1、論著文章編號:1007-8738(200406-0765-04人上皮細胞黏附分子融合蛋白真核表達載體的構建、表達及初步鑒定王春艷1,謝鑫1,宋朝君1,金鎮(zhèn)勛2,歐陽為明1,金伯泉13(1第四軍醫(yī)大學免疫學教研室,陜西西安710032;2解放軍第465醫(yī)院呼吸內(nèi)科,吉林吉林132013收稿日期:2004-06-11;修回日期:2004-08-31基金項目:國家重點基礎研究發(fā)展規(guī)劃(973資助項目(N o.2001C B510004作者簡介:王春艷(1974-,女,吉林省吉林市人,碩士生.3C orresponding authorConstruction and expression of hu

2、man EpCAM eukaryotic expression vectors and identification of their productsWANG Chun 2yan 1,XIE Xin 1,SONG Chao 2jun 1,JINZhen 2xun 2,OUY ANG Wei 2ming 1,JIN Bo 2quan131Department of Immunology ,F ourth Military Medical University ,X i an 710032;2Department of Respiration ,P LA 465th H ospital ,Jil

3、in 132013,ChinaAbstractAIM :T o construct EpCAM eukaryotic expre ssion vectors pIg 2EpCAM and p EGFP 2EpCAM and to expre ss them in COS 7cells.METH ODS :EpCAM cDNA wa s amplified by PCR and then inserted into the pIg and p EGFP vectors re spectively to construct recombinant vectors pIg 2EpCAM and p

4、EGFP 2EpCAM.The two recombinant vectors were transfected into COS 7cells under the mediation of lipo some.The expre ssed EpCAM 2Ig fu 2sion protein wa s detected by We stern blot.The expre ssion of EpCAM 2GFP fusion protein wa s observed under fluore scence micro scope.RESU LTS :DNA sequencing demon

5、strated that EpCAM wa s correctly cloned into the two vectors.The culture supernatant of the pIg 2EpCAM 2transfected COS7cells could bind effectively to mAb against human Ig G Fc.G reen fluore s 2cence distributed evenly in the cytopla sm and nuclei of p EGFP 2transfected COS7cells ,wherea s in p EG

6、FP 2EpCAM transfected COS7cells ,green fluore scence distributed mainly on the sur 2face of the cells.CONC L USION :Two EpCAM eukaryotic ex 2pre ssion vectors have been constructed and expre ssed succe ss 2fully ,which lays the foundation for functional re search of EpCAM and for preparation of mAb

7、to EpCAM.K eyw ords :epithelial cell adhe sion molecule ;eukaryotic expre s 2sion ;enhanced green fluore scence protein摘要目的:構建pIg 2E pC AM 及pEG FP 2E pC AM 真核表達載體,并在C OS7細胞中表達。方法:用PCR 擴增E pC AM cDNA ,酶切后分別與pIg 及pEG FP 兩種載體連接,用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染C OS7細胞。用免疫沉淀法檢測pIg 2E pC AM 的表達產(chǎn)物;用熒光顯微鏡觀察E pC AM 2G FP 的表達。結果:DNA

8、序列測定的結果顯示,pIg 2E pC AM 及pEG FP 2E pC AM 載體的構建正確。免疫沉淀的結果顯示,轉(zhuǎn)染pIg 2E pC AM 的C OS7細胞的培養(yǎng)上清中含有相對分子質(zhì)量(M r 為65000的融合蛋白,該蛋白與抗人IgGFc 段的mAb 具有良好的免疫反應性。熒光顯微鏡觀察可見,轉(zhuǎn)染空載體pEG FP 的C OS7細胞中綠色熒光均勻地分布于胞質(zhì)和胞核;而轉(zhuǎn)染pEG FP 2E pC AM 的C OS7細胞中綠色熒光主要分布于細胞表面。結論:成功地構建了兩種E pC AM 的真核表達載體,并在C OS7細胞中表達,為E pC AM 的功能研究創(chuàng)造了條件,并為制備抗E pC

9、AM 的mAb 提供了免疫原。關鍵詞:上皮細胞黏附分子;真核表達;增強型綠色熒光蛋白中圖分類號:R392.12文獻標識碼:A人上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion m olecule ,E pC AM ,又稱G A733、MH99、AUA1、M OC31和323/A3等,是一種M r 為40000的糖蛋白,表達于上皮來源的細胞表面,在大部分上皮源性癌組織中其表達水平明顯升高1-3。E pC AM 可介導Ca 2+非依賴性同源細胞2細胞間的黏附。體內(nèi)E pC AM的表達與上皮增生有關,與細胞的分化呈負相關4?？笶 pC AM 的低親和力mAb 作為某些腫瘤術后的輔助

10、治療,可使Duke s C 型結腸癌患者7年的生存率增加30%,使殘留癌灶降到最小5。此外,E pC AM 可被用作區(qū)別上皮源性腫瘤與非上皮源性腫瘤的標志蛋白6。目前,在德國已批準將抗E pC AM 的mAb 1721A 用于臨床,其他多個國家尚處于臨床試驗階段7。為了進一步探討高表達人E pC AM 細胞的生物學行為的改變,以及為制備抗E pC AM 的mAb 提供抗原,我們分別構建了E pC AM 真核表達載體pIg 2E p 2C AM 及pEG FP 2E pC AM ,并成功地在哺乳動物細胞C OS7中表達。1材料和方法1.1材料C OS7細胞由本室保存。pIg真核表達載體由英國牛津

