1、EST文庫(kù)構(gòu)建原理和應(yīng)用文庫(kù)構(gòu)建原理和應(yīng)用目錄：目錄： EST概述概述 EST序列原理序列原理 EST產(chǎn)生原因產(chǎn)生原因 EST的應(yīng)用的應(yīng)用 展望展望EST概述： 表達(dá)序列表達(dá)序列標(biāo)簽標(biāo)簽（expressed sequence tags,ESTs）是指從不同組織來(lái)源的）是指從不同組織來(lái)源的cDNA序列，指的是一組序列，指的是一組cDNA的部分序列的部分序列,一般一般長(zhǎng)度為長(zhǎng)度為150500bp,是由大規(guī)模隨機(jī)挑取的是由大規(guī)模隨機(jī)挑取的cDNA克隆測(cè)序得到的組織或細(xì)胞基因組的克隆測(cè)序得到的組織或細(xì)胞基因組的表達(dá)序列標(biāo)簽。表達(dá)序列標(biāo)簽。一個(gè)一個(gè)EST代表生物某一時(shí)代表生物某一時(shí)期的某種組織或細(xì)胞的一

2、個(gè)期的某種組織或細(xì)胞的一個(gè)表達(dá)表達(dá)基因基因。注：注：cDNA 為具有與某為具有與某RNA鏈呈互補(bǔ)的鏈呈互補(bǔ)的堿基堿基序列的序列的單單鏈鏈DNA即即complementary DNA之縮寫，之縮寫，或此或此DNA鏈與具有與之互補(bǔ)的堿基序列的鏈與具有與之互補(bǔ)的堿基序列的DNA鏈所形成的鏈所形成的DNA雙鏈。雙鏈。 原理原理 ESTs（Expressed Sequence tags ） 是從已建好的是從已建好的cDNA庫(kù)中隨機(jī)取出一個(gè)克隆，從庫(kù)中隨機(jī)取出一個(gè)克隆，從5末端或末端或3 末端對(duì)插入的末端對(duì)插入的cDNA片段進(jìn)行一輪單向自動(dòng)測(cè)序，所獲得片段進(jìn)行一輪單向自動(dòng)測(cè)序，所獲得 的約的約150500

3、bp的一段的一段cDNA序列。序列。EST產(chǎn)生的原因：產(chǎn)生的原因： 1990年人類基因組計(jì)劃年人類基因組計(jì)劃 (HGP)及其它模式生物的及其它模式生物的基因組計(jì)劃實(shí)施以來(lái)基因組計(jì)劃實(shí)施以來(lái) ，人們對(duì)生物體生命現(xiàn)象的，人們對(duì)生物體生命現(xiàn)象的研究已不僅僅局限于局部某個(gè)或幾個(gè)基研究已不僅僅局限于局部某個(gè)或幾個(gè)基 因，而是因，而是把目光投向整個(gè)基因組把目光投向整個(gè)基因組 ，從整體水平去考慮基因，從整體水平去考慮基因的存在的存在 ，結(jié)構(gòu)與功能，以及基因之，結(jié)構(gòu)與功能，以及基因之 間的相互關(guān)間的相互關(guān)系等系等.而如何而如何快速、高效地從基因組中獲取生物學(xué)快速、高效地從基因組中獲取生物學(xué)信息信息，已成為一個(gè)

4、急迫而富有挑戰(zhàn)性的課題擺在，已成為一個(gè)急迫而富有挑戰(zhàn)性的課題擺在我們面前我們面前 。 EST技術(shù)就是基于這種認(rèn)識(shí)而發(fā)展起技術(shù)就是基于這種認(rèn)識(shí)而發(fā)展起來(lái)來(lái) 的，并成為基因組學(xué)研究的一個(gè)強(qiáng)有力的工具。的，并成為基因組學(xué)研究的一個(gè)強(qiáng)有力的工具。 表達(dá)序列標(biāo)簽表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tags,ESTs）EST的制備程序的制備程序 某特異組織某特異組織總總RNA的提取的提取Poly（A）+mRNAcDNA兩兩端加接頭端加接頭與與zap載體連接、包載體連接、包裝、裂解裝、裂解轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染E.coli的的XLIBlue細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞，進(jìn)行in vivo excision用含有用含有x

