1、 菌種是從事微生物學(xué)及生命科學(xué)研究的基本材料，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，診斷制品的制備，菌苗的生產(chǎn)、微生物致病性研究，藥物的抑菌試驗(yàn)及藥品微生物檢驗(yàn)等都有一套完整的菌種. .微生物具有生命活力，在傳代過(guò)程中易發(fā)生變異甚至死亡，因此菌種保藏是一項(xiàng)重要的基礎(chǔ)工作，是微生物學(xué)基礎(chǔ)工作的一項(xiàng)重要內(nèi)容，也是藥品微生物工作中的一項(xiàng)常用技術(shù)。 一、菌種保藏的意義 如藥品中的控制菌檢查使用的陽(yáng)性對(duì)照菌須防止因多次傳代而使陽(yáng)性對(duì)照菌的典型生物學(xué)特征發(fā)生變化及菌株的死亡，保證達(dá)到菌種長(zhǎng)期正確的形態(tài)； 如藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)過(guò)程中，檢出的可疑致病菌須妥善保藏，以達(dá)到進(jìn)一步鑒定的目的，保證用藥安全。許多國(guó)家都已建立了專(zhuān)門(mén)的菌種保藏機(jī)

2、構(gòu)，如美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所（ATCC）、英國(guó)的國(guó)立標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所（NCTC）、還有全球性的世界菌種保藏聯(lián)合會(huì)（WFCC）。 二、菌種代號(hào)的意義 國(guó)內(nèi)藥品微生物檢驗(yàn)所用的菌種代號(hào)是 CMCC（F）或 CMCC（B） CMCC 中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心 B (Bacteria)代表細(xì)菌， F (Fungi)代表真菌。 大腸埃希菌 CMCC (B) 44102 乙型副傷寒沙門(mén)桿菌 CMCC (B) 50094 銅綠假單胞菌 CMCC (B)10104 金黃色葡萄球菌 CMCC (B)26003 生孢梭菌 CMCC(B)64941 枯草芽孢桿菌 CMCC(B)63501 短小芽孢桿菌 CMCC(B)6320

3、2 白色念珠菌 CMCC(F)98001 黑曲霉 CMCC(F)98003三、常用菌種保藏方法(一) 菌種保藏的原理 根據(jù)微生物的菌種生理、生化特性，在人工創(chuàng)造的條件下盡量降低微生物細(xì)胞的代謝強(qiáng)度，使細(xì)胞基本處于休眠狀態(tài)，生長(zhǎng)繁殖受到抑制但又不至于死亡，以減低菌種的變異率。低溫、干燥、缺氧、缺乏營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境條件都有抑制微生物的代謝作用。 低溫、干燥、真空是用于菌種保藏的重要手段。 選擇保藏方法時(shí)，首先應(yīng)考慮方法能否長(zhǎng)期地保持菌種原有的特性，同時(shí)也應(yīng)兼顧到方法的經(jīng)濟(jì)和簡(jiǎn)便。在實(shí)際工作中，往往多種條件同時(shí)使用,以提高保藏效果。（二）菌種保藏步驟挑選特征典型的單個(gè)菌落；確定保藏的合適菌體形態(tài)；選擇最適

4、宜的保藏方法；定期對(duì)保藏菌種進(jìn)行檢查，觀察是否發(fā)生變化，若有變化，須改變保藏方法。保藏期滿(mǎn)應(yīng)及時(shí)進(jìn)行移種。1.1.瓊脂斜面低溫保存法 （1）方法：將經(jīng)常使用的菌種的典型菌落接種在斜面（某些特殊菌種可用液體培養(yǎng)基）上，按規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)，待充分生長(zhǎng)后，把培養(yǎng)好的新鮮菌種用牛皮紙包好，可將菌種保藏管的棉花塞換成橡膠塞，以減緩培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，延長(zhǎng)保藏時(shí)間。放在4左右的冰箱中保藏。每隔 23個(gè)月移種一次，繼續(xù)進(jìn)行保藏。若用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，一般可保藏半年至一年，有的甚至更長(zhǎng)時(shí)間。 （2）適用范圍：細(xì)菌、霉菌、酵母菌保藏。大腸桿菌斜面 藤黃微球菌斜面 生孢梭菌 白色念珠菌需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)

