1、新城疫F蛋白基因工程疫苗的研究現(xiàn)狀陶御，葉紅2.(1.上海中信國健藥業(yè)股份有阪公司.抗體筠物國家工程研究中心，上海201203；2.黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安微黃山245021)摘要新城疫(Newcastledisease,NDV)是當(dāng)今世界上最產(chǎn)蟲的禽類傳染病之一，被世界動(dòng)物衛(wèi)生iaiX(OIE)列為必須報(bào)告的傳染痛。同預(yù)防其他偉染病一樣，新城疫的主妾防控手段仍是免疫桂種。V妥白是構(gòu)成新城疫<(NDV)致癌性的分子基礎(chǔ)之一。妹述了國內(nèi)外新城疚F妥白戚因工程戎苗的研究進(jìn)展.關(guān)鍵詞新城疫;F蛋白；基因工程我苗中圖分類號S852.659.5Q789文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文童編號0517-6611(

2、2011)17-10468-02ResearchProgressesonGeneticallyEngineeringVaccineoftheNewcastleDiseaseVirusFusionProteinTAOJingetal(ShanghaiCPGuojianPharmaceuticalCo.,Ltd.,VaccineNationalEngineeringResearchCenter,Shanghai20(203)AbstractNewcastlediseaseisoneoflhemostseriouspoultrydiseases,especiallyinthefieldofpoult

3、ryraising.ItcouldbringgreateconomiclossanditwasdefinedasarankAinfectiousdiseasebytheOIE.NowthemainmethodtopreventNewcastlediseaseisstillthevaccineinoculation.NDVFproteinconstitutedoneofthemolecularbasesofpathogenicity.TheresearchprogressesongeneticallyengineeringvaccineoftheFproteinofNewcastlediseas

4、eviruswereexpounded.KeywordsNewcastledisease；Fprotein；Geneticallyengineeringvaccine新城疫病毒(Newcastaldiseasevirus,NDV)屬副粘病毒科(Paramyxoviridae)、副粘病毒亞科(Paramyxovirinae)、腮腺炎病毒屬(RubulaE),又稱亞洲雞痕病毒、禽副粘病毒I型(APMVJ)。該型可引起雞、火雞、鴕鳥、鴿子、孔雀及其他野鳥等多種成類發(fā)病，被國際獸疫局(theWorldOrganisationforAnimalHealthorOfficeInternationaldes

5、Epizooties,CHE)定為A類傳染病,我國在進(jìn)出口檢疫中也把它定為一類傳染病。NDV是單鏈負(fù)股RNA病毒，整個(gè)基因組全長15586個(gè)核背酸，分子地約為51-57KD。NDV編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，分別是核衣殼蛋白(Nucleocapsidprotein,NP)、磷徵白(Phosphateprotein,P)、基質(zhì)賀白(Matrix,M)、融合蛋白(Fusionprotein,F)、血凝素神經(jīng)疑酸酶(HaemagglutininNeuraminidaseProtein,HN)和高分子量的RNA聚合醒(Largeprotein,L),其順序?yàn)?，一NPPMFHNL5'。HN、F蛋白是構(gòu)成

6、NDV致病性的分子基礎(chǔ)。HN蛋白通過識別、吸附細(xì)胞表面受體從而啟動(dòng)病毒致病性.而F蛋白通過其融合多肽的穿膜作用產(chǎn)生致病作用。囊膜表面的M蛋白則通過抑制宿主細(xì)胞蛋白的合成.進(jìn)一步協(xié)同HN、F蛋白產(chǎn)生致病作用。這3種強(qiáng)白中間F蛋白是構(gòu)成NDV致病性的重要分子。F蛋白屬I型糖蛋白。F蛋白基因編碼一條由553個(gè)氨基酸組成的多肽,包括信號序列(SS)、位于覆基端附近疏水的跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)和一個(gè)由2530個(gè)氨基酸組成的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(CT)。F蛋白非活性的前體F0首先在蛋白胸的作用下裂解為F】和F2,這2個(gè)亞單位之間由二硫鍵連接，序列順序?yàn)镹H2-E2-FI-COOH。F蛋白有3個(gè)強(qiáng)疏水區(qū)，即裂解的N端信

