1、中山醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室中山醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室陶陶 莎莎Tel：87330698E.mail：1. Introduction*細胞周期（cell cycle）就是指細胞生長與分裂的周期，即細胞在一次分裂結(jié)束開始生長，到下一次分裂完成所經(jīng)歷的過程。 Section 1 Introduction*細胞增殖（細胞增殖（cell proliferation）是細胞生命活動的）是細胞生命活動的重要特征之一，是生物繁育的基礎(chǔ)。重要特征之一，是生物繁育的基礎(chǔ)。細胞增殖的意義單細胞生物細胞增殖導(dǎo)致生物個體數(shù)量的增加。多細胞生物由一個單細胞(受精卵)分裂發(fā)育而來， 細胞增殖是多細胞生物繁殖基礎(chǔ)。成體生物仍然需

2、要細胞增殖，主要取代衰老死亡的細胞， 維持個體細胞數(shù)量的相對平衡和機體的正常功能。機體創(chuàng)傷愈合、組織再生、病理組織修復(fù)等，都要依賴 細胞增殖。1. Phases of Cell CycleG02. Characteristics of Cell Cycle PhasesG1期： 細胞周期的大部分時相處于G1期，動物細胞一般為612小時。該期主要的生化活動是合成RNA和蛋白質(zhì)S期： 此期一般持續(xù)68小時，其長短主要由基因組的復(fù)雜度決定。該期主要的生化活動是復(fù)制DNA。G2期： 是最短的時相。該期主要的生化活動是合成一些與有絲分裂有關(guān)的蛋白質(zhì)。M期： 該期很短，一般持續(xù)0.52小時。該期生化合成停

3、止，細胞形態(tài)發(fā)生改變，一個母細胞分裂成2個子代細胞。細胞增殖過程中兩個最重要的事件細胞增殖過程中兩個最重要的事件： 細胞內(nèi)成分的復(fù)制細胞內(nèi)成分的復(fù)制 細胞的分裂細胞的分裂 細胞必須確保細胞必須確保DNA在沒有損傷或損傷得到恢復(fù)的在沒有損傷或損傷得到恢復(fù)的情況下被復(fù)制情況下被復(fù)制；一個細胞周期染色體只能被復(fù)制一次，；一個細胞周期染色體只能被復(fù)制一次，復(fù)制的染色體要在正確的時間分離并被分配到兩個子復(fù)制的染色體要在正確的時間分離并被分配到兩個子代細胞中。代細胞中。3. Checking Points of Cell CycleG1-S期檢查點：又稱期檢查點：又稱G1限制點（限制點（R點），點），決定

4、細胞是決定細胞是否增殖。否增殖。細胞在該檢查點對各類生長因子、促有絲細胞在該檢查點對各類生長因子、促有絲分裂原以及分裂原以及DNA損傷等復(fù)雜的細胞內(nèi)、外信號進行損傷等復(fù)雜的細胞內(nèi)、外信號進行整合和傳遞，根據(jù)檢查結(jié)果決定細胞是否進行分裂、整合和傳遞，根據(jù)檢查結(jié)果決定細胞是否進行分裂、發(fā)生凋亡或進入發(fā)生凋亡或進入G0期。期。S期檢查點：可阻止期檢查點：可阻止DNA受損的細胞進行受損的細胞進行DNA合成。合成。主要是檢測主要是檢測DNA是否發(fā)生損傷、損傷的是否發(fā)生損傷、損傷的DNA分子是否分子是否得到修復(fù)，從而避免異常的得到修復(fù)，從而避免異常的DNA得以復(fù)制傳代。得以復(fù)制傳代。G2期檢查點：阻止受損

