotrophic factor；repair脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重創(chuàng)傷，常由交通、勞動(dòng)和運(yùn)動(dòng)等意外事故造成，有報(bào)道全世界每年每百萬人口有1440人發(fā)生SCI,有些地區(qū)甚

4、至高達(dá)60例。我國的SCI人數(shù)已突破百萬。由于SCI患者治療康復(fù)費(fèi)很高，治療效果欠佳，給患者家庭、社會(huì)帶來巨大的負(fù)擔(dān)。目前SCI治療方法主要有大劑量激素療法、神經(jīng)營養(yǎng)因子治療、基因治療、手術(shù)治療、細(xì)胞移植治療等,但臨床療效仍不滿意。膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)是近年發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factor,NTF),近年動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明GDNF在體內(nèi)和體外都有較強(qiáng)的促進(jìn)交感、感覺、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活和神經(jīng)元軸突再生的作用。本文就其在SCI修復(fù)中的作用作一綜述。1 GDNF及其對(duì)SCI的

5、修復(fù)作用1.1 GDNF及其作用機(jī)制GDNF最初是Lin等1從大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系B49的條件培養(yǎng)液中分離純化獲得。因其結(jié)構(gòu)與所有轉(zhuǎn)移性生長因子(TGF)超家族成員相同，屬于TGF超家族。廣泛分布于全身各類組織2。GDNF是通過與GDNF受體結(jié)合產(chǎn)生作用的，GDNF家族受體復(fù)合物分跨膜酪氨酸激酶蛋白R(shí)et和磷脂酰糖肌醇蛋白（GFR），GFR有GFR1、GFR2、GFR3、GFR4等4型。GFR2是必須的存在受體，如果GFR2缺失，其他的GFR作用很弱3。GFR1是GDNF的高親和力受體，能特異性與GDNF結(jié)合，而GFR1本身無跨膜信號(hào)傳遞的功能，跨膜酪氨酸激酶蛋白R(shí)et是作為激活酪氨酸激酶途徑的激

6、活物，與GFR1和GDNF結(jié)合的形成的復(fù)合物相互作用，引起Ret的磷酸化，激活酪氨酸激酶途徑，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)3-4。最近，Yoong等5發(fā)現(xiàn)GFR1又分GFR1a和 GFR1b兩型，兩型之間有5個(gè)氨基酸的差異，這2個(gè)亞型在人體的不同組織都有表達(dá)。有趣的是，當(dāng)GDNF分泌時(shí)，只表達(dá)GFR1a時(shí)會(huì)激活ERK1/2,Rac1和Cdc42，促進(jìn)神經(jīng)軸突生長。而當(dāng)GFR1a和 GFR1b共同表達(dá)時(shí)，GDNF則抑制神經(jīng)軸突生長。這兩個(gè)GFR1亞型在神經(jīng)營養(yǎng)因子通路上起著不同的作用。1.2 對(duì)運(yùn)動(dòng)性神經(jīng)元的作用GDNF是目前最強(qiáng)的膽堿能運(yùn)動(dòng)神經(jīng)營養(yǎng)因子。有大量的實(shí)驗(yàn)證明：SCI后，GDNF通過轉(zhuǎn)運(yùn)到達(dá)受傷的

7、神經(jīng)元，保護(hù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)元軸突的生長。有報(bào)道6全身或局部使用GDNF治療標(biāo)準(zhǔn)的鼠脊髓壓迫損傷模型，3周后GDNF治療組根據(jù)BBB（Basso,Beattie,Bresnahan）評(píng)分，鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)明顯好于對(duì)照組。使用免疫組化可以在GDNF治療組脊髓神經(jīng)元內(nèi)可以檢測(cè)到標(biāo)記的GDNF,而對(duì)照組未檢測(cè)出。Sharma等7報(bào)道SCI后30分鐘內(nèi)局部應(yīng)用GDNF，減緩血脊髓屏障的崩解，水腫形成及細(xì)胞損傷，減少脊髓神經(jīng)細(xì)胞的程序性死亡，提高運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。Grumbles等8把GDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子移植入SCI處，10周后觀察神經(jīng)纖維爬行范圍，髓鞘軸突數(shù)目，誘發(fā)肌肉活動(dòng)。發(fā)現(xiàn)GDNF可以促

