1、海南省地方標(biāo)準(zhǔn)?豆芽中 4-氯苯氧乙酸鈉、 6-芐基腺嘌呤、 2， 4- 滴、赤霉素、萘乙酸殘留量的測(cè)定 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法? 編制說明 征求意見稿一、標(biāo)準(zhǔn)起草的根本情況 包括簡要起草過程、主要起草單位等 海南省地方標(biāo)準(zhǔn)?豆芽中 4- 氯苯氧乙酸鈉、 6-芐基腺嘌呤、 2，4-滴、赤霉素、萘 乙酸殘留量的測(cè)定 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法?編號(hào)：瓊食安地標(biāo) 2021004 號(hào)被列入 2021 年海南省食品平安地方標(biāo)準(zhǔn)工程方案，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心承當(dāng)該標(biāo) 準(zhǔn)的起草工作。按照工作方案要求，起草工作組先后查閱了豆芽的歷史背景資料、相關(guān)的技術(shù)及 標(biāo)準(zhǔn)。期間分別對(duì)豆芽中 4-氯苯氧乙酸鈉、 6-芐基

2、腺嘌呤、 2，4-滴、赤霉素、萘乙酸 殘留量進(jìn)行測(cè)定、驗(yàn)證和總結(jié)。結(jié)合并參照相關(guān)食品平安標(biāo)準(zhǔn)完成初稿。通過屢次征 求相關(guān)專家意見，在初稿的根底上修改完善標(biāo)準(zhǔn)稿件。隨后，標(biāo)準(zhǔn)工作組向質(zhì)檢部門、 食藥監(jiān)、疾控中心等相關(guān)部門發(fā)出征求意見稿 25份，收到 20份回復(fù)，共收到 76條回復(fù) 意見，采納及局部采納共計(jì) 73條，采納率 96.1%。根據(jù)意見和建議，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)初稿進(jìn)行了 修改和完善，完成了工程起草任務(wù)要求。二、標(biāo)準(zhǔn)的主要技術(shù)內(nèi)容及依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作組在參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的根底上，結(jié)合實(shí)際情況，本著標(biāo)準(zhǔn)趨向科學(xué)性、先 進(jìn)性及合理適用的原那么進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)制定工作。制定過程中堅(jiān)持公開透明，廣泛向社會(huì) 公開征求意見和建議

3、。對(duì)收集來的意見進(jìn)行逐一分析，吸取合理化建議反映、表達(dá)到 標(biāo)準(zhǔn)中。1 標(biāo)準(zhǔn)編制的背景及意義豆芽是人民群眾喜愛的一種蔬菜，豆芽生產(chǎn)以傳統(tǒng)的小作坊和家庭自產(chǎn)自銷經(jīng)營 模式為主，為了提高產(chǎn)率，出現(xiàn)生產(chǎn)者在豆芽生產(chǎn)過程中添加 4- 氯苯氧乙酸鈉、 6-芐 基腺嘌呤、 2，4- 滴、赤霉素、萘乙酸等的情況，市場上充滿著這種被稱為“藥水豆芽 的產(chǎn)品，引起消費(fèi)者的嚴(yán)重不安，也使豆芽消費(fèi)量逐年萎縮。由于豆芽是黃豆和綠豆等一些豆類的衍生產(chǎn)物，在行業(yè)監(jiān)管領(lǐng)域，既不屬于食品范疇，也不屬于蔬菜范疇， 因此食品平安法和產(chǎn)品質(zhì)量法都無法監(jiān)管，也缺乏全國性的統(tǒng)一檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和處分標(biāo)準(zhǔn)。 豆芽菜雖小，卻是關(guān)系到普通百姓健康的大事

4、，長期食用在生產(chǎn)過程中使用了 4- 氯苯 氧乙酸鈉、 6- 芐基腺嘌呤、 2，4-滴、赤霉素、萘乙酸等化學(xué)原料的豆芽，對(duì)身體健康 危害很大。 本標(biāo)準(zhǔn)的制定， 可以填補(bǔ)海南省豆芽中 4- 氯苯氧乙酸鈉、 6-芐基腺嘌呤、 2， 4- 滴、赤霉素、萘乙酸殘留檢測(cè)地方標(biāo)準(zhǔn)的空白。因而制定“豆芽中4- 氯苯氧乙酸鈉、6-芐基腺嘌呤、 2，4-滴、赤霉素、萘乙酸殘留量的測(cè)定 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法的標(biāo) 準(zhǔn)具有非常的緊迫性和必要性。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)乙腈作為提取溶劑前處理方法。該方法靈敏度高，重復(fù)性好，完全滿足 豆芽中 4-氯苯氧乙酸鈉、 6-芐基腺嘌呤、 2，4- 滴、赤霉素、萘乙酸殘留量的檢測(cè)。常規(guī)的雙儀器分析方法

