1、CAT.NO.11668-027Size:CAT.NO.11668-019Size:ml4C儲存（不要凍存）說明：LipofectaminTM2000是核酸（DNARNA轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的一個(gè)專用的試劑盒，其有如下優(yōu)點(diǎn)：對各種細(xì)胞及細(xì)胞板（如96孔板）都有高的轉(zhuǎn)染效率，在的細(xì)胞系數(shù)據(jù)庫中有各種細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功的實(shí)例。在含有或是不含有血清的培養(yǎng)基中，DNA-LipofectaminTM2000復(fù)合物能夠直接加給細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染之后不需要除去復(fù)合物以及添加或是更換培養(yǎng)液，但在培養(yǎng)4-6小時(shí)后需要除去復(fù)合物。關(guān)于轉(zhuǎn)染的一些重要建議：1 .不要用即將要介紹白轉(zhuǎn)染程序進(jìn)行RNAi的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。在上有轉(zhuǎn)染步驟，登陸后點(diǎn)

2、擊說明。2 .對于大多數(shù)細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染復(fù)合物中DNA（wg）與LipofectamineTM2000（“）的比例在1:2到1:3之間，最好達(dá)到最優(yōu)化的比例。注意：在混合之前，我們建議用Opti-MEMI低血清培養(yǎng)基（Cat:）（reducedserummedium）稀釋LipofectamineT2000和DNA.3 .為了實(shí)現(xiàn)高的轉(zhuǎn)染效率、高的目的基因表達(dá)水平以及低水平細(xì)胞毒效應(yīng)，受體細(xì)胞最好達(dá)到高的濃度：在轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞的培養(yǎng)液的混濁度建議為90%-95嘛最優(yōu)化混濁度。此外，在實(shí)驗(yàn)過程中保證相同的接種條件。4 .為避免細(xì)胞死亡，在培養(yǎng)基中不要加抗生素。5 .由于一些無血清復(fù)合物（如CD239S

3、FMII、VP-SFM會抑制陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，因此有必要檢測一下無血清培養(yǎng)基和LipofectamineTM2000的相容性。轉(zhuǎn)染步驟（用于DNA）：按照如下步驟在24孔板中轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞對于其它種類細(xì)胞板請參照轉(zhuǎn)染量度標(biāo)準(zhǔn)步驟中均按照一個(gè)細(xì)胞孔的量給出質(zhì)量和體積1 .貼壁細(xì)胞：轉(zhuǎn)染的前一天，在500“無抗生素培養(yǎng)基中接種X105個(gè)細(xì)胞，以保證在轉(zhuǎn)染時(shí)候細(xì)胞的混濁度達(dá)到90%-95%懸浮細(xì)胞：在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染混合物時(shí)，每500“無抗生素培養(yǎng)基中含有細(xì)胞數(shù)量為4-8X1052 .對于每個(gè)轉(zhuǎn)染樣品，按下面的方法準(zhǔn)備：a、在501無血清Opti-MEMI低血清培養(yǎng)基中（或是其它無血清培養(yǎng)基）稀釋D

4、NA并輕輕混勻b、使用前輕輕混勻LipofectamineTM2000，然后取相應(yīng)的量稀釋在Opti-MEM培養(yǎng)基中室溫下靜置5分鐘注意：要在30分鐘內(nèi)混合LipofectamineTM2000和DNA的稀釋液c、室溫下靜置5分鐘后，混合LipofectamineTM2000和DNA的稀釋液（總體積為100W1）。輕輕混勻并在室溫下靜置20分鐘（溶液混合后可能會看上去渾濁）。注意：混合物在室溫下的6個(gè)小時(shí)內(nèi)不會失效3 .細(xì)胞板的每個(gè)孔中加混合液100“，并前后輕輕搖動細(xì)胞板使混合液與孔中的培養(yǎng)液混勻4 .檢測目的基因的表達(dá)，f#況前，細(xì)胞于37CCQ培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-48小時(shí)。此時(shí)不需要改變培

5、養(yǎng)基，但4-6小時(shí)后也許需要更換.5 .對于固定的細(xì)胞系：轉(zhuǎn)染24小時(shí)后將細(xì)胞以1：10（或更高的稀釋度）稀釋度轉(zhuǎn)移到新鮮的生長培養(yǎng)基中如果需要的話，在以后的培養(yǎng)中可以在培養(yǎng)基中加入選擇培養(yǎng)基對于懸浮的細(xì)胞系：轉(zhuǎn)染4小時(shí)后，如果需要，加入PM用口/或PHA以提高CVMB動子的活性并促進(jìn)基因表達(dá)轉(zhuǎn)染量度標(biāo)準(zhǔn)：在不同的組織培養(yǎng)板中轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，根據(jù)相對的表面積，按比例加入LipofectamineTM2000、細(xì)胞、和培養(yǎng)基，具體情況剪下表。在自動、高產(chǎn)率體系中，建議96孔板的轉(zhuǎn)染混合物的體積為506。注意：操作時(shí)，可以直接將細(xì)胞混入車t染混合物中進(jìn)行快速的96孔板轉(zhuǎn)染。在細(xì)胞板中準(zhǔn)備好轉(zhuǎn)染混合物，

6、然后直接加入說明中正常1006體積時(shí)濃度的2倍濃度細(xì)胞培養(yǎng)液。在轉(zhuǎn)染混合液存在情況下，細(xì)胞可以正常的貼壁。培養(yǎng)容器每個(gè)孔的表面積(cm2)相對于24孔板的表面積鋪板培養(yǎng)基體積DNAgg)/培養(yǎng)基LipofectamineTM2000(科l)/培養(yǎng)基(wl)96孔板1006ag/25心lal/25心l24孔板215006ag/50心lal/50心l12孔板421mlag/100心l6/100”35mnml1052mlag/250心l106/250pl6孔板1052ml科g/250科l106/250pl60mm板20105ml科g/206/10cm板603015ml24pg/606/注意：表面積是根據(jù)培養(yǎng)容器的實(shí)際測量得到，但也會根據(jù)容器生產(chǎn)商的不同發(fā)生變化。優(yōu)化轉(zhuǎn)染：為了得到高的轉(zhuǎn)染效率和低的無用副效應(yīng)，通過改變細(xì)胞濃度、DNA