1、實驗實驗2 底物濃度對酶活力的影底物濃度對酶活力的影響響米氏常數(shù)的測定米氏常數(shù)的測定一、目的要求一、目的要求1.學(xué)習(xí)分光光度法測定的原理和方法學(xué)習(xí)分光光度法測定的原理和方法2.學(xué)習(xí)和掌握米氏常數(shù)（學(xué)習(xí)和掌握米氏常數(shù)（Km）及最大反應(yīng)速度）及最大反應(yīng)速度（Vm）的測定的原理和方法，測出堿性磷酸）的測定的原理和方法，測出堿性磷酸酶在以對硝基酚磷酸為底物時的酶在以對硝基酚磷酸為底物時的Km 和和Vm值。值。光的互補示意圖光的互補示意圖u 物質(zhì)的顏色和波長：物質(zhì)的顏色和波長：可見光：波長（可見光：波長（）400760nm紫外光：紫外光：小于小于400nm紅外光：紅外光：大于大于760nmu溶液的顏色和

2、光吸收的關(guān)系：溶液的顏色和光吸收的關(guān)系：溶液的顏色，是由于不同的有色物質(zhì)有選擇地吸收某種顏溶液的顏色，是由于不同的有色物質(zhì)有選擇地吸收某種顏色的光而引起的。溶液呈現(xiàn)的顏色是與它主要吸收的光相色的光而引起的。溶液呈現(xiàn)的顏色是與它主要吸收的光相互補的光的顏色。溶液吸收的光越多，呈現(xiàn)的顏色越深?；パa的光的顏色。溶液吸收的光越多，呈現(xiàn)的顏色越深。二、分光光度法（比色分析法）原理和方法二、分光光度法（比色分析法）原理和方法（一）利用吸收光譜對物質(zhì)進(jìn)行定性分析（一）利用吸收光譜對物質(zhì)進(jìn)行定性分析1. 比較吸收光譜曲線比較吸收光譜曲線維生素維生素B12溶液的吸收光譜溶液的吸收光譜2. 比較最大吸收波長比較最

3、大吸收波長 蛋白質(zhì)的最大吸收波長為蛋白質(zhì)的最大吸收波長為280nm； 核酸的最大吸收波長為核酸的最大吸收波長為260nm。3. 比較吸光度的比值比較吸光度的比值 純純DNA：8 . 1280260nmnmAA（二）利用吸收光譜對物質(zhì)進(jìn)行定量分析（二）利用吸收光譜對物質(zhì)進(jìn)行定量分析1原理原理 Beer-Lambert（比爾）定律（比爾）定律：物質(zhì)的吸光度與吸收物質(zhì)的濃度：物質(zhì)的吸光度與吸收物質(zhì)的濃度和液層的厚度成正比。和液層的厚度成正比。當(dāng)一束當(dāng)一束單色光單色光通過溶液后，光被溶液吸收的程通過溶液后，光被溶液吸收的程度（度（A）與溶液的濃度（）與溶液的濃度（C），），液層的厚（液層的厚（L）以及

4、入射光的強(qiáng)度（以及入射光的強(qiáng)度（I0）有）有關(guān)。溶液濃度越大，關(guān)。溶液濃度越大，液層越厚液層越厚，吸光越多，這就是物質(zhì)（均勻透明固體，吸光越多，這就是物質(zhì)（均勻透明固體，液體，氣體）對光的吸收定律。液體，氣體）對光的吸收定律。 T=I/I0= 10-cl A=lg1/T=lgI0/I A=cl 其中：其中：T為透光率，為透光率，A為吸光率，為吸光率，I0為入射光強(qiáng)度，為入射光強(qiáng)度，I為透射光強(qiáng)度，為透射光強(qiáng)度，為摩為摩爾消光系數(shù)，爾消光系數(shù)，C為溶液濃度，為溶液濃度，L為溶液光程的厚度，為溶液光程的厚度，A為光吸收值為光吸收值 2常用方法常用方法（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法）標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品的測定

5、條件必須一致。標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品的測定條件必須一致。（2）標(biāo)準(zhǔn)管法）標(biāo)準(zhǔn)管法 CX/AX=CS/AS，已知，已知CS，測定，測定AS、AX可求得可求得CX。（3）摩爾吸光系數(shù)法）摩爾吸光系數(shù)法 C=A/ L（ 為為L=1cm，C為為1 mol/L時的吸光系數(shù)，時的吸光系數(shù)， 也稱為摩爾吸光系數(shù)也稱為摩爾吸光系數(shù))。三、米氏常數(shù)的測定原理三、米氏常數(shù)的測定原理酶促反應(yīng)v-S曲線 v S 其中S為底物濃度；v為初速度；Vm為最大反應(yīng)速度；Km 為米氏常數(shù) SKSVvmm 米氏常數(shù)Km是酶的一個基本特征常數(shù)，它包含著酶與底物結(jié)合和解離的性質(zhì)。特別是同一種酶能夠作用于幾種不同底物時，米氏常數(shù)Km往往可以反

6、映出酶與各種底物的親和力的強(qiáng)弱。 測定Km和Vm，可通過作圖法求得。 最常用的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法。這個方法是將米氏方程轉(zhuǎn)化為倒數(shù)形式，即： 以1/v對1/S作圖，可得一條直線mmmVSVKv111 1/v 1/Vm -1/Km 1/Sw本實驗測定堿性磷酸酶催化對硝基酚磷酸鈉鹽(pNPP)水解的Km和Vm.w反應(yīng)式：pNPP+H2O pNP+HPO42- 無色 黃色 可通過分光光度法測定產(chǎn)物pNP的含量，求出反應(yīng)速度v。 四、試劑與器材四、試劑與器材試劑： 0.5mol/mL pNP 、10 mmol/L pNPP、20 mmol/L MgCl2、0.1 mol/L 碳酸

