1、各種微生物生化試驗方法原理通常利用生化試驗的方法，檢測細(xì)菌對各種物質(zhì)的代謝作用及其代謝產(chǎn)物，稱為細(xì)菌的生化反應(yīng)，常用于細(xì)菌的鑒別。1、 糖類分解產(chǎn)物（1）糖發(fā)酵試驗（carbohydrate fermentation test）不同種類的細(xì)菌對糖的分解利用能力不同，一般以能否分解某種糖，是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣等現(xiàn)象來鑒別。例如大腸桿菌能分解葡萄糖和乳糖，產(chǎn)酸且產(chǎn)氣；而傷寒桿菌只分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，且不分解乳糖。這是因為大腸桿菌分解葡萄糖等產(chǎn)生甲酸，經(jīng)甲酸解氫酶的作用生成H2和CO2。而傷寒桿菌無此酶，故分解葡萄糖只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。（2）VP試驗（Voges-Proskauer test）產(chǎn)氣桿菌將分解葡萄

2、糖產(chǎn)生的兩分子丙酮酸脫羧，生成一分子乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在堿性溶液中被空氣中氧氣氧化，生成二乙酰，二乙?？膳c培養(yǎng)液中含胍基的化合物（如蛋白胨中的精氨酸）反應(yīng)，生成紅色的化合物，此為VP試驗陽性。大腸桿菌分解葡萄糖不生成乙酰甲基甲醇，故VP試驗陰性。（3）甲基紅試驗（methyl red test）大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌均屬G-短桿菌，且都能分解葡萄糖、乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，二者不易區(qū)別。但兩者所產(chǎn)生的酸類和總酸量不一：大腸桿菌可產(chǎn)生甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸等，而產(chǎn)氣桿菌只產(chǎn)生甲酸、乙醇及乙酰甲基甲醇。故大腸桿菌培養(yǎng)液PH在4.5以下，加入甲基紅指示劑呈紅色，為甲基紅試驗陽性；產(chǎn)氣桿菌培養(yǎng)液PH在5.

3、4以上，加入甲基紅后呈桔黃色，為甲基紅試驗陰性。（4）枸櫞酸鹽利用試驗(citrate utilization test） 產(chǎn)氣桿菌在以枸櫞酸鹽為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，分解枸櫞酸鹽產(chǎn)生CO2，并轉(zhuǎn)變?yōu)樘妓猁}，使培養(yǎng)基由中性變?yōu)閴A性，含溴麝香草酚藍(lán)（BTB）指示劑的培養(yǎng)基由淡綠色變?yōu)樯钐m色，此為枸櫞酸鹽利用試驗陽性。大腸桿菌不能利用枸櫞酸鹽，故在此培養(yǎng)基上不能生長，培養(yǎng)基仍為綠色。2、蛋白質(zhì)及氨基酸的分解產(chǎn)物（1）硫化氫試驗（hydrogen sulfide test） 有些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、甲硫氨酸等）產(chǎn)生H2S，如遇醋酸鉛或硫酸亞鐵，能生成黑色的硫化物，為硫化氫試驗

4、陽性。本試驗常用于區(qū)別腸道桿菌的種類。沙門氏菌屬通常為陽性;大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、志賀氏菌為陰性。（2）明膠液化試驗（gelatin liguefaction test） 有些細(xì)菌具有明膠酶，能分解明膠使其失去凝固能力而液化。變形桿菌、霍亂弧菌、綠膿桿菌、枯草桿菌等能液化明膠；大腸桿菌、沙門氏菌則不能。（3）吲哚試驗（indole test） 有些細(xì)菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成無色吲哚，加入對-二甲基氨基苯甲醛，無色吲哚生成紅色玫瑰吲哚，為吲哚試驗陽性。大腸桿菌、霍亂弧菌等吲哚試驗陽性；產(chǎn)氣桿菌、傷寒沙門氏菌為吲哚試驗陰性。吲哚 對二甲基氨基苯甲醛 玫瑰吲哚細(xì)菌的生化反應(yīng)是鑒別細(xì)菌