5、細胞進入有絲分裂期檢查點：阻止受損細胞進入有絲分裂。是控制是控制細胞進入細胞進入M期的檢查點，可防止細胞攜帶著受損的期的檢查點，可防止細胞攜帶著受損的DNA和未完成復(fù)制的和未完成復(fù)制的DNA進入有絲分裂。進入有絲分裂。M期檢查點：阻止受損細胞進行分裂，又稱紡錘體期檢查點：阻止受損細胞進行分裂，又稱紡錘體組裝檢查點。組裝檢查點。監(jiān)控姊妹染色體是否已穩(wěn)定地附著在監(jiān)控姊妹染色體是否已穩(wěn)定地附著在紡錘體上，若未通過檢查，細胞被阻止繼續(xù)進行分紡錘體上，若未通過檢查，細胞被阻止繼續(xù)進行分裂。裂。細胞周期中各關(guān)鍵點的轉(zhuǎn)換，是通過各種調(diào)控因子細胞周期中各關(guān)鍵點的轉(zhuǎn)換，是通過各種調(diào)控因子相互作用，構(gòu)成級聯(lián)網(wǎng)絡(luò)調(diào)

6、控系統(tǒng)來實現(xiàn)的。相互作用，構(gòu)成級聯(lián)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)來實現(xiàn)的。這一調(diào)控系統(tǒng)的核心是這一調(diào)控系統(tǒng)的核心是周期素依賴的蛋白激酶周期素依賴的蛋白激酶（cyclin-dependent protein kinase，CDK）家族。該家族。該家族成員的順序激活和對關(guān)鍵底物的磷酸化促進細家族成員的順序激活和對關(guān)鍵底物的磷酸化促進細胞周期的有序進程。胞周期的有序進程。 G1-CDK 使使RB蛋白磷酸化而釋放蛋白磷酸化而釋放轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子E2F,促進促進G1期細胞跨越期細胞跨越限制點，向限制點，向S期發(fā)生轉(zhuǎn)化。期發(fā)生轉(zhuǎn)化。Cyclin-CDK對細胞周期對細胞周期G1、G1/S進行調(diào)控進行調(diào)控 Leland Har

7、twellPaul NurseTim Hunt 因發(fā)現(xiàn)了一類細胞周期調(diào)因發(fā)現(xiàn)了一類細胞周期調(diào)控基因而獲此殊榮。這些控基因而獲此殊榮。這些基因中有一個被命名為基因中有一個被命名為“起始（起始（start）”，它在，它在細胞周期調(diào)控的第一步中細胞周期調(diào)控的第一步中起著關(guān)鍵作用。哈特韋爾起著關(guān)鍵作用。哈特韋爾還引入了還引入了“檢測點檢測點（checkpoint）”概念，對理解細胞周期如概念，對理解細胞周期如何運行和運轉(zhuǎn)頗有幫助。何運行和運轉(zhuǎn)頗有幫助。 運用遺傳學(xué)和分子生物學(xué)方運用遺傳學(xué)和分子生物學(xué)方法首次鑒定、克隆出細胞周期法首次鑒定、克隆出細胞周期的關(guān)鍵調(diào)控子之的關(guān)鍵調(diào)控子之CDK分子（周分子（周

8、期素依賴性激酶）。他還發(fā)現(xiàn)期素依賴性激酶）。他還發(fā)現(xiàn)CDK在進化中高度保守，它可在進化中高度保守，它可使其他蛋白質(zhì)磷酸化，從而使使其他蛋白質(zhì)磷酸化，從而使細胞沿著細胞周期不斷地進行細胞沿著細胞周期不斷地進行分裂。分裂。 第一個發(fā)現(xiàn)了周期素第一個發(fā)現(xiàn)了周期素(cyclin)，一類蛋白質(zhì)，是，一類蛋白質(zhì)，是CDK的調(diào)控分子。亨特在研的調(diào)控分子。亨特在研究中發(fā)現(xiàn)，周期素在每次細究中發(fā)現(xiàn)，周期素在每次細胞分裂過程中均發(fā)生周期性胞分裂過程中均發(fā)生周期性的降解，后來證明這是細胞的降解，后來證明這是細胞周期調(diào)控的一種普遍性的重周期調(diào)控的一種普遍性的重要機制。要機制。 2001年年10月月8日美國人日美國人L