5、包括基質(zhì)分散固相萃取法、液 - 液萃取或固相萃取凈化、 濃縮后，用液相色譜/紫外(UV)和液相色譜/二極管陣列(DAD)檢測(cè)。但液相色譜，由 于常規(guī)檢測(cè)器如UV及 DAD對(duì)雙酰肼類農(nóng)藥殘留的靈敏度較低，不能滿足實(shí)際監(jiān)測(cè)等 工作需要。液相色譜 - 質(zhì)譜尤其是串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合了色譜、質(zhì)譜兩者的優(yōu)點(diǎn), 將色譜的高別離性能和質(zhì)譜的高鑒別特點(diǎn)相結(jié)合 , 組成了選擇性強(qiáng)、靈敏度高的現(xiàn)代分析技 術(shù)，并在殘留檢測(cè)領(lǐng)域得到越來越廣泛的應(yīng)用。本標(biāo)準(zhǔn)在研發(fā)出用乙腈提取，液相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)的方法標(biāo)準(zhǔn)。1、通過試驗(yàn)研究確定了用液相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用定性、定量測(cè)定 4-氯苯氧乙酸鈉、 6- 芐基腺嘌呤、 2， 4-

6、滴、赤霉素、萘乙酸殘留量技術(shù)條件， 在豆芽中的定量限均為 0.01 mg / kg 。2、優(yōu)化了提取、確定了操作簡單、快捷的前處理方案，回收率試驗(yàn)說明，本標(biāo)準(zhǔn)確 定檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)滿足 4- 氯苯氧乙酸鈉、 6-芐基腺嘌呤、 2， 4-滴、赤霉素、萘乙酸殘 留分析要求。3、進(jìn)行了針對(duì)不同基質(zhì)的方法適應(yīng)性試驗(yàn)，證實(shí)方法的適用性。4、進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室不同人員比對(duì)、不同實(shí)驗(yàn)室比對(duì)試驗(yàn)，確定了方法的重現(xiàn)性限和再 現(xiàn)性限。5、明確 4-氯苯氧乙酸鈉、 6-芐基腺嘌呤、 2， 4-滴、赤霉素、萘乙酸的基質(zhì)效應(yīng)系數(shù)6、豆芽中 4-氯苯氧乙酸鈉、 6-芐基腺嘌呤、 2， 4-滴、赤霉素、萘乙酸殘留量的測(cè)定 液相色譜質(zhì)

7、譜聯(lián)用法， 本標(biāo)準(zhǔn)涵蓋參數(shù)多，操作簡單，靈敏度高， 滿足 4- 氯苯氧乙酸鈉、6- 芐基腺嘌呤、 2，4- 滴、赤霉素、萘乙酸殘留量事故的鑒定和殘留研究的要求。2 標(biāo)準(zhǔn)的編寫原那么本標(biāo)準(zhǔn)的編寫制定過程中以提高測(cè)試方法的選擇性、精密度、檢測(cè)限、準(zhǔn)確度和 分析效率為總原那么，反映科學(xué)技術(shù)的先進(jìn)成果和先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)。在標(biāo)準(zhǔn)的制定過程中嚴(yán)格遵循國家有關(guān)方針、政策、法規(guī)和規(guī)章，標(biāo)準(zhǔn)的編寫規(guī) 那么及表述按照 GB/T1.1-2021 ?標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)那么 第 1 局部：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)那么的 要求?、GB/T5009.1-2003?食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法 理化局部 總那么?、GB/T 20001.4-2001 ?標(biāo)準(zhǔn)

8、編寫規(guī)那么第 4 局部：化學(xué)分析方法? 、GB/T 6379.1 測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度 正確度與精密度第 1 局部：總那么與定義 GB/T6379.1 -2004 ，ISO 5725-1：1994， IDT、GB/T 6379.2 測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度正確度與精密度第 2局部：確定標(biāo) 準(zhǔn)測(cè)量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的根本方法 GB/T6379.2-2004 ，ISO 5725-2：1994，IDT、 GB/T 8855新鮮水果和蔬菜的取樣方法GB/T 8855-2021 , ISO 874:1980 , IDT的 要求編寫。在標(biāo)準(zhǔn)制定過程中力求做到：技術(shù)內(nèi)容的表達(dá)正確無誤；文字表達(dá)準(zhǔn)確、 簡明、

9、易懂；標(biāo)準(zhǔn)的構(gòu)成嚴(yán)謹(jǐn)合理；內(nèi)容編排、層次劃分等符合邏輯與規(guī)定。3 標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容確實(shí)定3.1 試樣的制備稱量樣品約 1 kg ,切碎后均一化制成勻漿、采用四分法進(jìn)行裝樣。3.2 試樣貯存 試樣應(yīng)放在清潔、結(jié)實(shí)的容器或包裝袋內(nèi),可用聚乙烯瓶或袋。試樣應(yīng)在規(guī)定的保質(zhì) 期內(nèi)進(jìn)行分析,必要時(shí)采用冷凍儲(chǔ)存。試樣應(yīng)有清晰牢固的標(biāo)識(shí)標(biāo)記,防止造成標(biāo)記 的遺失和混亂。3.3 赤霉素、 4-氯苯氧乙酸鈉、 6-芐基腺嘌呤、 2, 4-滴、萘乙酸的性質(zhì) 1赤霉素：是廣泛存在的一類植物激素。其化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于二萜類酸,由四環(huán)骨架 衍生而得?？纱碳と~和芽的生長。的赤霉素類至少有 38 種。赤霉素應(yīng)用于農(nóng)業(yè) 生產(chǎn),在某些方面