5、的重要手段：其中吲哚試驗（I）、甲基紅試驗（M）、VP試驗(V)和枸櫞酸鹽利用試驗（C），簡稱為IMVIC試驗，常用于大腸桿菌與產(chǎn)氣桿菌的鑒別。典型的大腸桿菌的IMViC試驗結(jié)果為“+-”，而產(chǎn)氣桿菌是“-+”。 0票 票數(shù)實驗四、微生物的快速鑒定和自動化分析技術(shù) 如何使微生物學(xué)技術(shù)方法快速、準(zhǔn)確、簡易和自動化，一直是微生物學(xué)工作者研究的熱點，尤其是臨床醫(yī)學(xué)方面，對微生物的快速準(zhǔn)確鑒定，更是"時間就是生命"。近20多年來，隨著微電子、計算機、分子生物學(xué)、物理、化學(xué)等先進(jìn)技術(shù)向微生物學(xué)的滲透和多學(xué)科的交叉，這方面已取得了突破性進(jìn)展，許多快速、準(zhǔn)確、敏感、簡易、自動化的方法技術(shù)

6、，不僅在微生物鑒定中廣為使用，而且在微生物學(xué)的其它方面也被采用，推動了微生物學(xué)的迅速發(fā)展。一、微量多項試驗鑒定系統(tǒng)該系統(tǒng)的根本原理是根據(jù)微生物生理生化特征鑒定的結(jié)果，而進(jìn)行的數(shù)碼分類鑒定。這種技術(shù)也稱為簡易診檢技術(shù)，或數(shù)碼分類鑒定法。它是針對微生物的生理生化特征，配制各種培養(yǎng)基、反應(yīng)底物、試劑等，分別微量（約0.1ml）加入各個分隔室中（或用小圓紙片吸收），冷凍干燥脫水或不干燥脫水，各分隔室在同一塑料條或板上構(gòu)成檢測卡。試驗時加入待檢測的某一種菌液，培養(yǎng)248小時，觀察鑒定卡上各項反應(yīng)，按判定表判定試驗結(jié)果，用此結(jié)果編碼，查檢索表(根據(jù)數(shù)碼分類鑒定的原理編制成)，得到鑒定結(jié)果，或?qū)⒕幋a輸入計算

7、機，用根據(jù)數(shù)碼分類鑒定原理編制的軟件鑒定，打印出結(jié)果。微量多項試驗鑒定系統(tǒng)已廣泛用于動、植物檢疫、臨床檢驗、食品衛(wèi)生、藥品檢查、環(huán)境監(jiān)測、發(fā)酵控制、生態(tài)研究等方面，尤其是臨床檢驗中深受歡迎，迅猛發(fā)展。國際上此技術(shù)的產(chǎn)品，或稱系統(tǒng)，種類繁多，國內(nèi)有河南開封醫(yī)學(xué)生物研究所的腸桿菌科細(xì)菌鑒定卡E-15；上海市衛(wèi)生防疫站的發(fā)酵性革蘭氏陰性桿菌鑒定系統(tǒng)SWF-A；中國人民解放軍一八一醫(yī)院的厭氧菌快速生化鑒定系列ARB-ID；深圳華士達(dá)生物科技有限公司的腸桿菌科的細(xì)菌生化鑒定卡ENT等。國外的產(chǎn)品已標(biāo)準(zhǔn)化、系統(tǒng)化和商品化，主要有法國生物-梅里埃集團(tuán)的API/ATB；瑞士羅氏公司的Micro-ID，Ente

8、rotube,Minitek；美國的Biolog全自動和手動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)：日本的微孔濾膜塊等，其中API/ATB包括眾多的鑒定系統(tǒng)，共計有750種反應(yīng)，可鑒定幾乎所有常見的細(xì)菌。微量多項鑒測技術(shù)優(yōu)點突出，不僅能快速、敏感、準(zhǔn)確、重復(fù)性好地鑒檢微生物，而且簡易，節(jié)省人力、物力、時間和空間，缺點是各系統(tǒng)差異較大，有的價格貴，有的個別反應(yīng)不準(zhǔn)，難判定，但毫無疑問，它是微生物技術(shù)方法向快速、簡易和自動化發(fā)展的重要方向之一。API20E系統(tǒng)是API/ATB中最早和最重要的產(chǎn)品，也是國際上應(yīng)用最多的系統(tǒng)。該系統(tǒng)的鑒定卡是一塊有20個分隔室的塑料條，分隔室由相連通的小管和小環(huán)組成，各小管中含不同的脫水培養(yǎng)基