11、大學分子醫(yī)學研究所惠贈。pEG FP2N1購自Clontech公司。PCR引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。高保真DNA聚合酶Pyrobest及DNA快速純化試劑盒及連接試劑盒,均購自T aK aRa 公司。大腸桿菌株DH5和MC1061由本室凍存。脂質(zhì)體(Lipofectamine T M2000購自Invitrogen公司。Pro2 tein A2Sepherose4B購自R oche公司。抗人IgG Fc段mAb WT27由本室制備9。HRP2RAM IgG購自DAK O 公司。免疫印跡化學發(fā)光底物購自R oche公司。1.2方法E pC AM以備瞬時轉(zhuǎn)染。2結果2.1pIg2Ep

12、CAM真核表達載體的構建以E pC AM cDNA為模板,用PCR擴增E pC AM胞膜外區(qū)cDNA,大小為864bp(圖1a。將其克隆入pIg表達載體后以Hin d和P st進行雙酶切鑒定,得到目的基因和載體兩條酶切片段,分別與E pC AM胞膜外區(qū)cDNA和載體pIg大小相符(圖1b。測序結果與G enBank中對應的序列相一致 。圖1pIg2E pC AM真核表達載體的構建Fig1Identification of eukary otic expression vector pIg2E pC AMM:D L2000D N A m arker;a:Am plification of ext

13、racellular region of E pC A M cD2 N A by PCR;b:Restriction enzyme digestion analysis of positive clone.2.2pIg 2EpCAM 表達產(chǎn)物的鑒定以pIg 2E pC AM 瞬 時轉(zhuǎn)染C OS7細胞。取細胞培養(yǎng)上清經(jīng)免疫沉淀后,進行S DS 2PAGE 顯示,表達產(chǎn)物為融合蛋白,其相對分子質(zhì)量(M r 為65000,同預期的大小一致。免疫印跡的結果顯示,表達產(chǎn)物與抗人IgG Fc mAb 具有良好的反應性(圖2。 圖2pIg 2E pC AM 表達產(chǎn)物的鑒定Fig 2Identificatio

14、n of the expressed product of pIg 2E pC AMM:Protein marker ;1:S DS 2PAGE analysis of the expressed E pCAM;2:W est 2ern blot analysis of the expressed E pCAM.2.3pEGFP 2EpCAM 表達載體的鑒定以E pC AM cDNA 為模板進行PCR ,擴增出大小為942bp 的全長cDNA 片段(圖3a 。將其克隆入pEG FP 表達載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5株,從陽性菌落提取的質(zhì)粒用Hin d 和P st 進行雙酶切鑒定,得到目的基因和載體

15、兩條酶切片段,分別與E pC AM 全長cDNA 和載體pEG FP 的大小相符(圖3b 。測序結果與G enBank 中對應的序列相一致。 圖3pEG FP 2E pC AM 真核表達載體的構建F ig 3C onstruction of eukary otic ex pression vector pEG FP 2E pC A MM:D L 2000DNA marker ;a :Am plification of E pCAM cDNA by PCR ;b :Restriction enzyme digestion analysis of positive clone.2.4pEGFP 2

16、EpCAM 轉(zhuǎn)染細胞的熒光分布用pEG FP 2E pC AM 和空載體pEG FP 分別瞬時轉(zhuǎn)染C OS7細胞后,在熒光顯微鏡下可見,pEG FP 轉(zhuǎn)染C OS7細胞后綠色熒光均勻地分布于整個細胞(圖4A ;而pEG FP 2E pC AM 轉(zhuǎn)染C OS7后綠色熒光集中分布于細胞膜表面(圖4B 。圖4pEG FP 和pEG FP 2E pC AM 轉(zhuǎn)染C OS7細胞的熒光顯微鏡觀察Fig 4The observation of C OS7cells trans fected with pEG FP andpEG FP 2E pC AM vectors under fluorescence m

17、icroscope (×200A :pEG FP trans fected C OS 7cells ;B :pEG FP 2E pC A M trans fected C OS 7cells.3討論目前,大多數(shù)用于治療的抗腫瘤的mAb 主要是針對腫瘤細胞膜抗原的。E pC AM 表達于大部分上皮來源的細胞上2,由于其在上皮源性癌組織的表達水平明顯升高3,因此,可作為腫瘤免疫治療的候選靶分子。用抗E pC AM 的mAb 作為輔助治療已獲得確切療效,如對進行了根治手術同時用edrecolomab (抗E pC AM mAb 加以輔助治療的Duke s C 期結腸癌患者,經(jīng)過7年跟蹤調(diào)查