5、基 改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面不同培養(yǎng)時(shí)間的生長(zhǎng)形態(tài)黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面典型斜面正面為黑褐色厚絨狀，色澤均一，不應(yīng)有雜色；斜面?zhèn)让鏌o(wú)色，接近菌層培養(yǎng)基略帶黃色。黑曲霉孢子相當(dāng)穩(wěn)定，可以保存于4 0.9%氯化鈉溶液中較長(zhǎng)時(shí)間，作為孢子懸液儲(chǔ)備液使用。由此可以減少菌液制備工作量和反復(fù)操作黑曲霉的風(fēng)險(xiǎn)。各類(lèi)菌種保藏條件及時(shí)間菌 種培 養(yǎng) 基保存溫度傳 種 時(shí) 間細(xì) 菌一般多用于營(yíng)養(yǎng)瓊脂或根據(jù)菌種規(guī)定選用培養(yǎng)基46芽孢桿菌36個(gè)月，其它細(xì)菌每個(gè)月酵母菌一般用麥芽汁瓊脂或麥芽汁酵母膏瓊脂46一般46個(gè)月絲狀真菌一般用PDA瓊脂、蔡氏瓊脂或麥芽汁瓊脂等46每 4 個(gè) 月 移 植 一 次（每

6、2個(gè)月移植一次）（3）特點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便，易于推廣；一般不需要另選擇保藏用培養(yǎng)基；對(duì)大多數(shù)微生物都適用。 缺點(diǎn)是保藏期較短；傳代次數(shù)多易發(fā)生變異及污染。（4）注意事項(xiàng)： 實(shí)驗(yàn)用的菌種應(yīng)是生命活力旺盛的新鮮培養(yǎng)物，至少應(yīng)是第三代的培養(yǎng)物。 生孢梭菌可用庖肉培養(yǎng)基或硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（前者效果更佳）。 必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌種管的棉塞是否松動(dòng)或生霉，如有異常應(yīng)及時(shí)處理。 每次移植后，應(yīng)與原菌種的編號(hào)、名稱(chēng)逐一核對(duì)，確證培養(yǎng)基特征和純度無(wú)誤后再繼續(xù)保藏。 保藏菌種的培養(yǎng)基應(yīng)無(wú)糖，若含糖，一般小于 2 %為宜，以免產(chǎn)酸過(guò)多，影響菌種存活。 保藏溫度和時(shí)間都不是絕對(duì)的，個(gè)別菌種不宜

7、低溫保存。如銅綠假單胞菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，不宜用本法保存。 2、液體石蠟保存法： 本法是用液體石蠟將培養(yǎng)物與空氣隔絕，以降低菌種的生理生化水平，并可防止水分蒸發(fā)，從而延長(zhǎng)菌種的保藏期。（1）方法： 將菌種接種于斜面或穿刺于0.3 0.5 %瓊脂半固體高層培養(yǎng)基中，培養(yǎng)好備用。 取化學(xué)純的液體石蠟裝在試管中，每管1015ml，加塞，瓶口包上紙，121高壓滅菌30min，取出置37溫箱或 110 170 烤箱中 1 2 h 或干燥器內(nèi)除去液體石蠟中的水分。 將上述液體石蠟加入培養(yǎng)好的菌種試管內(nèi)，液體石蠟液面以高出培養(yǎng)基最上端 1 為宜，將試管直立，放入4冰箱中保藏。 適用范圍：適用于保

8、藏部分霉菌，酵母菌和放線菌，對(duì)細(xì)菌保藏效果較差。 液體石蠟對(duì)各類(lèi)菌種保藏效果菌 種菌株數(shù)保存時(shí)間（年）存活率（%）細(xì)菌霉菌酵母菌放線菌87586400380552420.983.688.991.3各類(lèi)菌種保藏條件及時(shí)間（3）特點(diǎn)： 本方法簡(jiǎn)便易行，是實(shí)驗(yàn)室常用的一種保藏方法，該法主要使菌種與空氣隔絕。（4）注意事項(xiàng)： 1. 保藏時(shí)，用新鮮培養(yǎng)物接種，應(yīng)檢查純度和特征 后，方可進(jìn)行保藏。 2. 使用菌種時(shí)，先將菌種管傾斜使液體石蠟流至一邊，再用接種針挑取培養(yǎng)物接種到新鮮斜面上培養(yǎng)，待長(zhǎng)出新培養(yǎng)物后，再移種一次到新斜面上即可使用。 3. 將沾有少量液體石蠟的接種針浸于95%酒精中片刻，再燒灼滅菌，