9、、試劑，或底物等，每一分隔室可進(jìn)行一種生化反應(yīng)，個別的分隔室可進(jìn)行兩種反應(yīng)，主要用來鑒定腸桿菌科細(xì)菌，如圖1所示。圖1 API 20E鑒定卡示意圖 鑒定未知細(xì)菌的主要過程：將菌液加入每一個分隔室；培養(yǎng)后，有的分隔室的小杯中需要添加試劑，觀察鑒定卡上20個分隔室中的反應(yīng)變色情況，根據(jù)反應(yīng)判定表（表1），判定各項反應(yīng)是陽性還是陰性反應(yīng)；按鑒定卡上反應(yīng)項目從左到右的順序，每三個反應(yīng)項目編為一組，共編為七組，每組中每個反應(yīng)項目定為一個數(shù)值，依次是1、2、4，各組中試驗結(jié)果判定的反應(yīng)是陽性者記""，則寫下其所定的數(shù)值，反應(yīng)陰性者記""，則寫為0，每組中的

10、數(shù)值相加，便是該組的編碼數(shù)，這樣便形成了7位數(shù)字的編碼，表2為舉例說明；用7位數(shù)字的編碼查API20E系統(tǒng)的檢索表，或輸入計算機檢索，則能將檢驗的細(xì)菌鑒定出是什么菌種或生物型。表1  API20E反應(yīng)判定表  鑒定卡上的反應(yīng)項目反 應(yīng) 結(jié) 果 代 號項 目 名 稱陰 性陽 性O(shè)NPN-半乳糖苷酶無色黃ADH精氨酸水解黃綠紅，橘紅LDC賴氨酸脫羧黃綠紅，橘紅ODC鳥氨酸脫羧黃綠紅，橘紅CIT枸椽酸鹽利用黃綠綠藍(lán)H2S產(chǎn)H2S無色黑色沉淀URE尿素酶黃紅紫TDA色胺酸脫氨酶黃紅紫IND吲哚形成黃綠紅VPV.P.試驗無色紅GEL蛋白酶黑粒黑液GLU葡萄糖產(chǎn)酸藍(lán)黃綠MAN甘露醇產(chǎn)酸

11、藍(lán)黃綠INO肌醇產(chǎn)酸藍(lán)黃綠SOR山梨醇產(chǎn)酸藍(lán)黃綠RHA鼠李糖產(chǎn)酸藍(lán)黃綠SAC蔗糖產(chǎn)酸藍(lán)黃綠MEL密二糖產(chǎn)酸藍(lán)黃綠AMY淀粉產(chǎn)酸藍(lán)黃綠 ARA阿拉伯糖產(chǎn)酸藍(lán)黃綠表2 API20E舉例說明項目名稱ONPGADHLDCODCCITH 2SURETDAINDVPGELGLUMANINOSORRHASACMELAMYARA所定數(shù)值12412412412412412412試驗結(jié)果+-+-+-+記下數(shù)值10412000010412412412編    碼5305773檢索結(jié)果5305773 產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes） 實驗五、抗微生物藥

12、物敏感性試驗一、實驗?zāi)康目刮⑸锼幬锩舾行栽囼灒ㄋ幟粼囼灒┑闹饕康臋z出細(xì)菌的耐藥性，預(yù)測抗微生物藥物的臨床治療效果，并為臨床醫(yī)生針對某一特定的臨床感染選用藥物提供依據(jù)。對所有臨床分離的可疑致病菌，如不能從該菌的種屬特征可靠地推知其對抗菌藥物的敏感性，就需要進(jìn)行藥敏試驗。紙片擴散法二、實驗原理此法是臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI/NCCLS）所推薦的臨床微生物理學(xué)室常規(guī)開展的藥敏試驗方法。將含有定量抗菌藥物的紙片（藥敏紙片）貼在已接種待檢菌的瓊脂平板表面特定部位。藥物借其分子的擴散力向周圍瓊脂中擴散，形成了隨著離紙片距離加大，瓊脂中的藥物濃度逐漸減少的梯度濃度。其紙片周圍一定區(qū)域瓊脂內(nèi)的藥