10、有較好效果。例如提高無籽葡萄產(chǎn)量,打破馬鈴薯休眠；在釀造啤 酒時(shí)，用GA3來促進(jìn)制備麥芽糖用的大麥種子的萌發(fā)；當(dāng)晚稻遇陰雨低溫而抽穗緩慢 時(shí),用赤霉素處理能促進(jìn)抽穗； 或在雜交水稻制種中調(diào)節(jié)花期以使父母本花期相遇等。 2 4-氯苯氧乙酸：白色棱柱體針狀結(jié)晶。有清香氣味。對(duì)濕敏感。溶于乙醇、丙 酮和苯，微溶于水。熔點(diǎn)155156C 157158C 。低毒，半數(shù)致死量大鼠，經(jīng)口 850mg/kg。有刺激性。主要用作植物生長調(diào)節(jié)劑。36-芐基腺嘌呤：中文別名為2-芐氨基嘌呤，N-芐基腺苷，丙烯酸正丁酯，白 色或類白色晶體，難溶于水，微溶于乙醇，在酸、堿中穩(wěn)定，屬廣譜性植物生長調(diào)節(jié) 劑，可促進(jìn)植物細(xì)胞

11、生長，抑制植物葉綠素的降解，提高氨基酸的含量，延緩葉片衰 老等。42, 4-滴：白色至黃色、晶體粉末、無臭、工業(yè)品略帶酚氣味。具有代表性的合成植物生長素auxin，是一種生長素類似物，簡稱 2， 4-D。在普通的植物生長素定 量法中顯示有高的活性，但在采用植物生長素標(biāo)準(zhǔn)定量法的燕麥伸長試驗(yàn)中，其效頗低。5萘乙酸：白色結(jié)晶，無氣味，易溶于熱水、丙酮、乙醇、乙醚、苯、氯仿、乙酸和堿液，微溶于冷水。萘乙酸系萘類具有生長素類活性的植物生長調(diào)節(jié)劑，由根、莖、葉吸收。萘乙酸廣泛用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、蔬菜、花卉、果樹等領(lǐng)域，誘發(fā)不定根形成，提高樹木扦插成活率；提高座果率，防止采前落果。表1 4-氯苯氧乙酸鈉、6-

12、芐基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素、萘乙酸的相關(guān)性質(zhì)序號(hào)中文名稱英文名稱分子式分子量CAS號(hào)14-氯苯氧乙酸4-ChlorophenoxyaceticacidGH/CIQ186.59122-88-326-芐基腺嘌吟6-benzylam inopurineC12H1N5225.251214-39-73赤霉素Gibberellic acidC19H2Q348.3977-06-542，4- 滴2,4-DC8H6G Q221.0494-75-75萘乙酸1-Naphthylacetic acidG2H0Q186.2186-87-33.4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)使用條件確實(shí)定流動(dòng)相確實(shí)定由于電噴霧質(zhì)譜的電離是在溶液

13、狀態(tài)電離，因此流動(dòng)相的組成和配比不但影響目標(biāo)化合物的色譜行為，還會(huì)影響到目標(biāo)化合物的離子化效率，從而影響靈敏度。對(duì)多種成 分分析測(cè)定多采用梯度洗脫。采用梯度洗脫的方法不僅可以降低基質(zhì)中的雜質(zhì)干擾， 而且提高別離效果。通過比擬甲醇-超純水、乙腈-超純水、甲醇-1 mmol/L乙酸銨和 甲醇-1 mmol/L乙酸銨水-0.1%甲酸水等不同的流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)在流動(dòng)相甲醇 -1 mmol/L 乙酸銨水-0.1%甲酸水梯度洗脫時(shí)，響應(yīng)最高，因此選用流動(dòng)相為甲醇-1 mmol/L乙酸 銨水-0.1%甲酸水的洗脫方法2。表2流動(dòng)相及梯度洗脫條件時(shí)間min流速mL/minA 甲醇%B 1 mmol/L乙酸銨水-0

14、.1%甲酸水%0.000.2510900.600.2545552.000.2560403.500.2570303.600.2545553.700.2510905.000.251090342質(zhì)譜條件確實(shí)定標(biāo)準(zhǔn)品調(diào)諧條件實(shí)驗(yàn)以甲醇-1 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液梯度為基準(zhǔn)流動(dòng) 相，采用“ T三通方式，對(duì)4-氯苯氧乙酸鈉、6-芐基腺嘌呤、2, 4-滴、赤霉素、萘 乙酸的質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，采用負(fù)離子掃描模式，多反響監(jiān)測(cè)色譜圖見附錄C。根本參數(shù)如下：a色譜柱：Ci8柱，100 mm< 2.1 mmx 1.7卩m b流動(dòng)相A為1 mmol/L乙 酸銨水-0.1%甲酸水溶液；B為甲醇；梯度

15、洗脫條件見表2 c柱溫：35C； d進(jìn)樣體 積：5卩L; e離子源類型：ES; f掃描方式：正、負(fù)離子掃描；g檢測(cè)方式：多反 應(yīng)監(jiān)測(cè)；h毛細(xì)管電壓：2.8 kv; i離子源溫度:110 C； j去溶劑氣溫度:350 C； k去 溶劑氣流量:900 L/hr ;1錐孔反吹氣流量:50 L/hr ；m碰撞氣He流速:0.21 mL/min。 優(yōu)化各個(gè)待測(cè)物的碰撞能量，選擇響應(yīng)值最高的兩個(gè)碎片離子分別作為定量和定性離 子，用于選擇反響監(jiān)測(cè)。具體參數(shù)見表 3。序號(hào)中文名稱英文名稱ESI保存時(shí)間min定量離子M/Z定性離子M/Z去簇電壓V碰撞能量V14-氯苯氧乙酸4-chlorphenoxyacetic