9、eland Hartwell、英國人、英國人Paul Nurse、Timothy Hunt因?qū)毎芷谡{(diào)控機理的研究而獲諾貝爾生理因?qū)毎芷谡{(diào)控機理的研究而獲諾貝爾生理/醫(yī)學(xué)獎。醫(yī)學(xué)獎。1. Growth Factors and their Receptors生長因子，如EGF、PDGF、TGF、FGF、NGF、IL-2等，與相應(yīng)的靶細胞膜受體結(jié)合后，即可通過細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達，啟動細胞增殖過程。Section 2 Regulation of Cell CyclePDGF：一種較強的促有絲分裂的因子，能刺激細胞進入增殖過：一種較強的促有絲分裂的因子，能刺激細胞進入增殖過程。

10、大多數(shù)二倍體細胞的增殖需要程。大多數(shù)二倍體細胞的增殖需要PDGF。PDGFR：分子量約分子量約1 180kD，跨膜糖蛋白。受體具有，跨膜糖蛋白。受體具有TPK活性。靶活性。靶蛋白有磷脂酶蛋白有磷脂酶C等等Fig. Fig. 受體酪氨酸激酶（受體酪氨酸激酶（RTKsRTKs）的）的6 6個亞族個亞族受體酪氨酸激酶PDGFPLCPKC 對基因的早期活化和晚期活化對基因的早期活化和晚期活化Smad2 SARASmad2Smad2Smad4Smad4P300Fast2P300Smad4Smad2Fast2-P-P-PP15、P21Smad6,7細胞膜細胞膜胞漿胞漿核膜核膜GSBetalycnEndog

11、lin（TGF-）2TGF-途徑途徑（）TGF-作用與作用與EGF類似類似TGF-具有刺激細胞增殖和抑制細胞增殖的雙重性：具有刺激細胞增殖和抑制細胞增殖的雙重性： 能刺激體外培養(yǎng)的成纖維細胞的增殖能刺激體外培養(yǎng)的成纖維細胞的增殖 降低降低cyclinE的表達，抑制的表達，抑制cyclinE與與CDK2形成復(fù)合形成復(fù)合物；通過物；通過p27與與CDK結(jié)合，抑制結(jié)合，抑制CDK的活性的活性Rb蛋蛋白磷酸化受阻，細胞停留在白磷酸化受阻，細胞停留在G1期；誘導(dǎo)期；誘導(dǎo)P15基因表達，基因表達，增強抑制細胞增殖的效果。增強抑制細胞增殖的效果。EGF：53個個aa殘基，殘基，分子量分子量6kD，分布，分布

12、于人的尿液、血液于人的尿液、血液和乳汁。和乳汁。細胞增生細胞增生Raf蛋白 具有絲蘇氨酸蛋白激酶活性.又稱MAPKKK激活有絲分裂原激活蛋白激酶（MAPK)系統(tǒng)。 MAPK系統(tǒng) 是一組酶兼底物的蛋白分子，通常由三種蛋白激酶的級聯(lián)反應(yīng)構(gòu)成，種類較多，包括：MAP激酶激酶激酶(MAPKKK)，如Raf-1激酶。MAP激酶激酶(MAPKK)，如MEK1/2。MAPK，如ERK1/2。MAPKKKMAPKKMAPKMAPK途徑：途徑：2. 2.細胞周期調(diào)控的關(guān)鍵分子細胞周期調(diào)控的關(guān)鍵分子細胞周期蛋白細胞周期蛋白(Cyclin) ：Cdk的正調(diào)節(jié)因子的正調(diào)節(jié)因子 周期蛋白依賴性蛋白激酶周期蛋白依賴性蛋白