13、物濃度高于抑制待檢菌所需濃度時，則該區(qū)域內(nèi)細(xì)胞不能生長，形成透明抑制圈。抑菌圈的大小可以反映待檢對測定藥物的敏感程度，并與該藥對待檢菌的最低抑菌濃度（MIC）呈負(fù)相關(guān)，即抑菌圈愈大，MIC愈小。三、實驗器材和試劑1菌種  金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853或臨床分離的菌株。2培養(yǎng)基  MH（Mueller-Hintion）瓊脂。3試劑  無菌生理鹽水，0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管（McFarland standard，相當(dāng)于1.5×108CFU/ml），抗菌藥物紙片：選用直徑6.35mm吸水量20l的專

14、用藥敏紙片，包括阿米卡星（AMK）、青霉素（PEN）、氨芐西林（AMP）、哌拉西林（PIP）、頭孢唑啉（FZN）、頭孢呋辛（FRX）、頭孢他啶（CAZ）、頭孢他啶/棒酸（CD03）、氨曲南（ATM）、亞胺培南（IMP）、環(huán)丙沙星（CIP）、萬古霉素（VAN）、克林霉素（CLI）、復(fù)方新諾明（SXT）。4其他  無菌棉拭子、鑷子、毫米尺、接種環(huán)。四、方法步驟1菌液制備（1）對數(shù)生長法：從瓊脂平板上選取至少3-5個形態(tài)特征一致的菌落，用接種環(huán)轉(zhuǎn)移至含45ml的肉湯培養(yǎng)管（如胰酶消化大豆肉湯）中，35孵育2-6h。用無菌鹽水或肉湯調(diào)整菌液濁度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)。（2）直接菌落法：從孵育1

15、8-24h的非選擇性培養(yǎng)基（如血瓊脂）平板上，挑取單個菌落，直接用肉湯或無菌鹽水制成0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度的懸液。2接種  細(xì)菌懸液制備后15min內(nèi)接種至MH瓊脂平板。用無菌棉拭醮取菌懸液，在管內(nèi)壁液面上方旋轉(zhuǎn)緊壓，將多余菌液擠去，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。3貼藥敏紙片  涂布后的平板在室溫下干燥3-5min，用紙片分配器或無菌鑷子將紙片貼于瓊脂表面并輕壓，使紙片與瓊脂表面完成接觸。各紙片中心相距應(yīng)大于24mm，紙片貼上后就不能再移動位置。4孵育將平板倒置放入35孵箱（苛養(yǎng)菌敏平板應(yīng)放置于5%-10%CO2環(huán)境中），16-18h讀取結(jié)果，葡萄球菌和腸球菌必須孵育24h以檢測對苯

16、唑西林和萬古霉素的耐藥性。五、結(jié)果判斷抑菌圈的直徑（包含紙片的直徑），以毫米數(shù)報告（取整數(shù)）。根據(jù)CLSI判定標(biāo)準(zhǔn)測量抑菌圈直徑大小可以判斷細(xì)菌對該抗生素是敏感、中介還是耐藥。敏感（S）：表示常規(guī)劑量的測定藥物在體內(nèi)所達(dá)到的濃度能抑制或殺滅待測菌。中介（I）：不是敏感性的度量，而是一個“緩沖區(qū)”，用以防止因微小的技術(shù)因素失控導(dǎo)致的結(jié)果偏差，因而其臨床意義是不確定的，故不應(yīng)作臨床報告。耐藥（R）：表示常規(guī)劑量的測定藥物在體內(nèi)達(dá)到有效濃度時不能抑制待測菌生長。六、藥敏試驗結(jié)果判斷注意事項（1）藥敏試驗的結(jié)果容易受培養(yǎng)基、抗菌藥物、孵育條件等多種因素影響，實驗室開展藥敏試驗時應(yīng)定期用標(biāo)準(zhǔn)菌株對上述因

17、素進(jìn)行質(zhì)量控制。（2）變形桿菌屬的菌株可擴散到某些抗菌藥物的抑菌圈內(nèi)，所以在明顯的抑菌圈內(nèi)有薄膜樣爬行生長可以忽略。（3）對于鏈球菌應(yīng)檢測生長抑制圈而不是溶血抑制圈。對于甲氧芐啶和磺胺，拮抗物可使細(xì)菌輕微生長，所以抑菌圈直徑的檢測不考慮細(xì)微生長的部分（生長菌苔的20%或以下）而測量比較明顯的邊緣。（4）對于沙門菌屬和志賀菌屬的分離株只有氨芐西林、一種喹諾酮類藥物和磺胺甲唑/甲氧芐啶可用于常規(guī)試驗和報告，第一、第二代頭孢菌素和氨基糖苷類抗生素體外可能對這些菌株有活性，但臨床卻無效，所以對上述藥物不應(yīng)報告為敏感。（5）沙門菌屬的腸道外分離株應(yīng)測試并報告氯霉素和一種三代頭孢菌素的敏感性。（6）腸球菌