9、以免直接在酒精燈下燒灼時(shí)，液體石蠟四濺，引起污染。 4. 液體石蠟在菌種管中高出培養(yǎng)基的高度要嚴(yán)格控制，如太多，會(huì)影響菌種交換氣體，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，將縮短保藏期。一般以高出斜面1 為宜。 5. 制備無(wú)菌液體石蠟時(shí)，每管裝量不能太多，否則分裝到菌種培養(yǎng)基中易造成污染。 半固體瓊脂培養(yǎng)基（0.5%） 液體石蠟保存 3、其他保存方法簡(jiǎn)介 干燥保藏法 懸液保藏法 液氮保藏法 梭-氏真空干燥保藏法 真空干燥保藏法 冷凍干燥保藏法 標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏管四、試驗(yàn)用菌種的培養(yǎng)傳代方法程序： 凍干菌（0代）營(yíng)養(yǎng)肉湯復(fù)蘇（1代）接種（斜面或肉湯2代） 菌種傳代（3、4、5代） 5 5代后銷(xiāo)毀 檢定

10、用標(biāo)準(zhǔn)菌種，由中國(guó)藥品生物檢定所提供，為冷凍干燥菌種。 菌種的復(fù)蘇與保存在專(zhuān)用無(wú)菌室或超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。 1 菌種的復(fù)蘇 參考流程：把凍干菌種管、滅菌滴管、雙碟、鑷子、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、滅菌生理鹽水、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面數(shù)支，移入接種室或凈化工作臺(tái)。先用砂輪將凍干菌種安瓶頸部挫出刻痕,再將凍干菌種管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用75% 乙醇棉擦凈，放在滅菌雙碟內(nèi)，待干。點(diǎn)燃酒精燈，將菌種管的封口一端在火焰上，燒灼紅熱，用滅菌滴管吸取滅菌生理鹽水，滴在灼熱的菌種管封口一端，使驟冷而炸裂。 取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口打開(kāi)，放入滅菌雙碟內(nèi)，另取1支滅菌滴管，在火焰旁吸取營(yíng)養(yǎng)肉湯少許，加至菌種管底部，將凍

11、干菌攪動(dòng)促使溶解，隨即吸出管內(nèi)菌液，接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯內(nèi)，并將滴管及菌種管投入消毒液內(nèi)，將已接種的營(yíng)養(yǎng)肉湯置3537培養(yǎng)2224 h。 取出培養(yǎng)物，接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面于35353737培養(yǎng)222224h24h，取出后仔細(xì)觀察菌苔形態(tài)、有無(wú)雜菌、涂片、革蘭氏染色鏡檢，呈典型菌落后，轉(zhuǎn)種3 代即可應(yīng)用。如發(fā)現(xiàn)菌型不典型，可進(jìn)行平板分離單菌落。 2 菌種的傳代與保存 方法（1）： 菌斜面 菌斜面（保存） 培養(yǎng)基應(yīng)新鮮制備，如斜面已無(wú)冷凝水者，不宜再使用。標(biāo)簽上著名菌名及接種日期。至冰箱取出的菌種斜面，應(yīng)在室溫放置約30分鐘，待溫度平衡后再移入接種室或超凈工作臺(tái)。 點(diǎn)燃酒精燈，用左手握住菌種斜面，將管口靠

12、近火焰旁，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅30秒，隨后將全部接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過(guò)3次。左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手用無(wú)名指、小指及掌部夾住管塞，撥開(kāi)管塞，將接種環(huán)伸人管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷卻再移至菌苔上，刮取少量菌苔，隨即取出接種棒，并將菌種管口移至火焰旁。 堵上管塞，左手將菌種管放下，取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面1支，照上述操作打開(kāi)棉塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂斜面的低部，由底向上，將接種環(huán)輕貼斜面的表面曲折移動(dòng)，使細(xì)菌劃在斜面的表面上。 取出接種棒，在火焰旁將培養(yǎng)基管管塞堵上，然后將接種過(guò)細(xì)菌的接種棒在火焰上燒灼滅菌。 將已接種畢的細(xì)菌管置3537培養(yǎng)2224小時(shí)，霉菌管一

