1、酶基因的隨機(jī)突變1引言:酶分子的定向進(jìn)化簡(jiǎn)稱為酶定向進(jìn)化，是模擬自然進(jìn)化進(jìn)程（隨機(jī)突變和自然選擇），在體外進(jìn)行酶基因的人工隨機(jī)突變,成立突變基因文庫(kù)，在人工操縱條件的特殊環(huán)境下，定向選擇取得具有優(yōu)良催化特性的酶的突變體的技術(shù)進(jìn)程。酶定向進(jìn)化的大體進(jìn)程包括隨機(jī)突變，構(gòu)建基因文庫(kù)，定向選擇等步驟。酶的定向進(jìn)化的第一步是在體外人為的進(jìn)行積陰德隨機(jī)突變，以取得豐碩多樣的突變基因，為后續(xù)的定向選擇打下基礎(chǔ)。酶基因的體外隨機(jī)突變第一要取得酶基因，然后在體外進(jìn)行隨機(jī)突變，體外隨機(jī)突變的技術(shù)多種多樣，要緊有易錯(cuò)PCR技術(shù)，DNA重排技術(shù)，基因家族重排技術(shù)等。這些突變方式的目標(biāo)都是為了取得豐碩多樣的突變基因,可

2、是各自采納的進(jìn)化策略和偏重點(diǎn)有所不同，易錯(cuò)PCR技術(shù)是從酶的單一基因動(dòng)身，通過(guò)改變聚合酶鏈?zhǔn)椒从车臈l件，如改變底物和鎂離子濃度等，在PCR擴(kuò)增進(jìn)程中，使堿基配對(duì)錯(cuò)誤而引發(fā)基因突變；DNA重排技術(shù)是從兩條以上的正突變基因動(dòng)身，通過(guò)酶切和不加引物的PCR擴(kuò)增,使DNA堿基序列從頭排布而引發(fā)的基因突變；基因家族重排技術(shù)是從基因家族的多個(gè)同源基因動(dòng)身，通過(guò)酶切和不加引物的PCR擴(kuò)增等，使DNA的堿基序列從頭排布而引發(fā)基因突變。這些隨機(jī)突變方式能夠單獨(dú)利用，也能夠聯(lián)合利用，交叉進(jìn)行，通過(guò)次實(shí)驗(yàn)，反復(fù)挑選，就能夠夠完成對(duì)酶的定向進(jìn)化。2酶基因的隨機(jī)突變經(jīng)常使用技術(shù):，易錯(cuò)PCR技術(shù)：在DNA聚合酶的作用下

3、進(jìn)行體外DNA擴(kuò)增的一種分子生物學(xué)技術(shù)，簡(jiǎn)稱為PCR技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒从臣夹g(shù)的大體進(jìn)程包括雙鏈DNA的變性，引物與單鏈DNA退火結(jié)合，引物延伸三個(gè)步驟。,雙鏈DNA的解鏈：將待擴(kuò)增的模板DNA升溫至8595度，使DNA雙鏈之間的氫鍵斷開(kāi)，解離為單鏈DNA。,引物與單鏈DNA退火結(jié)合：?jiǎn)捂淒NA在溫度慢慢降低至5070度是，會(huì)與堿基互補(bǔ)的引物結(jié)合形成雙鏈，長(zhǎng)度為1530個(gè)堿基。,引物延伸：引物結(jié)合后，將溫度升高至7075度，在DNA聚合酶的作用下，以引物為起點(diǎn)，以4種脫氧核甘三磷酸為底物，以目標(biāo)DNA為模板，依照堿基配對(duì)原那么，由5一端向3一端的方向延伸，而進(jìn)行DNA復(fù)制。以上三個(gè)步驟反復(fù)進(jìn)行，

4、一樣通過(guò)30次循環(huán)，即可使目的基因擴(kuò)增幾百萬(wàn)倍。在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過(guò)改變反映條件，增加堿基配對(duì)錯(cuò)誤的顯現(xiàn)頻率,就成為易錯(cuò)PCR技術(shù)。DNA重組技術(shù)：乂稱為DNA改組技術(shù)，是從正突變基因文庫(kù)中分離取得的同源DNA,勇酶切割成隨機(jī)片段，通過(guò)不加引物的多次PCR循環(huán)，是DNA的堿基序列從頭排布而引發(fā)基因突變的技術(shù)進(jìn)程°DNA重排技術(shù)是1994年由斯田沫等第一次提出，他們通過(guò)該技術(shù)對(duì)B內(nèi)酰胺酶進(jìn)行了定向進(jìn)化研究，是該酶的催化效率提高了32000倍。DNA重排技術(shù)的大體進(jìn)程如下圖：tn卜,DNA隨機(jī)片段1無(wú)引物PCR陶切木突變技從閃雨川（反舞訓(xùn)h）vI構(gòu)厚袋吧日SXA）.一.I1_負(fù)突少

5、鼠囚一£二娜a_1口欠支馬內(nèi)卜”地化間/Ti圖83I）NAi”|拉術(shù)的J兒本過(guò)松/基因家族重排技術(shù)：乂稱為基因家族改組技術(shù)，是從基因家族的假設(shè)干同源基因動(dòng)身，勇酶切割成隨機(jī)片段，通過(guò)不加引物的多次PCR技術(shù)，使DNA的堿基序列發(fā)生從頭排布而引發(fā)基因突變的技術(shù)進(jìn)程。基因家族重排技術(shù)的要緊進(jìn)程如下圖：I基因家族專干同源基因I酶切DNA軻片無(wú)引物PCR酶切基因重組（反復(fù)進(jìn)行）突變基因文庫(kù)負(fù)突變基因一"篩選IH正突變基因FT進(jìn)化酶I3酶基因隨機(jī)突變的應(yīng)用：酶基因的隨機(jī)突變時(shí)酶定向進(jìn)化的第一步，因此專門重要。定向進(jìn)化技術(shù)要緊用于酶的改性方面，如提高酶催化的效率，增強(qiáng)酶的穩(wěn)固性，改變酶的底物特異性等方面。提高酶的催化效率：P內(nèi)酰胺酶是一種催化B內(nèi)酰胺水解的酶，在該酶的作用下，可使B內(nèi)酰胺類抗生素的內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)被破壞而失去活性。1994年，斯田沫等通過(guò)DNA重排技術(shù)進(jìn)行定向進(jìn)化，使B內(nèi)酰胺酶的催化效率提高32000倍，大大提高了突變菌株關(guān)于抗生素的耐受能力。增加酶的穩(wěn)固性：。一淀粉酶是一種在食物、醫(yī)藥、輕工等領(lǐng)域有普遍用途的催化淀粉水解的工業(yè)用酶，喬耶等通過(guò)定向進(jìn)化，取得熱穩(wěn)固性大大提高的Q淀粉酶，該酶在90度的半衰期