5、gal和和IPTG的氨芐平板篩的氨芐平板篩選選隨機(jī)挑取白色菌落隨機(jī)挑取白色菌落提取質(zhì)粒提取質(zhì)粒M13活活T7通用引物測(cè)序。通用引物測(cè)序。 EST技術(shù)流程技術(shù)流程應(yīng)用應(yīng)用 EST作為作為表達(dá)基因所在區(qū)域的分子標(biāo)簽表達(dá)基因所在區(qū)域的分子標(biāo)簽因因編碼編碼DNA 序列序列高度保守高度保守而具有而具有自身的特殊自身的特殊性質(zhì)性質(zhì)，與來(lái)自非表達(dá)序列的標(biāo)記（如，與來(lái)自非表達(dá)序列的標(biāo)記（如AFLP、RAPD、SSR 等）等） 相比更可能穿越家系與相比更可能穿越家系與種的限制，因此種的限制，因此EST標(biāo)記在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)標(biāo)記在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種間比較基因組連鎖圖和比較質(zhì)量性的物種間比較基因組連鎖圖和比較質(zhì)量性狀信

6、息是特別有用。同樣，對(duì)于一個(gè)狀信息是特別有用。同樣，對(duì)于一個(gè)DNA 序列缺乏的目標(biāo)物種，來(lái)源于其他物種的序列缺乏的目標(biāo)物種，來(lái)源于其他物種的EST也能用于該物種有益基因的遺傳作圖，也能用于該物種有益基因的遺傳作圖，加速物種間相關(guān)信息的迅速轉(zhuǎn)化。加速物種間相關(guān)信息的迅速轉(zhuǎn)化。 應(yīng)用應(yīng)用 構(gòu)建基因組的遺傳圖譜與物理圖譜構(gòu)建基因組的遺傳圖譜與物理圖譜(作為作為分子標(biāo)記分子標(biāo)記)；作為探針用于放射性雜交；作為探針用于放射性雜交； 用于定位克??；用于定位克??； (“電子電子”基因克隆基因克隆) 借以尋找新的基因；借以尋找新的基因； 用于研究基因的功能；用于研究基因的功能； 促進(jìn)基因芯片的發(fā)展促進(jìn)基因芯片

7、的發(fā)展;用于研究生物群體多態(tài)性；用于研究生物群體多態(tài)性；有助于藥物的開發(fā)、品種的改良；有助于藥物的開發(fā)、品種的改良； 構(gòu)建基因組的遺傳圖譜與物理圖譜構(gòu)建基因組的遺傳圖譜與物理圖譜(作為分子標(biāo)記作為分子標(biāo)記)； ESTs在多種以基因?yàn)榛A(chǔ)的人和植物基因組物理圖譜構(gòu)在多種以基因?yàn)榛A(chǔ)的人和植物基因組物理圖譜構(gòu)建中扮演著重要角色。建中扮演著重要角色。在這一應(yīng)用中，從在這一應(yīng)用中，從ESTs發(fā)展起來(lái)發(fā)展起來(lái)的的PCR或雜交分析可用來(lái)識(shí)別或雜交分析可用來(lái)識(shí)別YACs、BACs或其他含有或其他含有大片段插入克隆類型的載體，它們是大片段插入克隆類型的載體，它們是構(gòu)建基因組物理圖譜構(gòu)建基因組物理圖譜的基礎(chǔ)的基

8、礎(chǔ)，將，將EST與基因組物理圖譜相比較即可辨認(rèn)出含有與基因組物理圖譜相比較即可辨認(rèn)出含有剩余基因序列的基因組區(qū)間，包括調(diào)控基因表達(dá)的剩余基因序列的基因組區(qū)間，包括調(diào)控基因表達(dá)的DNA控控制元件，對(duì)這些元件進(jìn)行分析就有可能獲得對(duì)基因功能的制元件，對(duì)這些元件進(jìn)行分析就有可能獲得對(duì)基因功能的詳細(xì)了解。物理圖譜與遺傳圖譜間的相互參考，形成一個(gè)詳細(xì)了解。物理圖譜與遺傳圖譜間的相互參考，形成一個(gè)用途更廣泛的綜合資源，獲得這張綜合圖譜后，研究人員用途更廣泛的綜合資源，獲得這張綜合圖譜后，研究人員就可以孟德爾遺傳特征為基礎(chǔ)，將相關(guān)基因定位在基因組就可以孟德爾遺傳特征為基礎(chǔ)，將相關(guān)基因定位在基因組區(qū)間上，并且通