13、般置2025霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7日。取出后放人冰箱保存，一般 3個(gè)月轉(zhuǎn)種一次。 斜面接種時(shí)的無(wú)菌操作(1)接種滅菌 (2)開(kāi)啟試管塞 (3)管口滅菌 (4)挑起菌苔 (5)接種 (6)塞好試管塞 方法2：菌斜面 營(yíng)養(yǎng)肉湯 分離平板 菌斜面 如果菌落形態(tài)不典型可純化，按下列方法傳代（分離菌落） ： 用接種環(huán)取上述菌管（斜面）菌苔少許接種置營(yíng)養(yǎng)肉湯中(已滅菌), 置3537培養(yǎng)1824小時(shí)后，再用接種環(huán)取培養(yǎng)好的營(yíng)養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液），接種于分離平板，置3537培養(yǎng)1824小時(shí)，用接種針選典型菌落劃線于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，置3537培養(yǎng)1824小時(shí)。一般同時(shí)接種幾支管，其中一支用于以后菌種傳代或接種到半

14、固體瓊脂培養(yǎng)基中，其它用做工作菌種。 平板劃線分離法 1.斜線法 2.曲線法 3.方格法 4.放射法 5.四格法常用分離平板： 大腸埃希菌EMB瓊脂平板 紫黑色有金屬光澤，表面光滑，圓形，凸起銅綠假單胞菌溴化十六烷三甲銨瓊脂培養(yǎng)基扁平，無(wú)定形，周邊擴(kuò)散，表面濕潤(rùn)，灰白色，周?chē)兴{(lán)綠色素?cái)U(kuò)散l金黃色葡萄球菌甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基l金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有黃色環(huán)l沙門(mén)菌SS瓊脂平板l無(wú)色，透明或半透明，光滑濕潤(rùn)的圓形菌落 顯微鏡檢查 將菌種作革蘭氏色，在顯微鏡下觀察 制片步驟：涂片干燥固定染色鏡檢 革蘭氏染色步驟：初染媒染脫色復(fù)染 制好片后先用低倍鏡再用油鏡觀察 革蘭氏色陽(yáng)性菌為紫色 革

15、蘭氏色陰性菌為紅色細(xì)菌涂片制作1.涂片：取清潔玻片一張，取12環(huán)生理鹽水在玻片上，滅菌接種環(huán)后，取少許菌苔于鹽水中研磨成乳濁狀，并涂成1平方厘米左右的菌膜，若用液體培養(yǎng)物涂片，可直接涂，不用加生理鹽水。2.干燥：最好自然干燥，必要時(shí)可將標(biāo)本面朝上，小心在酒精燈火焰高空處烘干，但勿靠近火焰外層，以免烤焦。3.固定：手持玻片一端，標(biāo)本面向上，在外層火焰上以鐘擺速度來(lái)回通過(guò)次。目的使菌體粘附更牢，并使染料更容易進(jìn)入菌體。革蘭氏染色 1.初染：滴加結(jié)晶紫染液12滴于標(biāo)本菌膜上。1min后，用水沖洗，并傾去玻片上的余水。 2.媒染：加革蘭氏碘液12滴于菌膜上，1min后，用水沖洗，傾去玻片上余水。 3.

16、脫色：加95酒精12滴于菌膜上，輕輕晃動(dòng)玻片，直到不再有紫色脫出為止，約0.5min，用水沖洗，傾去玻片上余水。 4.復(fù)染：加稀釋石炭酸復(fù)紅12滴于菌膜上，1min后，用水沖洗，傾去玻片上余水。用吸水紙輕輕吸干，待標(biāo)本干燥后，用油鏡觀察。 注意事項(xiàng)： 1.涂片時(shí)，菌膜應(yīng)薄而均勻。 2.用水沖洗時(shí)，水流不宜直接沖在菌膜上。 3.革蘭氏染色結(jié)果受多種因素影響，如細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間，染色技術(shù)等。染色中應(yīng)特別注意掌握好脫色時(shí)間，不宜過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短，否則結(jié)果不準(zhǔn)確。一般選用1624h培養(yǎng)物為宜。 4.油鏡清潔時(shí)，先用拭鏡紙蘸取少量乙醚：酒精（3：1）擦拭，再用干凈拭鏡紙擦拭。 大腸埃希菌：革蘭氏陰性，短小桿菌 沙