18、屬對頭孢菌素類、氨基糖苷類（僅篩選高水平耐藥性）、磺胺甲  唑/甲氧芐啶和克林霉素在體外可能有活性，但在臨床上耐藥，所以不能報告對這些藥物敏感。七、影響藥敏結(jié)果的因素1.培養(yǎng)基：應(yīng)根據(jù)試驗菌的營養(yǎng)需要進(jìn)行配制。傾注平板時，厚度合適（約5-6mm），不可太薄，一般90mm直徑的培養(yǎng)皿，傾注培養(yǎng)基18-20ml為宜。培養(yǎng)基內(nèi)應(yīng)盡量避免有抗菌藥物的拮抗物質(zhì)，如鈣、鎂離子能減低氨基糖苷類的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和對氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺藥和TMP的活性。2.細(xì)菌接種量：細(xì)菌接種量應(yīng)恒定，如太多，抑菌圈變小，能產(chǎn)酶的菌株更可破壞藥物的抗菌活性。3.藥物濃度：藥物的濃度和總量直接影響抑菌

19、試驗的結(jié)果，需精確配制。商品藥應(yīng)嚴(yán)格按照其推薦治療量配制。4.培養(yǎng)時間：一般培養(yǎng)溫度和時間為37 8-18小時，有些抗菌藥擴散慢如多粘菌素，可將已放好抗菌藥的平板培養(yǎng)基，先置4冰箱內(nèi)2-4小時，使抗菌藥預(yù)擴散，然后再放37溫箱中培養(yǎng)，可以推遲細(xì)菌的生長，而得到較大的抑菌圈。八、思考題1.操作藥敏試驗并說出注意事項。2.試述藥敏試驗的意義？3.如何根據(jù)藥敏試驗的結(jié)果選擇藥物？4.什么叫抑菌圈？如何根據(jù)抑菌圈大小判斷細(xì)菌對藥物的敏感度？  實驗六、微生物的生理生化反應(yīng)微生物生理生化反應(yīng)的多樣性在自然界產(chǎn)生了兩種結(jié)果:第一是使自然界的有機分子都有可能得到分解;第二是使不同微生物之間有了互相

20、作用和互相依賴的基礎(chǔ).例如,一種微生物能利用另一種微生物所分解的產(chǎn)物,或者一種微生物的產(chǎn)物可抑制或殺死另一種微生物.所以微生物的生理生化反應(yīng)也被作為細(xì)菌鑒定和分類的內(nèi)容。一、大分子物質(zhì)的水解試驗(一)目的要求1.證明不同微生物對各種有機大分子的水解能力不同,從而說明不同微生物有著不同的酶系統(tǒng)。2.掌握進(jìn)行微生物大分子水解試驗的原理和方法。(二)基本原理微生物對大分子的淀粉,蛋白質(zhì)和脂肪不能直接利用,必須靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì)分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要為水解酶,通過加水裂解大的物質(zhì)為較小的化合物,使其能被運輸至細(xì)胞內(nèi).如淀粉酶水解淀粉為小分子的糊精,雙糖和單糖;脂肪酶水解脂肪為甘油

21、和脂肪酸;蛋白酶水解蛋白質(zhì)為氨基酸等.這些過程均可通過觀察細(xì)菌菌落周圍的物質(zhì)變化來證實:淀粉遇碘液會產(chǎn)生藍(lán)色,但細(xì)菌水解淀粉的區(qū)域,用碘測定不再產(chǎn)生藍(lán)色,表明細(xì)菌產(chǎn)生淀粉酶.脂肪水解后產(chǎn)生脂肪酸可改變培養(yǎng)基的pH,使pH降低,加入培養(yǎng)基的中性紅指示劑會使培養(yǎng)基從淡紅色變?yōu)樯罴t色,說明胞外存在著脂肪酶。微生物可以利用各種蛋白質(zhì)和氨基酸作為氮源外,當(dāng)缺乏糖類物質(zhì)時,亦可用它們作為碳源和能源.明膠是由膠原蛋白經(jīng)水解產(chǎn)生的蛋白質(zhì),在25以下可維持凝膠狀態(tài),以固體形式存在.而在25以上明膠就會液化.有些微生物可產(chǎn)生一種稱作明膠酶的胞外酶,水解這種蛋白質(zhì),而使明膠液化,甚至在4仍能保持液化狀態(tài)。還有些微生