16、ESI-2.52185.0/127.1*185.0/127.1* ;187.0/129.02015; 1526-芐基腺嘌呤6-benzylaminopurine+ESI2.91226.3/148.1*226.3/148.1* ;226.3/91.22036; 213赤霉素Gibberellic acid+ESI2.02363.9/329.2*363.9/329.2* ;363.9/239.12020; 1542, 4- 滴2,4-DESI-2.07219.0/161.0*219.0/161.0* ;220.9/162.520; 1610; 185萘乙酸1-Naphthylacet ic aci

17、dESI-2.72185.0/141.1*185.0/141.1*1010注釋:帶*為定量離子，4-氯苯氧乙酸鈉以4-氯苯氧乙酸表示343工作曲線的繪制用空白樣品基質(zhì)溶液配成一系列濃度為 10.00卩g/L、20.00卩g/L、50.00卩g/L、 100.0卩g/L、200.0卩g/L和500.0卩g/L的氯苯氧乙酸鈉、6-芐基腺嘌呤、2, 4-滴、 赤霉素、萘乙酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線。在濃度范圍為10.00舊/L至500卩g/L 之間，響應(yīng)值與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r>0.99，結(jié)果見表4 綠豆芽基質(zhì)為例表4基質(zhì)標(biāo)樣綠豆芽標(biāo)樣校準(zhǔn)曲線名稱參數(shù)校準(zhǔn)曲線4-氯苯氧乙酸

18、鈉y=ax+by=10.61x+23.68r0.99726-芐基腺嘌吟y=ax+by =7.923x+8.132r0.9964赤霉素y=ax+by=2.113x+14.51r0.99522，4- 滴y=ax+by=11.61x+108.6r0.9955萘乙酸y=ax+by= 0.7512x+1.297r0.99793.5樣品前處理方法確實(shí)定關(guān)于豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉、6-芐基腺嘌呤、2, 4-滴、赤霉素、萘乙酸殘留量的測(cè)定 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法，該檢測(cè)方法概述于下表5。本標(biāo)準(zhǔn)在該檢測(cè)的根底上進(jìn)行了條件試驗(yàn)，包括提取試劑確實(shí)定，同時(shí)對(duì)不同基質(zhì)的樣品進(jìn)行了回收率試驗(yàn)，并最終確 定了前處理方案。表5豆

19、芽中4-氯苯氧乙酸鈉、6-芐基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素、萘乙酸殘留量的測(cè)定液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法概要豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉、6-芐基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素、萘乙酸殘留量的測(cè)定液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法備注種類5種/儀器液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜/提取液0.1%甲酸-乙腈/定量限10.00 ®/kg/提取試劑確實(shí)定分別采用0.1%甲酸-乙腈、甲醇、丙酮作提取劑時(shí)，發(fā)現(xiàn)甲醇和丙酮和水層不易別離， 且丙酮較易揮發(fā)，而乙腈通過鹽析法可以較好的將有機(jī)相和水相分層，因此我們選用 0.1%甲酸-乙腈作為提取劑，以綠豆芽為空白基質(zhì)，添加濃度為20.00卩g/kg為例，回收率83.5%-97.1%完全滿足實(shí)驗(yàn)要求。

20、表6 0.1%甲酸-乙腈提取的回收率n=5綠豆芽農(nóng)藥名稱20.00 /kg回收率%RSD (%)4-氯苯氧乙酸鈉93.94.26-芐基腺嘌吟93.74.1赤霉素85.44.22, 4-滴93.13.2萘乙酸83.53.1前處理方法確實(shí)定稱取試樣10 g精確至0.01g于50 mL聚四氟乙烯離心管中，參加10.0 mL提取液后，超聲10 min，濾液收集到裝有1 g3 g氯化鈉的50 mL另外一支聚四氟乙烯離心管中，劇烈震蕩2 min,在室溫下靜置30 min,使乙腈相和水相分層。取1m上清液高速10000rpm/min離心10min,過0.22卩m濾膜，待測(cè)。基質(zhì)效應(yīng)的分析配制一系列溶劑標(biāo)樣，

21、濃度分別為 10.00馮/L、20.00卩g/L、50.00卩g/L、100.0卩g/L、 200.0卩g/L、500.0卩g/L。稱取空白樣品以綠豆芽基質(zhì)為例說明，按照444所述 步驟操作，在空白提取液中添加混合標(biāo)樣，使5種成分混合標(biāo)樣濃度分別為10.00卩g/L、 20.00 卩 g/L、50.00 卩 g/L、100.0 卩 g/L、200.0 卩 g/L和500.0 卩 g/L ;分別以標(biāo)樣濃度 為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。溶劑標(biāo)樣和基質(zhì)標(biāo)樣在在10.00500.0卩g/L 范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.99。基質(zhì)與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值ratio 可反響基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱

22、。5種成分的斜率比值為0.6081.23 數(shù)據(jù)見表8，其中4-氯 苯氧乙酸鈉、6-芐基腺嘌呤和赤霉素基質(zhì)抑制效應(yīng)較強(qiáng)；2, 4-滴和萘乙酸，基質(zhì)增強(qiáng) 效應(yīng)較強(qiáng)，因此根據(jù)基質(zhì)標(biāo)樣計(jì)算豆芽中 4-氯苯氧乙酸鈉、6-芐基腺嘌呤、2, 4-滴、 赤霉素、萘乙酸殘留量。表7溶劑標(biāo)樣校準(zhǔn)曲線和基質(zhì)標(biāo)樣綠豆芽校準(zhǔn)曲線及其斜率比值名稱參數(shù)溶劑標(biāo)樣校準(zhǔn)曲線基質(zhì)標(biāo)校準(zhǔn)曲線4-氯苯氧乙酸鈉y=ax+by =13.47x +62.48y=10.61x+23.68r0.99850.9972ratio0.7886-芐基腺嘌吟y=ax+by =13.04x+3.810y =7.923x+8.132r0.99920.9964

23、ratio0.608赤霉素y=ax+by =2.195x+6.216y=2.113x+14.51r0.99780.9952ratio0.9632, 4-滴y=ax+by =9.445x+82.81y=11.61x+108.6r0.99590.9955ratio1.23萘乙酸y=ax+by = 0.7387x +0.6288y= 0.7512x+1.297r0.99760.9979ratio1.02定性測(cè)定在相同條件下進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)，如果檢出的色譜峰保存時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品相一致，并 且在扣除背景后的樣品譜圖中，所選擇的離子均出現(xiàn)，而且所選擇的離子豐度比與標(biāo) 準(zhǔn)樣品的離子豐度比相一致相對(duì)豐度50%允許土

24、 20%偏差；相對(duì)豐度20%-50% 允許土 25%偏差；相對(duì)豐度10%- 20% 允許土 30%偏差；相對(duì)豐度w 10% 允許土 50% 偏差，那么可判斷樣品中存在這種農(nóng)藥。定量測(cè)定采用外標(biāo)法-標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量測(cè)定，為減少基質(zhì)對(duì)定量測(cè)定的影響，定量應(yīng)采用基質(zhì) 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且保證所測(cè)樣品中農(nóng)藥的相應(yīng)值均在儀器的線性范圍 內(nèi)。平行試驗(yàn)按以上步驟對(duì)同一試樣進(jìn)行平行試驗(yàn)。空白試驗(yàn)除不稱取試樣外，均按上述步驟進(jìn)行。3.6準(zhǔn)確度根據(jù)GB/T 5009.1-2003，準(zhǔn)確度為測(cè)定平均值與真值的相符程度。準(zhǔn)確度的測(cè)定： 將某一穩(wěn)定樣品中參加不同水平量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量作為真值，稱為加標(biāo)樣

25、品，同時(shí)測(cè)定樣品和加標(biāo)樣品，加標(biāo)樣品扣除樣品空白值后與真值的誤差即為該方法的準(zhǔn)確度。按所述的前處理步驟，選取經(jīng)檢測(cè)為空白的植物源性樣品， 進(jìn)行添加濃度分別為10.00、20.00和100.0 舊/kg的回收實(shí)驗(yàn)，每檔濃度進(jìn)行 5個(gè) 平行的操作。具體數(shù)據(jù)見表9-表11。表8不同添加濃度的回收率n=5綠豆芽基質(zhì)名稱10.00 g/kg20.00 g/kg100.0 g/kg回收率%RSD ( %)回收率%RSD (%)回收率%RSD ( %)4-氯苯氧乙酸鈉83.44.693.94.285.11.16-芐基腺嘌吟93.53.393.74.194.34.4赤霉素82.42.085.44.282.63

26、.42，4- 滴86.15.193.13.294.33.9萘乙酸83.33.483.53.182.33.9表9不同添加濃度的回收率n=5黃豆芽基質(zhì)名稱10.00 c/kg20.00 g/kg100.0 g/kg回收率%RSD (%)回收率%RSD (%)回收率%RSD (%)4-氯苯氧乙酸鈉83.04.390.45.684.24.66-芐基腺嘌吟92.53.290.26.595.84.3赤霉素81.42.887.35.582.96.42，4-滴85.14.190.25.694.63.4萘乙酸82.73.684.74.285.24.1表10不同添加濃度的回收率n=5黑豆芽基質(zhì)名稱10.00 g/

27、kg20.00 g/kg100.0 g/kg回收率%RSD ( %)回收率%RSD (%)回收率%RSD (%)4-氯苯氧乙酸鈉81.54.884.96.085.04.26-芐基腺嘌吟92.63.793.74.193.55.0赤霉素82.74.484.66.182.92.52，4-滴89.73.293.53.591.16.1萘乙酸82.35.683.1r 8.083.45.93.7定量限LOQ定量限是指可以進(jìn)行準(zhǔn)確定性和定量測(cè)定的最低水平，在該水平下得到的準(zhǔn)確度應(yīng)滿足表12的要求。添加標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度得到的信噪比一般為10。表11不同添加水平對(duì)回收率的要求添加水平mg/kg范圍%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差%