7、號肽序列、C端膜固定點(diǎn)、F1裂解片段在N端的內(nèi)部疏水區(qū)。其中.F2亞單位N端主要起信號肽的功能，翻譯后被修飾剪切掉;F1亞單位的N端保守性很高，是引起融合作用的主要部位;F1亞單位的C端是疏水性跨膜區(qū),是基金項(xiàng)目安橫木擊校自然科學(xué)研允項(xiàng)目(KJ20i0B2ll)o作者簡介陶#(1973-),男，安澈蕪湖人，工程師，從事生物制藥的產(chǎn)業(yè)化研tE-mail:taojing<cpR)-0通訊作者，副教授，博士，從事伽奧與免疫學(xué)研E-mail：yehong2000312o收稿日期2011-03-24融合蛋白與病毒囊膜相結(jié)合的部位。F賀白能否被裂解由NDV毒株本身和宿主細(xì)胞二者的特性共同決定。強(qiáng)毒抹

8、的F蛋白能在多種宿主細(xì)胞內(nèi)被裂解，從而對多種細(xì)胞產(chǎn)生感染力.最終導(dǎo)致全身感染;弱毒株的F蛋白只能在少數(shù)細(xì)胞中被裂解.臨床上表現(xiàn)為局部感染。1重組抗原疫苗重組抗原疫苗是利用DNA重組技術(shù)制備的只含保護(hù)性抗原的純化疫苗。首先將克隆獲得的新城疫病毒保護(hù)性抗原基因引入原核或真核表達(dá)系統(tǒng)中，然后提取所獲得的表達(dá)產(chǎn)品即可制成重組抗原疫苗。該疫苗具有安全性高、副作用少、穩(wěn)定性好、易于批量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。Yang等在轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)成功表達(dá)了NDVF基因，證明基因轉(zhuǎn)染可以應(yīng)用于亞單位疫苗對NDV進(jìn)行預(yù)防。聞曉波等構(gòu)建含有新城疫病毒的M、NP、F、HN4個(gè)基因的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體，獲得了重組桿狀病毒，經(jīng)Westernbl

9、ot檢測，在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中同時(shí)共表達(dá)了新城疫病毒的M、NP、F、HN4個(gè)蛋白，為進(jìn)一步研究新城疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白之間的相互作用以及重組抗原疫苗的研制等奠定了基礎(chǔ)。重組抗原疫苗是新城疫疫苗未來發(fā)展的一個(gè)重要方向。2重組栽體疫苗重組載體疫苗是利用雞痘病毒、火雞皰疹病毒或某些細(xì)菌疫苗株作為載體,插入新城病毒F基因構(gòu)建成的。該疫苗具有常規(guī)減毒疫苗和亞單位疫苗的優(yōu)點(diǎn),通過動(dòng)物接種，在宿主體內(nèi)大量表達(dá)所需的抗原,可成功誘導(dǎo)不同種類型的免疫應(yīng)答，使接種動(dòng)物得到免疫保護(hù)。雞痘病毒的基因組不具有感染性,它在細(xì)胞中的復(fù)制是在病毒自身的酶及其獨(dú)特的調(diào)控信號下進(jìn)行的，它的轉(zhuǎn)錄、翻譯和裝配都發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中,這與真核

10、細(xì)胞的尊因表達(dá)調(diào)控機(jī)理不同。目前此病毒已被廣泛應(yīng)用于重組病毒的制備,是研制禽病重組疫苗的首選載體。韋棟平等句構(gòu)建了共表達(dá)新城疫病毒F基因的重組雞痘病毒,PCR和Southernblot檢測證實(shí)了F基因已插入雞痘病毒的基因組;間接免疫熒光試撿表明，重組病毒能夠正確表達(dá)F蛋白。智海東等用表達(dá)傳染性喉氣管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因的重組雞痘病毒（rFPV2gB2F）制備的多價(jià)疫苗免疫4周齡SPF雞，免疫后分別用新城疫強(qiáng)毒與傳染性喉氣管炎強(qiáng)毒攻擊.免疫保護(hù)率均可達(dá)到80%以上。3 DNA疫苗DNA是利用DNA重組技術(shù)將編碼保護(hù)性抗原的基因克隆到真核表達(dá)載體,獲得的重組體直接免疫機(jī)體，機(jī)體表達(dá)保護(hù)