13、激酶(Cyclin-dependent kinases,Cdks)：細胞周期調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié)：細胞周期調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié) v細胞周期蛋白（細胞周期蛋白（Cyclins）：一類伴隨細胞周期）：一類伴隨細胞周期的不同階段表達、累積和降解的蛋白質(zhì)因子。的不同階段表達、累積和降解的蛋白質(zhì)因子。 細胞周期蛋白盒細胞周期蛋白盒(Cyclin box): 與與Cdk結(jié)合，激活結(jié)合，激活Cdk 的蛋白激酶活性的蛋白激酶活性降解盒降解盒(Destruction box): 在在Cyclin的自身降解中發(fā)揮的自身降解中發(fā)揮或或PEST序列（脯序列（脯-谷谷-絲絲-蘇）蘇） 重要作用重要作用結(jié)構(gòu)特點結(jié)構(gòu)特點調(diào)控機理調(diào)控機

14、理Cyclin與與Cdk形成異二聚體：催化亞基為形成異二聚體：催化亞基為Cdk， 調(diào)節(jié)亞基為調(diào)節(jié)亞基為Cyclin。 The Expressional Levels of Cyclins during Cell CycleDestruction Box in Cyclinsv細胞周期蛋白（細胞周期蛋白（Cyclins）的適時降解）的適時降解細胞周期蛋白合成后可被泛素修飾。細胞周期蛋白合成后可被泛素修飾。兩個泛素兩個泛素-蛋白連接酶介導(dǎo)了多泛素化的過程：蛋白連接酶介導(dǎo)了多泛素化的過程： SCF（由（由Skp1、Cullin和和F-box三種蛋白的首字母組成）三種蛋白的首字母組成） 通過降解通過降

15、解G1-S期期 cyclin E控制控制G1-S期期 的轉(zhuǎn)換。的轉(zhuǎn)換。 后期促進復(fù)合體（后期促進復(fù)合體（anaphase promoting complex or cyclosome，APC/C） 通過通過Cdc20（APCCdc20 ）或）或Cdh1 （APCCdh1 ）介導(dǎo)）介導(dǎo)作用于作用于M期期cyclin。APC/C將泛素轉(zhuǎn)移到位于將泛素轉(zhuǎn)移到位于cyclin降解盒降解盒C-端的賴氨酸殘基，進一步泛素化形成多泛素鏈端的賴氨酸殘基，進一步泛素化形成多泛素鏈降解。降解。如：有絲分裂期后期如：有絲分裂期后期cyclin B的降解。的降解。 APC/C可被可被M期期CDK磷酸化激活，活化的磷酸

16、化激活，活化的APC/C使使cyclin B 泛素化修飾并被降解。由于泛素化修飾并被降解。由于cyclin B是是CDK1的調(diào)節(jié)亞基，其的調(diào)節(jié)亞基，其降解使降解使CDK1失活。失活。 APC/C在在G1期的活性一直很高，以確保期的活性一直很高，以確保S期和期和M期期cyclin被徹底清除，保證有絲分裂的完成。被徹底清除，保證有絲分裂的完成。 APC/C在在G1晚期失活，允許晚期失活，允許cyclin B和和CDK1水平同時升水平同時升高，使細胞準備進入下一個有絲分裂周期。高，使細胞準備進入下一個有絲分裂周期。不同類型的CDK/cyclin復(fù)合體 Cyclin D包括D1-3，各亞型cyclin

17、 D在不同細胞中的表達量不同，但具有相同的功效。分類：分類：A-H細胞周期中不同類型細胞周期中不同類型cyclin的表達變化的表達變化周期蛋白依賴性蛋白激酶周期蛋白依賴性蛋白激酶（Cdks）：一類）：一類Ser/Thr蛋白激蛋白激酶，在細胞周期的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。人體細胞內(nèi)主要酶，在細胞周期的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。人體細胞內(nèi)主要有有Cdk1/Cdc2、Cdk26、Cdk7/CAK和和Cdk8等。等。 活性中心：活性中心：ATP結(jié)合部位；催化部位結(jié)合部位；催化部位調(diào)節(jié)亞基調(diào)節(jié)亞基Cyclin的結(jié)合部位：正調(diào)節(jié)的結(jié)合部位：正調(diào)節(jié)P13suc1的結(jié)合部位：負調(diào)節(jié)，阻止細胞進的結(jié)合部位：負調(diào)節(jié)，阻止細胞進