17、門(mén)菌：革蘭氏陰性，桿菌 銅綠假單胞菌：革蘭氏陰性，桿菌 金黃色葡萄球菌：革蘭氏陽(yáng)性，葡萄串狀球菌金黃色葡萄球菌大腸埃希菌3 菌懸液的制備 取上述培養(yǎng)好的菌種斜面移入接種室或凈化工作臺(tái)，放置室溫后, 用接種環(huán)取菌苔少許接種置營(yíng)養(yǎng)肉湯中（已滅菌），將已接種畢的細(xì)菌管置3537培養(yǎng)1824小時(shí)，取出備用。一般于冰箱中保存可用7天。4 對(duì)照用菌液制備 取上述培養(yǎng)好的營(yíng)養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液）1ml，加到9ml 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液混勻，為10-1，再取另一只吸管吸取10-1菌液1 ml加到9ml 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液混勻，為10-2 以此類(lèi)推，稀釋至含活菌數(shù)在 50 100 cfu。用平板計(jì)數(shù)。菌種

18、菌種工作菌種培養(yǎng)基菌懸液對(duì)照菌液大腸桿菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面營(yíng)養(yǎng)肉湯0.9%氯化鈉溶液沙門(mén)菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面營(yíng)養(yǎng)肉湯0.9%氯化鈉溶液金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面營(yíng)養(yǎng)肉湯0.9%氯化鈉溶液銅綠假單胞菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面營(yíng)養(yǎng)肉湯0.9%氯化鈉溶液生孢梭菌硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基0.9%氯化鈉溶液白色念珠菌真菌瓊脂斜面真菌培養(yǎng)基0.9%氯化鈉溶液五、菌種保管 菌種保管應(yīng)有專(zhuān)人負(fù)責(zé)，保存于加鎖的冰箱中或特制的白鐵箱中加鎖置陰暗處，確保菌種安全。因工作變動(dòng)時(shí)，必須做好交接工作。 菌種應(yīng)有詳細(xì)登記本，包括名稱(chēng)、分離日期、鑒定日期、鑒定者、主要鑒定性能，并注意記錄使用、轉(zhuǎn)移及銷(xiāo)毀情況和原因。 各種菌種應(yīng)按規(guī)定

19、時(shí)間定期移種。一般每移種3次后作一次全面鑒定。注意菌種有無(wú)污染和變異，如發(fā)現(xiàn)污染和變異時(shí)，應(yīng)及時(shí)更換。 購(gòu)置菌種，應(yīng)有介紹信。全部保存菌種應(yīng)具備清單，并定期向部門(mén)負(fù)責(zé)人報(bào)告。 由于驗(yàn)證試驗(yàn)中包括黑曲霉菌，在轉(zhuǎn)種或洗菌時(shí)應(yīng)注意關(guān)閉無(wú)菌室或超凈工作臺(tái)的抽風(fēng)機(jī)并在酒精燈火焰旁操作，以免菌孢子飛揚(yáng)。從事微生物檢查的工作人員也應(yīng)該注意個(gè)人防護(hù)，避免由操作不當(dāng)而導(dǎo)致的生物危險(xiǎn)。除生物危險(xiǎn)外，還應(yīng)加強(qiáng)微生物檢查的安全管理。六、實(shí)驗(yàn)常用檢定菌的購(gòu)買(mǎi) 0代凍干菌種：中國(guó)生物制品檢定所 2代菌種：各省市藥品檢驗(yàn)所（一般為營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面或凍存管，保存期短，應(yīng)在購(gòu)買(mǎi)后自行傳代并采用適宜方法保存）大腸桿菌斜面 藤黃微球菌斜面黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面不同培養(yǎng)時(shí)間的生長(zhǎng)形態(tài) 將上述液體石蠟加入培養(yǎng)好的菌種試管內(nèi)，液體石蠟液面以高出培養(yǎng)基最上端 1 為宜，將試管直立，放入4冰箱中保藏。 適用范圍：適用于保藏部分霉菌，酵母菌和放線菌，對(duì)細(xì)菌保藏效果較差。 標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏管 1 菌種的復(fù)蘇 參考流程：把凍干菌種管、滅菌滴管、雙碟、鑷子、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、滅菌生理鹽水、營(yíng)