9、過(guò)查詢以區(qū)間上，并且通過(guò)查詢以ESTs為基礎(chǔ)的藶圖譜，即可獲為基礎(chǔ)的藶圖譜，即可獲得這一區(qū)間上所有基因的名單。該綜合資源用途的大小取得這一區(qū)間上所有基因的名單。該綜合資源用途的大小取決于決于EST數(shù)據(jù)庫(kù)中擁有的基因數(shù)目。目前人和小鼠數(shù)據(jù)庫(kù)中擁有的基因數(shù)目。目前人和小鼠EST的的不斷擴(kuò)充使其應(yīng)用更加廣泛和便捷。不斷擴(kuò)充使其應(yīng)用更加廣泛和便捷。 日本血吸蟲（中國(guó)大陸株）表達(dá)基因的分離和序日本血吸蟲（中國(guó)大陸株）表達(dá)基因的分離和序列測(cè)定列測(cè)定1事例：事例：材料材料 日本血吸蟲（中國(guó)大陸株）成蟲日本血吸蟲（中國(guó)大陸株）成蟲cDNA文庫(kù)由南京醫(yī)科大學(xué)陳淑文庫(kù)由南京醫(yī)科大學(xué)陳淑貞教授構(gòu)建。該文庫(kù)系采用定向

10、貞教授構(gòu)建。該文庫(kù)系采用定向克隆構(gòu)建于克隆構(gòu)建于 gt 11/1090系統(tǒng)中，系統(tǒng)中，所構(gòu)建的基因表達(dá)文庫(kù)容量為所構(gòu)建的基因表達(dá)文庫(kù)容量為3.13106重重設(shè)計(jì)并合成引物設(shè)計(jì)并合成引物單個(gè)重組噬菌體的隨機(jī)挑選單個(gè)重組噬菌體的隨機(jī)挑選重組克隆重組克隆PCR直接序列分析直接序列分析ESTs的同源性分析的同源性分析方法：結(jié)果：結(jié)果：重組克隆的分離及重組克隆的分離及P C R鑒定鑒定事例：事例： 楊梅果實(shí)楊梅果實(shí)EST文庫(kù)構(gòu)建文庫(kù)構(gòu)建2楊梅楊梅cDNA克隆測(cè)序圖克隆測(cè)序圖 作為作為探針探針用于用于放射放射性雜性雜交；交； 用于定位克??；用于定位克??； 序列后得到相應(yīng)克隆的序列后得到相應(yīng)克隆的EST(3

11、1) ESTs與與“電子電子”基因克??；基因克??； 利用計(jì)算機(jī)來(lái)協(xié)助克隆基因，稱為利用計(jì)算機(jī)來(lái)協(xié)助克隆基因，稱為“電子電子”基因克隆（基因克?。╯illcon cloning），是與定位），是與定位克隆、定位候選克隆策略并列的方法之一，克隆、定位候選克隆策略并列的方法之一，即采用生物信息學(xué)的方法延伸即采用生物信息學(xué)的方法延伸EST序列，序列，以獲得基因部分乃至全長(zhǎng)的以獲得基因部分乃至全長(zhǎng)的cDNA序列。序列。EST數(shù)據(jù)庫(kù)的迅速擴(kuò)張，已經(jīng)并將繼續(xù)導(dǎo)數(shù)據(jù)庫(kù)的迅速擴(kuò)張，已經(jīng)并將繼續(xù)導(dǎo)致識(shí)別與克隆新基因策略發(fā)生革命性變化。致識(shí)別與克隆新基因策略發(fā)生革命性變化。 (4) 借以尋找新的基因；借以尋找新的基因；(5) 用于研究基因的功能；用于研究基因的功能；衰老葉片組織的衰老葉片組織的EST序列分析序列分析 (6) 促進(jìn)基因芯片的發(fā)展促進(jìn)基因芯片的發(fā)展 (7) 用于研究生物群體多態(tài)性；用于研究生物群體多態(tài)性； (8) 有助于藥物的開發(fā)、品種的有助于藥物的開發(fā)、品種的改良；改良； 人類基因組計(jì)劃已進(jìn)入后基因組時(shí)人類基因組計(jì)劃已進(jìn)入后基因組時(shí)代，基因組學(xué)的研究從結(jié)構(gòu)基因組代，基因組學(xué)的研究從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)過(guò)渡到功能基因組學(xué)，利用結(jié)構(gòu)學(xué)過(guò)渡到功能基因組學(xué)，利用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的同存數(shù)據(jù)，充分發(fā)揮基因組學(xué)的同