22、物能水解牛奶中的蛋白質(zhì)酪素,酪素的水解可用石蕊牛奶來檢測.石蕊培養(yǎng)基由脫脂牛奶和石蕊組成,是昏濁的藍(lán)色.酪素水解成氨基酸和肽后,培養(yǎng)基就會變得透明.石蕊牛奶也常被用來檢測乳糖發(fā)酵,因為在酸存在下,石蕊會轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色,而過量的酸可引起牛奶的固化(凝乳形成).氨基酸的分解會引起堿性反應(yīng),使石蕊變?yōu)樽仙?此外,某些細(xì)菌能還原石蕊,使試管底部變?yōu)榘咨?。尿素是由大多?shù)哺乳動物消化蛋白質(zhì)后被分泌在尿中的廢物.尿素酶能分解尿素釋放出氨,這是一個分辨細(xì)菌很有用的診斷實驗.盡管許多微生物都可以產(chǎn)生尿素酶,但它們利用尿素的速度比變形桿菌屬(Proteus)的細(xì)菌要慢,因此尿素酶試驗被用來從其他非發(fā)酵乳糖的腸道微生

23、物中快速區(qū)分這個屬的成員.尿素瓊脂含有蛋白胨,葡萄糖,尿素和酚紅.酚紅在pH6.8時為黃色,而在培養(yǎng)過程中,產(chǎn)生尿素酶的細(xì)菌將分解尿素產(chǎn)生氨,使培養(yǎng)基的pH升高,在pH升至8.4時,指示劑就轉(zhuǎn)變?yōu)樯罘奂t色。(三)器材1.菌種 枯草芽胞桿菌,大腸桿菌,金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),普通變形桿菌。2.培養(yǎng)基 固體油脂培養(yǎng)基,固體淀粉培養(yǎng)基,明膠培養(yǎng)基試管,石蕊牛奶試管,尿素瓊脂試管。3.溶液或試劑 革蘭氏染色用盧戈氏碘液(Lugol's iodine solution)。4.儀器或其他用具 無菌平板,無菌試管,接種環(huán),接種針,試管架。(四)操

24、作步驟l.淀粉水解試驗(1)將固體淀粉培養(yǎng)基溶化后冷卻至50左右,無菌操作制成平板。(2)用記號筆在平板底部劃成四部分。(3)將枯草芽孢桿菌,大腸桿菌,金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌分別在不同的部分劃線接種,在平板的反面分別在四部分寫上菌名。(4)將平板倒置在37溫箱中培養(yǎng)24h。(5)觀察各種細(xì)菌的生長情況,將平板打開蓋子,滴入少量Lugol's碘液于平皿中,輕輕旋轉(zhuǎn)平板,使碘液均勻鋪滿整個平板。如菌苔周圍出現(xiàn)無色透明圈,說明淀粉己被水解,為陽性.透明圈的大小可初步判斷該菌水解淀粉能力的強弱,即產(chǎn)生胞外淀粉酶活力的高低。2.油脂水解試驗(1)將溶化的固體油脂培養(yǎng)基冷卻至50左右時,充分

25、搖蕩,使油脂均勻分布.無菌操作倒入平板,待凝。(2)用記號筆在平板底部劃成四部分,分別標(biāo)上菌名。(3)將上述四種菌分別用無菌操作劃+字接種于平板的相對應(yīng)部分的中心。(4)將平板倒置,于37溫箱中培養(yǎng)24h。(5)取出平板,觀察菌苔顏色,如出現(xiàn)紅色斑點說明脂肪水解,為陽性反應(yīng)。3.明膠水解試驗(1)取三支明膠培養(yǎng)基試管,用記號筆標(biāo)明各管欲接種的菌名。(2)用接種針分別穿刺接種(見圖34B)枯草芽抱桿菌,大腸桿菌,金黃色葡萄球菌。(3)將接種后的試管置20中,培養(yǎng)25d。(4)觀察明膠液化情況。 4.石蕊牛奶試驗(1)取兩支石蕊牛奶培養(yǎng)基試管,用記號筆標(biāo)明各管欲接種的菌名。(2)分別接種