11、性抗原經(jīng)內(nèi)源性抗原遞呈途徑遞呈給免疫系統(tǒng).誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。與傳統(tǒng)疫苗相比,DNA疫苗具有制備簡單、成本低、穩(wěn)定性好、免疫期長、免疫效果好、便于儲(chǔ)藏和運(yùn)輸?shù)日T優(yōu)點(diǎn)。最早關(guān)于NDV基因免疫的報(bào)道是由Sakaguchi等提出的，他們從弱毒的新城疫病毒D26株克隆到F基因，插入到CMV和雞0-actin（AG）啟動(dòng)子控制之后，對1周齡雞肌肉注射,結(jié)果注射環(huán)狀DNA的雞沒有明顯抗體產(chǎn)生，但注射線性DNA的雞有2/5產(chǎn)生抗體，線性和脂質(zhì)體混合組有4/5產(chǎn)生抗體，抗體在接種后56周穩(wěn)定，在疫苗接種9周后，用強(qiáng)毒攻擊，產(chǎn)生NDV-F抗體的雞得到保護(hù)。潘志明等R將新城疫病毒F融合蛋白

12、的基因克隆入真核表達(dá)載體.然后轉(zhuǎn)化減毒鼠傷寒沙門薇，獲得運(yùn)送DNA疫苗的重組沙門菌，以2x108cfu/只的劑量2次免疫小檢測到針對F蛋白的特異性血清抗體，表明運(yùn)送DNA疫苗的減毒沙門菌系統(tǒng)在機(jī)體內(nèi)能夠成功釋放所攜帶的質(zhì)粒并能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。Loke等°：用新城疫F基因制備的DNA疫苗（pEGFP-F）能夠產(chǎn)生高水平的抗體,對強(qiáng)毒攻擊具有保護(hù)效果。王云峰等研發(fā)的雞新城疫病毒F基因重組表達(dá)載體能夠在真核細(xì)胞中高效表達(dá),其表達(dá)效率比野生型F基因表達(dá)效率高，所表達(dá)的蛋白具有雞新城疫病毒天然蛋白的免疫原性和生物學(xué)活性，并能刺激雞體產(chǎn)生比野生型F基因DNA疫苗更加強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答和細(xì)

13、胞免疫應(yīng)答,使免疫雞獲得100%的抵抗高致病力新城疫病毒株的致死性攻擊，可有效阻止病毒在體內(nèi)的增殖。近年來，在研究DNA疫苗上還考慮了同時(shí)連接細(xì)胞因子和具有免疫調(diào)節(jié)功能的調(diào)控因子等，使得DNA疫苗的臨床保護(hù)率有所提高。4 F蛋白衰位疫苗隨著對抗原分子一級結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象的深入研究，發(fā)現(xiàn)全蛋白基因中含有多種不同的抗原表位、調(diào)控序列、無關(guān)序列和免疫抑制序列。在基因疫苗的設(shè)計(jì)中，為了減少不同免疫優(yōu)勢抗原表位的互相干擾、無關(guān)抑制序列的負(fù)作用，人們將視線轉(zhuǎn)至抗原表位?？乖砦蛔鳛檎T生特異性免疫應(yīng)答的結(jié)構(gòu)和功能的最小單位,能夠區(qū)分抗原的細(xì)微差別。如果選擇優(yōu)勢抗原表位構(gòu)建于合適的載體中，再輔助以必要的側(cè)其序列

14、或免疫調(diào)控序列,免疫機(jī)體可以誘生針對所選抗原表位的特異性免疫應(yīng)答。而且，如果將幾個(gè)優(yōu)勢或特異性抗原表位串聯(lián)結(jié)合在一起，還可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對不同毒株的抗體，獲得最佳的保護(hù)效果。表位疫苗無需分離傳染性病原體、不會(huì)散播病毒，通過選擇最佳和最具免疫保護(hù)潛力的表位所構(gòu)建的表位疫苗不僅可以誘生特異性免疫應(yīng)答,而且免疫效果好，副作用少，同時(shí)多表位的聯(lián)合、修飾或改造在質(zhì)粒水平上操作方便。因此,表位疫苗不僅提供了一種更有效地利用病原體中抗原成分的方法,而且對于抗原變異日趨復(fù)雜的病毒來說是一種非常理想的高效疫苗。有關(guān)多表位基因疫苗的研究,國內(nèi)外已有較多報(bào)道:Emmanuel等將淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV

15、）的T細(xì)胞表位嵌合入狂犬病毒G蛋白中，免疫小鼠后用致死劑量的LCMV進(jìn)行攻毒，其保護(hù)率可達(dá)70%:Xiao等用串聯(lián)的艾滋病毒（HIV）中和表位與載體蛋白偶聯(lián)后，免疫小鼠、兔等可產(chǎn)生微弱的抗體應(yīng)答和CTL反應(yīng)。Gao'i等合成了一個(gè)源于丙型肝炎病毒JHCV）的多表位肽抗原微基因（CMEP），并克隆入GST表達(dá)靠體產(chǎn)生了融合蛋白GST-CMEP。將其與感染HCV病人血清作用發(fā)現(xiàn)其活力可達(dá)75%,與不同自然HVR1毒株的抗CEMP抗體的交叉活力可達(dá)90%。同時(shí),構(gòu)建的HCVDNA疫苗免疫兔后產(chǎn)生抗體.其交叉活力與GST-CMEP融合蛋白相當(dāng)。Memamejadian等網(wǎng)構(gòu)建融合乙肝的丙肝多表

16、位疫苗，采用DNA初免/肽加強(qiáng)剌激方案,產(chǎn)生了強(qiáng)烈的CTL反應(yīng)和IFN分泌細(xì)胞,增強(qiáng)了n】反應(yīng)。隨著單克隆抗體技術(shù)的廣泛應(yīng)用,F蛋白的抗原位點(diǎn)逐漸被認(rèn)識。Toyods等mi應(yīng)用一組針對不同NDVF蛋白的單克隆抗體對抗原結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，認(rèn)為F蛋白含有3個(gè)抗原決定簇，分別位于第72J6I和343位氨基酸殘基位置。72位點(diǎn)（天門冬氛酸,Asp）位于F2親水區(qū),FI和F2之間的二硫鍵上的半胱氨酸殘基有利于這一位點(diǎn)向F1的N末端接近,形成與抑制融合相關(guān)的抗原表位?！?1位點(diǎn)（蘇氨酸,Thr）位于F1的N末端.它所在區(qū)域的親水性較低。343位點(diǎn)（亮氨酸,Leu）位于FI亞單位C末端高度保守的半胱基酸富集區(qū)，

17、在病毒的抗原性及結(jié)構(gòu)和功能上起著重要的作用,是F蛋白主要抗原決定簇。Yu婭等”補(bǔ)研究發(fā)現(xiàn)F蛋白有5個(gè)中和性的抗原表位,Al：72aa,A2：78aa,A3：79aa,A4：157、16】、17O、171aa,A5：343aa,此外還有1個(gè)易變位點(diǎn)378aa。近年來.Collins等偵利用抗F蛋白的單克隆抗體可知NDV34/90株有7個(gè)抗原表位；而HitchnerBl株有5個(gè)交叉抗原表位。另外，隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，應(yīng)用相關(guān)軟件對其抗原表位進(jìn)行綜合分析,而且已證實(shí)某些毒株的預(yù)測抗原位點(diǎn)與已報(bào)道的基本一致,由此可見預(yù)測還是具有相當(dāng)高的準(zhǔn)確度義。將不同的NDV分離株F蛋白序列利用軟件進(jìn)行抗原表位分析

18、比較后，可得出其優(yōu)勢抗原表位。目前.NDV的F蛋白多表位疫苗的研制還需進(jìn)一步深入口，相信會(huì)有廣闊的應(yīng)用前景。綜上所述,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，新城疫基因工程疫苗的研究取得了重大進(jìn)展。相信在不久的將來，既能激發(fā)體液免疫又能激發(fā)細(xì)胞免疫的新型基因工程疫苗必將以其獨(dú)特的優(yōu)勢在控制及消滅新城疫這一烈性傳染病中發(fā)揮重要作用。參考文獻(xiàn)1卡爾尼克BW.禽病學(xué)M.10版北京:中國農(nóng)業(yè)出版社999：32-694.賀東生，秦智峰.劉福安.新瞰病毒系統(tǒng)發(fā)育分析及強(qiáng)屈毒株的撅U瀕JL動(dòng)物阪學(xué)進(jìn)展,2000：27-31.PHTJJ,DASILVAE,GORMANJJ.Determinationofthedisul