18、發(fā)現(xiàn),死亡率降低了32%,復發(fā)率減少了23%5,而且其毒副作用要明顯小于傳統(tǒng)的放療和化療。目前,E pC AM 相應的配體(或受體尚未鑒定,表達膜型E pC AM 的轉(zhuǎn)染細胞將有助于E pC AM 相應配體(或受體的鑒定,從而促進對其分子結構和功能的研究。E pC AM 分子的N 端富含半胱氨酸,可組成多對鏈內(nèi)的二硫鍵,其結構十分復雜。與原核表達系統(tǒng)相比較,真核表達產(chǎn)物可能更接近于天然分子的構象。因此,我們在以往原核表達的基礎上構建了E pC AM 基因的真核表達載體pIg 2E pC AM 及pEG FP 2E pC AM 。經(jīng)鑒定,它們可分別表達可溶型和膜型E pC AM 分子。免疫沉淀檢

19、測表明,pIg 2E pC AM 的真核表達產(chǎn)物具有良好的免疫反應性。PEG FP 2E pC AM 轉(zhuǎn)染C OS7細胞后,其綠色熒光集中表達于細胞膜上,而轉(zhuǎn)染空載體pEG FP 的C OS7細胞,其綠色熒光均勻表達于細胞質(zhì)和胞核。此結果為下一步E pC AM 的基礎和臨床研究創(chuàng)造了有利的條件。參考文獻:1Herlyn M ,S teplewski Z ,Herlyn D ,et al .C olorectal carcinoma 2specific antigen :detection by means of m onoclonal antibodiesJ .Proc Natl AcadSc

20、i USA ,1979,76:1438-1446.2M omburg F ,M oldenhauer G,H mmerling G J ,et al .Immunohistochemicalstudy of the expression of a M r 34000human epithelium 2specific surface glycoprotein in normal and malignant tissuesJ .Cancer Res ,1987,47:2883-2891.3W ent PT ,Lugli A ,M eier S ,et al .Frequent E pC AM p

21、rotein ex pression in human carcinomasJ .Hum Pathol ,2004,35(1:122-128.4Schiechl H ,D ohr G,Eherer A.Immunohistochemical localization andcharacterization of a protein from the bas olateral membrane of rat small in 2testine epithelium using m onoclonal antibody G Z 21J .J Histochem Cy 2tochem ,1986,3

22、4:1659-1665.5Riethm üller G,H olz E ,Schlim ok G,et al .M onoclonal antibody therapyfor resected Dukes C colorectal cancer :seven 2year outcome of a multicen 2ter randomized trial J .J Clin Oncol ,1998,16:1788-1794.6T ellechea O ,Reis JP ,D omingues JC ,et al .M onoclonal antibody BerEP4disting

23、uishes basal 2cell carcinoma from squam ous 2cell carcinoma of the skinJ .Am J Dermatopathol ,1993,15:452-455.7Riethm üller G,Schneider 2G dicke E ,Schlim ok G,et al .Randomisedtrail of m onoclonal antibody for adjuvant therapy of resected Dukes C col 2orectal carcinomaJ .Lancet ,1994,343:1177-

24、1183.8M ellstedt H ,Frodin J E ,M asucci G,et al .The therapeutic use of m ono 2clonal antibodies in colorectal carcinomaJ .Semin Oncol ,1991,18(5:462-477.9戶義,劉雪松,朱勇,等.抗Ig 融合蛋白FC 段單克隆抗體的制備、鑒定與應用研究J .細胞與分子免疫學雜志,2003,19(2:170-172.(上接764頁M r 約為60000處有明顯的新生蛋白表達帶出現(xiàn)(圖1,大小與hBit1融合蛋白相符,而誘導的空載體菌則無此帶.通過凝膠薄層掃描

25、分析,大腸桿菌中hBit1融合蛋白的表達產(chǎn)物占全菌總蛋白量的40%。 圖1hBit1融合蛋白在大腸桿菌中誘導表達的聚丙烯酰氨凝膠電泳M:Low m olecular weight protein marker ;1:N on induced bacteria bearing pG EX 24T 3;2:Induced bacteria bearing pG EX 24T 3;3:N on induced bacteria bearing pG EX 24T 32Bit1;4:Induced bacteria bearing pG EX 24T 32Bit1.2.2抗血清的特異性鑒定將制備的兔抗

26、hBit1抗血清作Western blot 分析,檢查大腸桿菌中表達的hBit1融合蛋白。結果表明,與IPTG 誘導后的全菌蛋白作用時,在M r 約60000處有明顯的顯色印跡(如箭頭所示,同時也有非特異的顯色條帶(圖2A ;用非特異性去除法純化的抗血清再與IPTG 誘導后的全菌蛋白作用時,在M r 約60000處仍然有明顯的顯色印跡(如箭頭所示,大小與hBit1融合蛋白相符(圖2B ,而非特異的顯色條帶明顯減少。3討論bit 1基因在原核和真核生物中保守存在,并與凋亡發(fā)生有關。Bit1從線粒體中釋放至細胞質(zhì)中以后,可以與AES 結合,從而引起不依賴于caspase 的細胞凋亡。胞質(zhì)內(nèi)Bit1濃度的升高可以明顯促進anoikis 的發(fā)生,而其濃度的下降可以降低a