26、普通變形桿菌和金黃色葡萄球菌。(3)將接種后的試管置35中,培養(yǎng)2448h。(4)觀察培養(yǎng)基顏色變化.石蕊在酸性條件下為粉紅色,堿性條件下為紫色,而被還原時為白色。5.尿素試驗(1)取兩支尿素培養(yǎng)基斜面試管,用記號筆標(biāo)明各管欲接種的菌名。(2)分別接種普通變形桿菌和金黃色葡萄球菌。(3)將接種后的試管置35中,培養(yǎng)2448h。(4)觀察培養(yǎng)基顏色變化.尿素酶存在時為紅色,無尿素酶時應(yīng)為黃色。(五)實驗報告1.結(jié)果將結(jié)果填入下表,"+"表示陽性,"-"表示陰性菌名枯草芽孢桿菌大腸桿菌金黃色葡萄球菌淀粉水解試驗   脂肪水解試驗

27、   明膠液化試驗   石蕊牛奶試驗   尿素試驗   2.思考題(1)你怎樣解釋淀粉酶是胞外酶而非胞內(nèi)酶？(2)不利用碘液,你怎樣證明淀粉水解的存在？(3)接種后的明膠試管可以在35培養(yǎng),在培養(yǎng)后你必須做什么才能證明水解的存在？(4)解釋在石蕊牛奶中的石蕊為什么能起到氧化還原指示劑的作用？(5)為什么尿素試驗可用于鑒定Proteus細(xì)菌？ 二、糖發(fā)酵試驗(一)目的要求1.了解糖發(fā)酵的原理和在腸道細(xì)菌鑒定中的重要作用2.掌握通過糖發(fā)酵鑒別不同微生物的方法(二)基本原

28、理糖發(fā)酵試驗是常用的鑒別微生物的生化反應(yīng),在腸道細(xì)菌的鑒定上尤為重要.絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類作為碳源和能源,但是它們在分解糖類物質(zhì)的能力上有很大的差異.有些細(xì)菌能分解某種糖產(chǎn)生有機酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和氣體(如氫氣,甲烷,二氧化碳等);有些細(xì)菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣.例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣;傷寒桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,不能分解乳糖;普通變形桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,不能分解乳糖.發(fā)酵培養(yǎng)基含有蛋白胨,指示劑(溴甲酚紫),倒置的德漢氏小管和不同的糖類.當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時,溴甲酚紫指示劑可由紫色(pH6.8)變?yōu)辄S色(pH5.2).氣體的產(chǎn)生可由倒置的德漢氏試管中有無氣泡來證明.

29、0;圖.糖發(fā)酵試驗A. 培養(yǎng)前的情況;B. 培養(yǎng)后產(chǎn)酸不產(chǎn)氣; C. 培養(yǎng)后產(chǎn)酸產(chǎn)氣(三)器材1.菌種 大腸桿菌,普通變形桿菌斜面各一支。2.培養(yǎng)基 葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管各3支(內(nèi)裝有倒置的德漢氏小試管)。3.儀器或其他用具 試管架,接種環(huán)等。(四)操作步驟1.用記號筆在各試管外壁上分別標(biāo)明發(fā)酵培養(yǎng)基名稱和所接種的細(xì)菌菌名。2.取葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管3支,分別接入大腸桿菌,普通變形桿菌,第三支不接種,作為照.另取乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管3支,同樣分別接入大腸桿菌,普通變形桿菌,第三支不接種,作為對照。在接種后,輕緩搖動試管,使其均勻,防止倒置的小管進(jìn)入氣泡。3.將接種過和作為對照

30、的6支試管均置37培養(yǎng)2448h。4.觀察各試管顏色變化及德漢氏小管中有無氣泡。（五）實驗報告1.結(jié)果將結(jié)果填入下表."+"表示產(chǎn)酸或產(chǎn)氣,"-"表示不產(chǎn)酸或不產(chǎn)氣糖類發(fā)酵大腸桿菌普通變形桿菌對照葡萄糖發(fā)酵   乳糖發(fā)酵   2.思考題假如某種微生物可以有氧代謝葡萄糖,發(fā)酵試驗應(yīng)該出現(xiàn)什么結(jié)果？ 三、IMViC與硫化氫試驗(一)目的要求了解IMViC與硫化氫反應(yīng)的原理及其在腸道菌鑒定中的意義和方法(二)基本原理IMViC是吲哚(indol test),甲基紅(methy1 red te