8、進(jìn)神經(jīng)軸突髓鞘化，神經(jīng)纖維的再生及誘發(fā)肌肉活動(dòng)。在標(biāo)準(zhǔn)的脊髓橫斷模型，同樣使用GDNF治療，鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)也明顯好于對(duì)照組在脊髓的腹側(cè)角和損傷斷面均可檢測(cè)GDNF免疫反應(yīng)產(chǎn)物染色，表明神經(jīng)元GDNF表達(dá)對(duì)損傷有正性調(diào)節(jié)作用，而遠(yuǎn)端SCI附近和瘢痕組織未見皮質(zhì)脊髓束再生，表明橫斷兩端脊髓不可能重新建立連接。運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的原因可能是與神經(jīng)營養(yǎng)因子調(diào)節(jié)脊髓通路活性有關(guān)9。Zhang等10實(shí)驗(yàn)證實(shí)了GDNF對(duì)神經(jīng)元有直接的作用，GDNF在體內(nèi)可以增加再生軸突的數(shù)量和使得再生軸突增粗，在體外可以增加背根神經(jīng)節(jié)軸突數(shù)量。潘世鵬等11蛛網(wǎng)膜下腔置管注入GDNF，觀察GDNF對(duì)脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的保護(hù)作用

9、。發(fā)現(xiàn)GDNF組脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活率、膽堿酯酶陽性顆粒面積均比對(duì)照組有明顯提高。Guzen等12在鼠脊髓橫斷模型上，采用坐骨神經(jīng)移植聯(lián)合GDNF方法治療，與單純的坐骨神經(jīng)移植比較，發(fā)現(xiàn)GDNF增加坐骨神經(jīng)移植后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。1.3 對(duì)感覺神經(jīng)元的作用GDNF是體內(nèi)促進(jìn)感覺神經(jīng)元軸突生長發(fā)育的重要因子，在胚胎期可以促進(jìn)感覺神經(jīng)元軸突的發(fā)育，在成熟期可以促進(jìn)軸突的延長13。如果用GDNF長期刺激則可使損傷后再生的軸突返回脊髓并與靶細(xì)胞形成功能性連接，恢復(fù)感覺功能。有實(shí)驗(yàn)表明：SCI后感覺神經(jīng)元GFR1過表達(dá)，在感覺神經(jīng)元GDNF受體過表達(dá)的動(dòng)物對(duì)熱、機(jī)械性等刺激的閾值下降，損傷后的感覺神經(jīng)

10、元對(duì)外來的機(jī)械性刺激更加敏感。GFR1的過表達(dá)使得損傷后的神經(jīng)元對(duì)GDNF更加敏感,從而可以促進(jìn)感覺神經(jīng)元軸突再生14-15。移植GDNF成纖維細(xì)胞到軸突損傷斷端可以促進(jìn)軸突的再生和髓鞘的形成，在SCI部位可以觀察到神經(jīng)元纖維長過斷端，并有髓鞘形成16。Chu等17在感覺神經(jīng)移植治療脊髓根性撕脫傷，預(yù)先將GDNF注射感覺神經(jīng)移植物，與對(duì)照組比較，發(fā)現(xiàn)注射GDNF的實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元存活和軸突再生明顯。損傷部位的對(duì)神經(jīng)纖維數(shù)量與GDNF的濃度有關(guān)，呈“鐘形”濃度相關(guān)，并非線性的。在高濃度和低濃度時(shí)GDNF作用較弱15。盡管成束的神經(jīng)纖維長過斷端，但他們無法完成原來的纖維束的對(duì)接，而只是長在脊髓的表面。

11、因此單增強(qiáng)神經(jīng)元內(nèi)在生長能力是不夠的，脊髓斷端的環(huán)境仍不允許神經(jīng)生長，可能存在一些蛋白聚糖或者抑制因子18。2 GDNF治療SCI的應(yīng)用前景2.1 局部和全身應(yīng)用GDNF治療SCI的途徑常用的有全身和局部給藥。有研究表明13通過全身使用GDNF也可以起到一定的效果，GDNF可以通過循環(huán)系統(tǒng)和軸突轉(zhuǎn)運(yùn)到達(dá)損傷的神經(jīng)元，發(fā)揮作用，但GDNF血腦屏障的通過率低，療效有限。所以越來越多的研究者采用局部使用GDNF，觀察GDNF對(duì)SCI修復(fù)的作用時(shí)局部使用GDNF，作用直接迅速。Adler等19通過鞘內(nèi)注射GDNF可以促進(jìn)生長抑素的表達(dá)，緩解神經(jīng)疼痛，提示可以治療神經(jīng)損傷引起的長期的并發(fā)癥。有研究者使用

12、蛛網(wǎng)膜下腔置管，可以持續(xù)性使用GDNF，效果好于單次局部使用11。Wang等20采用聚乳酸聚乙醇酸復(fù)合物包裹GDNF,然后通過椎管內(nèi)注射到SCI周圍，因?yàn)橛芯廴樗峋垡掖妓釓?fù)合物包裹，GDNF能夠持續(xù)釋放。通過實(shí)驗(yàn)表明此方法能夠保護(hù)神經(jīng)纖維，促進(jìn)SCI的恢復(fù)。在鼠臂叢損傷模型上，Liu等21聯(lián)合微創(chuàng)手術(shù)和局部注射GDNF及NT3治療脊髓背側(cè)神經(jīng)根損傷，通過觀察這種方法可以避免臂叢神經(jīng)損傷所致的感覺缺失。聯(lián)合使用其他神經(jīng)營養(yǎng)因子，可以取得更好的效果。有實(shí)驗(yàn)表明7聯(lián)合使用腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDFN）和GDNF可以明顯減緩脊髓運(yùn)動(dòng)功能的障礙，效果更加明顯優(yōu)于單獨(dú)使用BDNF或GDNF，Madduri