7、鈉碳酸氫鈉 pH 10.1緩沖液、0.1 mol/L NaOH、6 g/mL堿性磷酸酶酶液器材：恒溫水浴鍋、分光光度計五、操作方法五、操作方法（一）（一）對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取13支試管編號,0號一支,16號各二支,按下表操作： 管 號 0 1,1 2,2 3,3 4,4 5,5 6.6 pNP含量 (mol) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.5mol/mL pNP (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 H2O (mL) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 Na2CO3-NaHCO3

8、(mL) 各管加入1.0 mL 20 mmol/L MgCl2 (mL) 各管加入0.2 mL 0.1 mol/L NaOH (mL) 各管加入2.0 mL A 405 w以對硝基苯酚的絕對量(mol數(shù))為橫坐標(biāo)，A405值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求出pNP的克分子消光系數(shù)()值。（二）測定（二）測定（按下表操作）（按下表操作） 取取15支試管，支試管，15做兩組平行測定管，做兩組平行測定管，0105作為空白對照。作為空白對照。 No. 1,1,01 2 ,2,02 3,3,03 4,4,04 5,5,05 底物終濃度底物終濃度S (mM ) 0.5 0.75 1.0 1.5 3 10 mmo

9、l/L pNPP（mL ） 0.1 0.15 0.2 0.3 0.6 蒸餾水（蒸餾水（mL ） 0.60 0.55 0.50 0.40 0.10 碳酸鹽緩沖液（碳酸鹽緩沖液（mL ） 各加各加1.0 mL 20 mmol/L MgCl2 （mL） 各加各加0.2 mL 預(yù)熱預(yù)熱 混勻，混勻，37，5分鐘分鐘 酶液（酶液（mL ） 測定管測定管各加各加0.10 mL酶液（空白管不加）酶液（空白管不加） 反應(yīng)時間反應(yīng)時間 37，精確反應(yīng)，精確反應(yīng)10分鐘分鐘 0.1 mol/L NaOH（mL） 各加各加2 mL 酶液（酶液（mL ） 空白管空白管(0105)各補加各補加0.10 mL酶液酶液 A

10、405（三）（三） 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理 各管在分光光度計測定波長各管在分光光度計測定波長405nm的的A值值(A405)。從對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出。從對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出A405相當(dāng)相當(dāng)于產(chǎn)物對硝基苯酚的含量于產(chǎn)物對硝基苯酚的含量( mol數(shù)數(shù)),計算出各種計算出各種底物濃度下的初速度底物濃度下的初速度vo（單位以（單位以 mol L-1 min-1表示），取倒數(shù)表示），取倒數(shù)1/v填入表內(nèi)。以填入表內(nèi)。以1/v對對1/S作圖，作圖，求出酶催化求出酶催化pNPP水解的米氏常數(shù)水解的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)和最大反應(yīng)速度速度Vm。實驗數(shù)據(jù)處理實驗數(shù)據(jù)處理表1 “底物濃度對酶活力的影響底物濃度對

11、酶活力的影響”實驗數(shù)據(jù)實驗數(shù)據(jù) 樣品樣品 1 2 3 4 5 底物濃度底物濃度S (mM) A405 pNP含量含量 （ mol） V0( mol L-1 min-1） 1/V 1/S 樣品樣品 1 2 3 4 5 底物濃度底物濃度S (mM) A405 1/A405 1/S六、六、 注意事項注意事項取液量一定要準(zhǔn)確。取液量一定要準(zhǔn)確。反應(yīng)時間一定要精確。反應(yīng)時間一定要精確。加酶前后一定要將試劑混勻。加酶前后一定要將試劑混勻?？瞻讓φ找欢ㄒ燃涌瞻讓φ找欢ㄒ燃覰aOH，后加酶。，后加酶。測定測定A405時要以各自的空白調(diào)零點。時要以各自的空白調(diào)零點。移液管或移液管或取液器的使用取液器的使用比

12、色杯的使用比色杯的使用1.分光光度計分光光度計樣池數(shù)：樣池數(shù)：3管號1122 33 44 55 加酶時間（min）0.5m1m 1.5m2m2.5m3m3.5m4m4.5m5m加NaOH時間10.51111.51212.51313.5 1414.515反應(yīng)時間（min）10101010101010101010七、思考題七、思考題(1) 試說明的米氏常數(shù)Km的物理意義和生物學(xué)意義。(2) 為什么說的米氏常數(shù)Km是酶的一個特征常數(shù)而Vm則不是？ 八、分光光度計的使用八、分光光度計的使用u比色杯的使用比色杯的使用uT6新世紀(jì)紫外可見光分光光度計的使用新世紀(jì)紫外可見光分光光度計的使用 uUnico UV-2000分光光度計的使用分光光度計的使用儀器操作鍵介紹“方式設(shè)定”鍵（MODE）：用于設(shè)置測試方式 透射比（T）、吸光度（A）、已知樣品濃度值（C）、已知標(biāo)準(zhǔn)樣品斜率（F）“100%”鍵：用于自動調(diào)整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)“0%”鍵：用于自動調(diào)整零透射比“波長設(shè)置”旋鈕：用于設(shè)置分析波長3.樣品測試操作 打開電源開關(guān)，使儀器預(yù)熱20分鐘 用“波長設(shè)置”按鈕將波長設(shè)置在您將要使用的分析波長位置上按“方式鍵”（MODE）將測試方式設(shè)置為透射