31、st),伏一普(Voges-Prokauer test)和檸檬酸鹽(citrate test)四個試驗的縮寫,I是在英文中為了發(fā)音方便而加上的.這四個試驗主要是用來快速鑒別大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes),多用于水的細(xì)菌學(xué)檢查.大腸桿菌雖非致病菌,但在飲用水中若超過一定數(shù)量,則表示受糞便污染.產(chǎn)氣腸桿菌也廣泛存在于自然界中,因此檢查水時要將兩者分開，硫化氫試驗也是檢查腸道桿菌的生化試驗吲哚試驗是用來檢測吲哚的產(chǎn)生.有些細(xì)菌能產(chǎn)生色氨酸酶,分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚和丙酮酸.吲哚與對二甲基氨基苯甲醛結(jié)合,形成紅色的玫瑰吲哚.但并非所有微生物都具有分解色氨酸產(chǎn)

32、生吲哚的能力,因此吲哚試驗可以作為一個生物化學(xué)檢測的指標(biāo)。大腸桿菌吲哚反應(yīng)陽性,產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。甲基紅試驗是用來檢測由葡萄糖產(chǎn)生的有機酸,如甲酸,乙酸,乳酸等.當(dāng)細(xì)菌代謝糖產(chǎn)生酸時,培養(yǎng)基就會變酸,使加入培養(yǎng)基的甲基紅指示劑由橘黃色(pH6.3)變?yōu)榧t色(pH4.2),即甲基紅反應(yīng).盡管所有的腸道微生物都能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生有機酸,但這個試驗在區(qū)分大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌上仍然是有價值的.這兩個細(xì)菌在培養(yǎng)的早期均產(chǎn)生有機酸,但大腸桿菌在培養(yǎng)后期仍能維持酸性pH4,而產(chǎn)氣腸桿菌則轉(zhuǎn)化有機酸為非酸性末端產(chǎn)物,如乙醇,丙酮酸等,使pH升至大約6.因此大腸桿菌為陽性反應(yīng),產(chǎn)氣腸桿菌為陰性反應(yīng)。伏-普試驗是用

33、來測定某些細(xì)菌利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物的能力,如丙酮酸.丙酮酸進(jìn)行縮合,脫羧生成乙酰甲基甲醇,此化合物在堿性條件下能被空氣中的氧氣氧化成二乙酰.二乙酰與蛋白胨中精氨酸的胍基作用,生成紅色化合物,即伏-普反應(yīng)陽性;不產(chǎn)生紅色化合物者為陰性反應(yīng).有時為了使反應(yīng)更為明顯,可加入少量含胍基的化合物,如肌酸等。檸檬酸鹽試驗是用來檢測檸檬酸鹽是否被利用.有些細(xì)菌能夠利用檸檬酸鈉作為碳源,如產(chǎn)氣腸桿菌;而另一些細(xì)菌則不能利用檸檬酸鹽,如大腸桿菌.細(xì)菌在分解檸檬酸鹽及培養(yǎng)基中的磷酸銨后,產(chǎn)生堿性化合物,使培養(yǎng)基的pH升高,當(dāng)加入1%溴麝香草酚藍(lán)指示劑時,培養(yǎng)基就會由綠色變?yōu)樯钏{(lán)色.溴麝香草酚藍(lán)的指示范圍為:pH小于6.0時呈黃色,pH在6.07.0時為綠色,pH大于7.6時呈藍(lán)色. 硫化氫試驗是檢測硫化氫的產(chǎn)生,也是用于腸道細(xì)菌檢查的常用生化試驗.有些細(xì)菌能分解含硫的有機物,如胱氨酸,半胱氨酸,甲硫氨酸等產(chǎn)生硫化氫,硫化氫一遇培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽等,就形成黑色的硫化鉛或硫化鐵沉淀物。以半胱氨酸為例,其化學(xué)反應(yīng)過程如下:CH2SHCHNH2COOH+H2OCH3COCOOH+H2S+NH3H2S+Pb(CH3