13、等22實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GDNF和神經(jīng)生長因子（NGF）在促進(jìn)神經(jīng)軸突的分支和延長有協(xié)同作用，可能不同的神經(jīng)營養(yǎng)因子之間有協(xié)同作用。2.2 轉(zhuǎn)基因技術(shù)隨著基因技術(shù)的發(fā)展，基因治療技術(shù)應(yīng)用于臨床已成為可能。目前很多實(shí)驗(yàn)表明可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒把GDNF基因轉(zhuǎn)入損傷部位的神經(jīng)細(xì)胞，促使其分泌GDNF，并且可以維持長期分泌GDNF的效果。Tannemaat23和Eggers24使用慢病毒介導(dǎo)的分泌GDNF細(xì)胞，16周后，仍能檢測(cè)到損傷部位表達(dá)分泌大量GDNF,損傷處的神經(jīng)纖維增加，運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，表明慢病毒介導(dǎo)的方法可以長期分泌GDNF,促進(jìn)損傷感覺神經(jīng)元恢復(fù)，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的恢復(fù)和神經(jīng)軸突的再生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)表

14、明，在聯(lián)合顯微外科神經(jīng)移植時(shí)，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的恢復(fù)和神經(jīng)軸突的再生更加明顯。Zhou等25研究SCI后,由單存皰疹病毒介導(dǎo)的GDNF對(duì)鼠胸髓半切損傷修復(fù)的作用,觀察后肢的運(yùn)動(dòng)情況，4周后后肢運(yùn)動(dòng)評(píng)分提高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明單存皰疹病毒有效的轉(zhuǎn)染到脊髓神經(jīng)元細(xì)胞，證實(shí)可以分泌GDNF，促進(jìn)神經(jīng)突的生長。Ansorena等26使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，通過哺乳動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞系分泌GDNF,相比以往通過大腸桿菌等合成的GDNF,具有較高的純度，較低的免疫排斥反應(yīng)，取得療效也較好。2.3 聯(lián)合細(xì)胞移植目前細(xì)胞移植治療SCI是被看好的治療方法之一。但由于移植療效還不是很確切，目前仍處于實(shí)驗(yàn)階段。有研究者27-29使用基因

15、技術(shù)，把GDNF基因?qū)胍浦布?xì)胞，然后移植到脊髓。曹莉等27使用轉(zhuǎn)入GDNF基因的嗅殼細(xì)胞，移植入鼠SCI模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，移植入的帶有GDNF基因的嗅殼細(xì)胞可以增加分泌GDNF，軸突的再生和運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)更加顯著。Lo等28分離純化和增殖培養(yǎng)分泌GDNF的胚胎源性的NIHSwiss小鼠胚細(xì)胞（NIH3T3細(xì)胞）在SCI后2小時(shí)移植入SCI處，可以分泌GDNF,早期保護(hù)脊髓神經(jīng)元，促進(jìn)SCI的修復(fù)。劉曉剛等29對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性神經(jīng)元樣細(xì)胞與控釋膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子聯(lián)合移植后，對(duì)猴損傷脊髓的皮質(zhì)脊髓束髓鞘的修復(fù)效果進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)進(jìn)行干細(xì)胞移植，或同時(shí)給予神經(jīng)營養(yǎng)因子可以促進(jìn)損傷脊髓功能的恢復(fù)，GDNF對(duì)多種神經(jīng)元均具有抗損傷的作用。Zhang等10GDNF聯(lián)合雪旺細(xì)胞移植可以促進(jìn)SCI神經(jīng)軸突再生和髓鞘化。3 GDNF臨床應(yīng)用需要解決的問題 大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)GDNF對(duì)于SCI有著很強(qiáng)的修復(fù)作用，可以保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞，促進(jìn)軸突的再生，但目前GDNF治療SCI仍處于臨床前的實(shí)驗(yàn)階段，要應(yīng)用于臨床應(yīng)用還需要解決以下問題：（1）療效問題，SCI目前臨床上仍沒有確切的治療方法，所有的方法都停留在實(shí)驗(yàn)階段，GDNF促進(jìn)SCI修復(fù)的作用，體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都已經(jīng)證實(shí)，但哺乳動(dòng)物，甚至人體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)壳吧形从袑?shí)驗(yàn)證實(shí)，這需要有進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。單獨(dú)使用GDNF治療SCI療效有