28、切.00150120< 35> 0.001 衛(wèi)0160120< 30> 0.01 衛(wèi)170120< 20> 0.1 蘭170110< 15> 170110< 10根據(jù)3倍信噪比S/N計(jì)算豆芽中5種農(nóng)藥的檢出限LOD為0.93.0血/kg ,根據(jù)10倍信噪比確定的定量限LOQ均為0.93.0血/kg，為配合實(shí)際樣品和定量準(zhǔn)確， 本試驗(yàn)從添加水平3.0馮/kg 直添加到10.00 pg/kg，通過添加回收率試驗(yàn)和準(zhǔn)確 定量的要求，發(fā)現(xiàn)在添加濃度在10.00 舊/kg，回收率和準(zhǔn)確度才符合定量限的要求， 因此，5種農(nóng)藥的定量限在植物源食品中的定量

29、限均為 10.00 pg/kg，詳見表13。表12 5種農(nóng)藥的定量限序號(hào)名稱定量限LOQ /g/kg14-氯苯氧乙酸鈉10.0026-芐基腺嘌吟10.003赤霉素10.0042，4-滴10.005萘乙酸10.003.8方法重現(xiàn)性和再現(xiàn)性為考察不同檢測(cè)人員對(duì)方法的重復(fù)性，本實(shí)驗(yàn)室3位檢測(cè)人員分別進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，添加濃度為20.00 pg/kg。檢測(cè)結(jié)果如表13所示：名稱A (n=3)B (n=3)C (n=3)平均值/g/kg標(biāo)準(zhǔn)偏差 /g/kg相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差%平均值/g/kg標(biāo)準(zhǔn)偏差/g/kg相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差%平均值/g/kg標(biāo)準(zhǔn)偏差gg/kg相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差%4-氯苯氧乙酸鈉18.11.15.917

30、.80.94.917.51.16.06-芐基腺嘌吟18.80.31.618.60.31.719.11.05.5赤霉素17.20.42.016.81.06.016.40.52.82, 4-滴18.61.26.518.41.16.018.71.15.7萘乙酸16.91.05.616.90.42.117.21.27.0據(jù)表13,以參數(shù)6-芐基腺嘌呤，三個(gè)人員檢測(cè)的數(shù)值為例進(jìn)行分析，平均值相對(duì)差異較大的為A和C,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差相對(duì)差異較大的為 A和Co對(duì)A和C這一組，進(jìn)行F檢驗(yàn),2 2=11. 816Sa(5.5)2SC2F. 0.10 匚匚由 a =0.10 及 df1 =3-仁2, df2 =3-仁

31、2,查得 1勺=口皿5 =19.0，因?yàn)?F v1"1.。5，故認(rèn)為T A=c C, A和C總體方差無顯著性差異。當(dāng)總體方差相等的情況下，進(jìn)行t檢驗(yàn):2 2，其中S2(nX -1)Sx (ny-1)Synx +ny -2t 001t 0-01可得，t =0.073，對(duì)于 a =0.01 及 df =3+3-2 = 4,查得 1 月=4.604，因?yàn)?t v 1勺故A和C無顯著性差異。因此A B C檢測(cè)結(jié)果無顯著性差異。同上述計(jì)算過程，對(duì)每個(gè)參數(shù)的測(cè)定值進(jìn)行顯著性差異比擬，結(jié)果三組數(shù)據(jù)的每個(gè)參數(shù)的結(jié)果均無顯著性差異。說明此方法進(jìn)行樣品分析結(jié)果是可靠的。按照GB/T 6379.2-200

32、4?測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度第2局部 確定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性?的根本方法，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間方法的重復(fù)性和再現(xiàn)性評(píng)價(jià)。參與復(fù)核 的實(shí)驗(yàn)室為4家。以綠豆芽中添加濃度為20.00 / kg 6-芐基腺嘌呤為例的計(jì)算過程 見表14和表15,統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表16至表20o表14實(shí)驗(yàn)室間方法的重復(fù)性和再現(xiàn)性評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)結(jié)果以綠豆芽中添加濃度為 20.00皿kg 6-芐基腺嘌吟為例實(shí)驗(yàn)室編號(hào)實(shí)驗(yàn)室名稱平均值Yj重復(fù)m方差Si21農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心成都19.05651.05 X 102大連市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心18.96054.68 X 103海南省食品檢驗(yàn)測(cè)試中心19.1205-13.97 X 104中

33、國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)測(cè)試中心19.42053.20 X 10-2檢驗(yàn)單元方差柯克倫檢驗(yàn)值C0.719柯克倫檢驗(yàn)臨界值0.721 ( 1 %)0.629 (5 %)判定正常值檢驗(yàn)單元平均值格拉布斯檢驗(yàn)值Gp1.403格拉布斯臨界值1.496 (1 %)1.481 (5 %)判定正常值格拉布斯檢驗(yàn)值G1.804格拉布斯臨界值1.496 (1 %)1.481 (5 %)判定正常值比對(duì)試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果參加的實(shí)驗(yàn)室數(shù)目，p4可接受的數(shù)目4平均值(gg/kg) , m=TT318.969Sr2= T5T3 - P-73.91 X 102SL2=頁-T_& XT£P TT3(P )T3 T4-85