18、/退退M期期結(jié)構(gòu)特點：結(jié)構(gòu)特點：3個主要功能域個主要功能域沒有酶量的調(diào)節(jié)：沒有酶量的調(diào)節(jié)：在整個細胞周期中，某一在整個細胞周期中，某一Cdk的含量的含量恒定，其活化恒定，其活化Cdk與非活化與非活化Cdk的總量不變。的總量不變。 CdK的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)、：抑制性磷酸化位點；抑制性磷酸化位點；cyclin結(jié)合位點；結(jié)合位點；ATP結(jié)合位點結(jié)合位點b: 催化部位催化部位: ATP結(jié)合位點結(jié)合位點: T-loop；活性磷；活性磷酸化位點酸化位點: 自身磷酸化位點自身磷酸化位點Cyclin ACdk2 CDK的分子量一般為的分子量一般為3540kD，不同，不同CDK的氨基酸組成有的氨基酸組成有40%以上的

19、同源性。以上的同源性。 典型的典型的CDK催化亞基的活性中心約由催化亞基的活性中心約由300個氨基酸殘基組成，當處于單體或個氨基酸殘基組成，當處于單體或非磷酸化狀態(tài)時，非磷酸化狀態(tài)時，CDK沒有催化活性。沒有催化活性。 CDK的催化活性受到激活因素與抑制因素兩方面的調(diào)節(jié)。在激活因素中，目前認為CDK與周期蛋白的結(jié)合以及保守的蘇氨酸殘基的磷酸化是較為重要的兩種調(diào)節(jié)因素；而在抑制因素中，CDK的N-端氨基酸殘基的抑制性磷酸化以及抑制蛋白的結(jié)合是主要的調(diào)節(jié)因素。Regulation of CDK ActivityActivation of CDK 周期素的激活作用：周期素中的“周期素盒”結(jié)構(gòu)域直接和

20、CDK結(jié)合，并與CDK的激活相關(guān)，周期素是CDK的正性調(diào)節(jié)劑。周期素的這兩種功能是密切相關(guān)的，而這種結(jié)合與激活作用主要通過周期素在細胞周期中的濃度波動來調(diào)控。CyclinA-CDK2 Complex with ATP Bound 磷酸化修飾的激活作用：CDK的激活還必須依賴于其保守的蘇氨酸殘基的磷酸化，如在人CDK1（p34cdc2）的Thr161和CDK2的Thr160的磷酸化，就與這兩個酶的激活相關(guān)。 催化CDK1和CDK2磷酸化的酶是CAK，該酶是一種寡聚體，其催化亞基為CDK7，調(diào)節(jié)亞基為周期素H，另需一組裝蛋白因子MAT1以穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。Complex of CDK7 CyclinH-M

21、AT1 Cyclin HCDK7MAT1Inhibition of CDK 磷酸化修飾的抑制作用：在人的CDK1和CDK2中，Thr14和Tyr15殘基的磷酸化可抑制CDK的催化活性。其原因在于上述殘基的側(cè)鏈位于該酶活性中心ATP結(jié)合部位的頂端，因而對激酶的磷酸化作用產(chǎn)生了阻礙。催化Thr14和Tyr15磷酸化的是兩種不同的蛋白激酶，使Thr14磷酸化的為蛋白激酶Myt1 ，使Tyr15磷酸化的是蛋白激酶Wee1/Mik1 。催化Thr14和Tyr15脫磷酸化的是蛋白磷酸酶CDC25。因此，蛋白激酶Wee1和Myt1及蛋白磷酸酶CDC25的相對活性，決定CDK1和CDK2的活性高低。CDK a