19、fidebondamingrmcnl<rfNewcastlediseasevimshemagglutininneuraminidaseJJBioChon,2000,275（9）:M69-M78.4YANGZQ.IJUQQ,PANZM,etal.ExpressiondthefusionglycoproteinofNewcastlediseasevirusmtransgenicriceanditsimmunogenicitytnmiceJ.Vaccine,2007,25（4）:591-598.（下轉(zhuǎn)第10482頁）圖3讀寫器天線模塊Fig.3Reader'santennamodule

20、為250kbps,調(diào)制方式MSK,濾波帶寬540kHz；測試條件:標(biāo)簽采用PCB天線，讀寫器依次采用PCB天線、外接EM天線、外接同軸天線、外接壁掛天線;其測試結(jié)果見表2。由表1、2可知，數(shù)據(jù)傳輸率等參數(shù)設(shè)置相同時(shí),外接天線的通訊距離比PCB天線要遠(yuǎn);3種外接天線比較而言，同軸天線和壁掛天線的通訊距離較遠(yuǎn);500kbps數(shù)據(jù)傳輸率時(shí)通訊距離在28m范圍內(nèi),250kbps數(shù)據(jù)傳輸率時(shí)通訊距離在40m范圍內(nèi)。從硬件成本角度考慮，壁掛天線價(jià)格遠(yuǎn)高于同軸天線，因此在相同通訊距離要求時(shí),選用同軸天線更節(jié)約成本'七測試禽果Table1Theresultsofcomparisongroup1第比較組

21、第2比較組試驗(yàn)組數(shù)Experimentgroup讀寫器天線類型Readerantennatype丟包率PacketratioCRC校驗(yàn)錯(cuò)誤率CRCcorrectmistakes/%RSSI強(qiáng)度RSSIintensitydBm通訊距離，mConununicationdistance丟包率Packetlgratio/%CRC校臉情誤率CRCcorrect成就略,RSSI91度RSSIintensitydBm通訊距離Communicationdistance1PCB天線1.505.0-73.31120.752.0-73.38222外接EM天線0.754.0-69.68160.252.0-71.622

22、83外接同軸天線0.502.5-69.74280.251.5-70.98404外接壁掛天線0.252.0-73.13280.251.5-70.08404結(jié)語利用RFID技術(shù)實(shí)現(xiàn)畜產(chǎn)品養(yǎng)殖的安全管理,可快速、準(zhǔn)確的追蹤,使畜產(chǎn)品生產(chǎn)過程透明化，在食品鏈的源頭有效控制動(dòng)物疫病的發(fā)生、傳播和擴(kuò)散，保障畜產(chǎn)品的質(zhì)量安全。在生豬養(yǎng)殖階段采用該研究設(shè)計(jì)的有源電子標(biāo)簽和讀寫器，可提高豬肉產(chǎn)品的安全性,并對徹底實(shí)現(xiàn)食品的“源頭”追蹤和提供食品安全的透明化管理提供技術(shù)支撐。隨著經(jīng)濟(jì)全球化.精細(xì)農(nóng)業(yè)、精細(xì)養(yǎng)殖時(shí)代的到來，使用基于RFID技術(shù)的畜產(chǎn)品可追溯系統(tǒng)將加速產(chǎn)業(yè)改造并具有較好的社會(huì)效益,該系統(tǒng)的建設(shè)也會(huì)在實(shí)

23、際應(yīng)用中不斷探索并加以完善。參考文獻(xiàn)1J趙金燕，南琳麗,高士爭，等.生豬有源電子標(biāo)簽的設(shè)計(jì)和應(yīng)用研究J.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),20»37(8)：3432-3434.趙金燕晦琳麗，高士爭，等.基FRFID技術(shù)的動(dòng)物食品可溯源系統(tǒng)研究J.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)報(bào),砌,23(4)：528-531.劉學(xué)觀，郭輝萍.微波技術(shù)與天線【M：.西安:西安電子科技大學(xué)出版社QINGX.YANG、.AFoldeddipoleantennaforRFIDJ).AntennasandPropagationSocietyInternationalSymposium,2(X)4(SI)：97-100.4 陳華君，林凡，郭東輝.等

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