34、.05 X 10Sr2= Sr2+ Sl2-73.40 X 10重復(fù)性，r=2.8腭0.002再現(xiàn)性，R=2.8jg0.002T1= BiiYi0.379T2= BliYi20.00720T3= Bn20T4= Bii2100T5= B>-1)S2-66.25X 10表15綠豆芽中離群值檢驗(yàn)匯總統(tǒng)計(jì)表汎統(tǒng)計(jì)量參數(shù)X添加濃度10.00 g/ kg20.00 / kg100.0/ kgCGpG1CGpG1CGpG14-氯苯氧乙 酸鈉0.8441.994*1.063*0.6091.7071.562*0.8751.4441.978*6-芐基腺嘌吟1.011.7878*2.214*0.7191.4

35、02*1.804*1.311.998*2.279*赤霉素0.9722.112*0.932*0.9822.001*1.890*1.141.242*1.902*2，4-滴0.9491.780*1.548*1.13*1.431*2.185*0.8121.428*2.113*萘乙酸0.9722.112*0.932*0.6221.941*1.402*1.981.458*1.820*備注：C:代表柯克倫檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量，Gp , Gi :代表格拉布斯檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量?？驴藗悪z驗(yàn)臨界值 0.721( 1 %)和0.629 (5 %)格拉布斯臨界值：1.496 (1 %)和1.481 (5 %)表16黃豆芽中離群值檢驗(yàn)匯

36、總統(tǒng)計(jì)表統(tǒng)計(jì)量參數(shù)x添加濃度10.00 / kg20.00 / kg100.0/ kgCGpG1CGpG1CGpG14-氯苯氧乙酸鈉0.8502.019*1.2390.8091.687*2.485*1.011.05*2.657*6-芐基腺嘌吟0.9732.110*2.133*1.59*1.362*2.330*1.451.924*2.482*赤霉素1.052.33*1.094*1.08*2.649*1.543*2.582.379*2.132*2, 4- 滴0.8171.656*1.475*1.41*1.667*2.762*1.201.890*2.051*萘乙酸0.6421.736*1.386*0

37、.851*2.060*1.402*1.181.627*1.624*備注：C :代表柯克倫檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量，Gp , G1 :代表格拉布斯檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量。 柯克倫檢驗(yàn)臨界值 0.721( 1 %)和0.629 (5 %)。格拉布斯臨界值：1.496 (1 %)和1.481 (5 %)表17黑豆芽中離群值檢驗(yàn)匯總統(tǒng)計(jì)表統(tǒng)計(jì)量添加濃度、10.00 g/ kg20.00 g/kg100.0 g/kg參數(shù)CGpG1CGpG1CGpG14-氯苯氧乙 酸鈉0.9291.565*1.795*0.782*1.213*2.385*1.801.367*2.412*6-芐基腺嘌吟1.042.304*2.352*0.927*1.

38、723*1.647*1.421.753*2.826*赤霉素0.7991.733*1.501*0.888*2.462*1.712*1.031.327*2.020*2，4-滴0.7741.971*2.028*0.593*1.580*1.582*1.731.587*2.243*萘乙酸1.201.891*1.3951.05*1.333*2.581*1.632.180*1.977*備注：C :代表柯克倫檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量，Gp , Gi :代表格拉布斯檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量。 柯克倫檢驗(yàn)臨界值 0.721( 1 %)和0.629 (5 %)。格拉布斯臨界值：1.496 (1 %)和1.481 (5 %)表18實(shí)驗(yàn)室間方法的

39、重復(fù)性和再現(xiàn)性評(píng)價(jià)匯總統(tǒng)計(jì)結(jié)果(綠豆芽中)、統(tǒng)計(jì)量參數(shù)'、添加濃度10.00 / kg20.00 / kg100.0 g/kgrRrRrR4-氯苯氧乙 酸鈉0.0090.0080.0020.0020.0020.0076-芐基腺嘌吟0.0100.0090.0020.0020.0060.006赤霉素0.0010.0010.0010.0010.0050.0062, 4-滴0.0010.0010.0010.0010.0010.002萘乙酸0.0010.0010.0010.0020.0060.007備注：r為重復(fù)性限，R為再現(xiàn)性限，計(jì)算公式見表 24和表25注：r是置信概率為95%時(shí)該方法的重復(fù)

40、性；R是置信概率為95%時(shí)該方法的再現(xiàn)性。表19實(shí)驗(yàn)室間方法的重復(fù)性和再現(xiàn)性評(píng)價(jià)匯總統(tǒng)計(jì)結(jié)果(黃豆芽中)'、統(tǒng)計(jì)量參數(shù)、V、添加濃度10.00 g/kg20.00 g/ kg100.0 g kgrRrRrR4-氯苯氧乙酸 鈉0.0020.0010.0020.0020.0060.0106-芐基腺嘌吟0.0010.0010.0020.0020.0060.006赤霉素0.0010.0010.0020.0020.0080.0082，4-滴0.0010.0010.0020.0020.0060.006萘乙酸0.0010.0010.0020.0020.0070.008備注：r為重復(fù)性限，R為再現(xiàn)性限