22、ctivating組成、結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)：活化與非活化組成、結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)：活化與非活化Cdk的比例的比例正性調(diào)節(jié)正性調(diào)節(jié)：人：人Cdk與特定的與特定的Cyclin 結(jié)合才有活性；也只有結(jié)合才有活性；也只有Cyclin降解才能使降解才能使Cdk最終失活。最終失活。 負性調(diào)節(jié)負性調(diào)節(jié)：CKI與與Cdk結(jié)合后阻止結(jié)合后阻止Cdk磷酸化。磷酸化。 共價調(diào)節(jié)共價調(diào)節(jié)：抑制性位點磷酸化失活：抑制性位點磷酸化失活(Wee1激酶激酶)；去磷酸化復(fù)；去磷酸化復(fù)活活(Cdc25磷酸酶磷酸酶)。協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)：人：人Cdc2的的Thr 160/161和和Thr 14/Tyr 15磷酸化，磷酸化，可促進可促進Cdk-Cycli

23、n結(jié)合。結(jié)合。 這種磷酸化又依賴這種磷酸化又依賴Cyclin，Cyclin與與Cdk的結(jié)合可導(dǎo)致的結(jié)合可導(dǎo)致Cdk T環(huán)的移開，暴露出其中的環(huán)的移開，暴露出其中的Thr 160/161位點位點 。 MPF activity controlled by:1) cyclin B levels2) phosphorylation of cdk1Multiple levels of regulation provide input for“checkpoint control”CDK激酶激酶(CDK activating kinase，CAK)：磷酸化磷酸化Thr161Wee1激酶：激酶：磷酸化磷酸化

24、Tyr15/Thr14Cdk抑制蛋白抑制蛋白(CKIs)Cdk抑制蛋白是Cdk的負調(diào)節(jié)因子，拮抗Cyclin的作用，阻止細胞經(jīng)過檢驗點 。（1）CIP/KIP(Kinase inhibition protein)家族：廣泛抑家族：廣泛抑制制Cdk1-, Cdk2-, Cdk4/6-Cyclin復(fù)合物。因其復(fù)合物。因其N端和端和C端分別具有不同的結(jié)構(gòu)和功能，故又稱雙重特異家族。端分別具有不同的結(jié)構(gòu)和功能，故又稱雙重特異家族。包括包括p21、p27和和p57CKI兩大家族兩大家族（2） INK4(Inhibitor of cdk4)家族：特異性抑制家族：特異性抑制Cdk4/6-D Cyclins，

25、因其結(jié)構(gòu)中含有數(shù)個具強烈疏水，因其結(jié)構(gòu)中含有數(shù)個具強烈疏水性的錨蛋白（性的錨蛋白（ankyrin）重復(fù)序列，故又稱錨蛋白家族，）重復(fù)序列，故又稱錨蛋白家族，包括包括p15、p16、p18和和p19。 p21p21是第一個被發(fā)現(xiàn)的CKI基因(1993年)，其抑制作用最廣泛，對細胞周期各期的Cdks均有明顯的抑制作用。由于其表達蛋白質(zhì)分子量為21 kD，而且最初認為它與野生型p53的生物活性有關(guān)，故命名為p21WAF-1(Wild-type p53 Activated Fragment-1)；后又發(fā)現(xiàn)p21與細胞老化等多種因素有關(guān)，故又稱p21SDL1/Cip-1/CAP20/PIC1等。第一個被發(fā)現(xiàn)的第一個被發(fā)現(xiàn)的CKI基因基因p21定位于定位于6p21抑制作用最廣泛抑制作用最廣泛表達蛋白質(zhì)分子量為表達蛋白質(zhì)分子量為21 kDP21的功能的功能 可能作用于細胞周期的多個環(huán)節(jié) P21可與Cyclin、Cdk和增殖細胞核抗原(PCNA)組成四聚體。其N端結(jié)構(gòu)域與Cyclin-Cdk結(jié)合，阻止細胞進入S期。 當細胞在S期發(fā)生DNA損傷時，p21的C末端結(jié)構(gòu)域與PCNA直接結(jié)合，阻止損傷DNA長鏈的復(fù)制。但p21不能抑制DNA復(fù)制起始