41、，計(jì)算公式見表 24和表25注：r是置信概率為95%時(shí)該方法的重復(fù)性；R是置信概率為95%時(shí)該方法的再現(xiàn)性。統(tǒng)計(jì)量參數(shù)、添加濃度10.00 g/kg20.00 g/ kg100.0 g kgrRrRrR4-氯苯氧乙酸 鈉0.0010.0010.0020.0030.0060.0106-芐基腺嘌吟0.0010.0010.0020.0020.0070.007赤霉素0.0010.0010.0020.0020.0040.0062，4-滴0.0010.0010.0010.0010.0080.009萘乙酸0.0010.0010.0020.0020.0070.008備注：r為重復(fù)性限，R為再現(xiàn)性限，計(jì)算公式見

42、表 24和表25注：r是置信概率為95%時(shí)該方法的重復(fù)性；R是置信概率為95%時(shí)該方法的再現(xiàn)性。附錄A :實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)添加回收實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)1、農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心成都比對(duì)結(jié)果表21 5種農(nóng)藥在綠豆芽中10.00 厲/kg濃度水平添加結(jié)果序號(hào)名稱1#0kg2#©kg3# pg/kg4# p/kg5# pg/kg平均值舊/kg相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差%14-氯苯氧乙 酸鈉8.458.028.428.498.768.433.126-芐基腺嘌吟9.019.458.429.329.469.134.83赤霉素8.368.068.498.808.288.403.342, 4-滴8.698.198.688

43、.878.788.643.15萘乙酸8.468.068.628.798.438.473.2表22 5種農(nóng)藥在綠豆芽中20.00 厲/kg濃度水平添加結(jié)果序號(hào)名稱1# p/kg2#©kg3# pg/kg4# p/kg5# pg/kg平均值舊/kg相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差%14-氯苯氧乙 酸鈉19.018.818.618.419.018.71.326-芐基腺嘌吟19.119.519.018.619.019.11.73赤霉素17.016.917.117.216.817.01.042, 4-滴18.618.218.518.818.518.51.05萘乙酸16.517.516.416.917.316.92

44、.8表23 5種農(nóng)藥在綠豆芽中100.0 ®/kg濃度水平添加結(jié)果序號(hào)名稱1# p/kg2#©kg3# pg/kg4# p/kg5# pg/kg平均值舊/kg相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差%14-氯苯氧乙 酸鈉89.589.889.789.389.589.50.226-芐基腺嘌吟96.495.795.694.597.495.91.13赤霉素86.185.085.485.386.185.60.642, 4-滴93.295.695.494.896.595.11.35萘乙酸87.385.686.786.485.786.30.8表24 5種農(nóng)藥在黃豆芽中10.00 ®/kg濃度水平添加結(jié)果

45、序號(hào)名稱1# p/kg2#©kg3# pg/kg4# p/kg5# pg/kg平均值舊/kg相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差%14-氯苯氧乙 酸鈉8.428.128.528.398.698.432.526-芐基腺嘌吟9.269.118.528.678.768.863.53赤霉素8.138.148.778.288.368.343.142, 4-滴8.538.098.768.158.718.453.75萘乙酸8.168.238.728.098.338.313.0序號(hào)名稱1#0kg2#©kg3# pg/kg4# p/kg5# pg/kg平均值舊/kg相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差%14-氯苯氧乙 酸鈉18.418.7

46、18.818.518.218.51.326-芐基腺嘌吟19.119.518.718.519.219.02.03赤霉素17.216.817.016.917.117.00.942，4-滴18.418.718.118.518.418.41.35萘乙酸16.217.416.217.216.916.83.5表26 5種農(nóng)藥在黃豆芽中100.0 ®/kg濃度水平添加結(jié)果序號(hào)名稱1# p/kg2#©kg3# pg/kg4# p/kg5# pg/kg平均值舊/kg相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差%14-氯苯氧乙 酸鈉89.488.588.188.289.688.80.726-芐基腺嘌吟95.297.794.5

47、96.296.696.01.33赤霉素87.186.188.588.389.287.81.442, 4-滴92.495.696.394.494.494.61.65萘乙酸88.187.085.185.085.086.01.7表27 5種農(nóng)藥在黑豆芽中10.00 ®/kg濃度水平添加結(jié)果序號(hào)名稱1# p/kg2#©kg3# pg/kg4# p/kg5# pg/kg平均值舊/kg相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差%14-氯苯氧乙 酸鈉8.128.168.548.698.718.443.426-芐基腺嘌吟9.119.128.598.889.439.033.53赤霉素8.098.248.768.678.3

48、48.423.442, 4-滴8.698.618.298.598.468.531.85萘乙酸8.318.258.768.688.268.452.9表28 5種農(nóng)藥在黑豆芽中20.00 ®/kg濃度水平添加結(jié)果序號(hào)名稱1# p/kg2#©kg3# pg/kg4# p/kg5# pg/kg平均值舊/kg相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差%14-氯苯氧乙 酸鈉18.418.118.818.418.218.41.626-芐基腺嘌吟19.319.118.919.418.619.11.83赤霉素17.917.618.117.618.217.91.542, 4-滴18.418.718.218.418.918.51.55萘乙酸16.316.817.617.416.716.93.3序號(hào)名稱1#0kg2#©kg3# pg/kg4# p/kg5# pg/