1、核酸適配體及其在檢測領(lǐng)域中的應用(學號姓名南京師范大學化學與材料科學學院摘要:核酸適配體是一段DNA或者RNA序列,是利用體外篩選技術(shù)指數(shù)級富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)從核酸分子文庫中得到的寡核苷酸片段,該片段能與目標分子作用產(chǎn)生特殊的構(gòu)象形式,對目標分子具有高度親和力和專一的識別能力。核酸適配體通常由化學合成,不依靠生物;價格便宜;且易于保存;而且標記后的核酸適配體一般與目標分子的結(jié)合力不會改變。因此基于核酸適配體的生化檢測技術(shù)到人們極大的關(guān)注1。本文基于對核酸適配體的基本了解,通過對SELEX技術(shù)及對核酸適配體在檢測領(lǐng)域中的研究進展的了解做了簡單的概述。關(guān)鍵詞:核酸適配體,檢測0 引言核酸適配體是

2、寡核苷酸DNA或RNA,長度一般為20-80個核苷酸,它對很廣范圍內(nèi)的物質(zhì)都具有極強的親和性能和特異性能,這些物質(zhì)如藥物類、蛋白質(zhì)類、碳水化合物、氨基酸、類脂、有機分子或者是無機分子類以及其它的小分子。核酸適配體的出現(xiàn),使抗原抗體的反應發(fā)生了革命性的變化,它大大彌補了現(xiàn)有抗體的不足,也為傳統(tǒng)免疫傳感器發(fā)展開辟了一條新的道路。2SELEX技術(shù)即指數(shù)級富集配基系統(tǒng)進化技術(shù)。利用該技術(shù)可以從隨機單鏈核酸序列庫中篩選出特異性與靶物質(zhì)高度親和的核酸適體(Aptamer。自Tuerk 等首先運用此技術(shù)篩選到特異性吸附噬菌體T4DNA聚合酶和有機染料分子的特異寡核苷酸配基后,經(jīng)過十幾年的發(fā)展,SELEX技術(shù)

3、已經(jīng)成為一種重要的研究手段和工具。1 發(fā)現(xiàn)核酸適配體的技術(shù)SELEX技術(shù)核酸適配體,是指一小段能與相應配體專一性緊密結(jié)合的寡核苷酸序列,一般由幾十個核苷酸組成,可以是DNA也可以是RNA,最早是由Tuerk和Gold 發(fā)現(xiàn)的。1990年,Tuerk等提出了一種新的體外篩選和擴增核酸的方法,命名為SELEX(指數(shù)級富集配體系統(tǒng)進化,利用該方法他們成功地篩選出能夠特異性結(jié)合T4DNA聚合酶的RNA寡核苷酸。但當時他們并沒有對這種RNA寡核苷酸進行命名,只是稱其為配基。核酸適配體這一概念是由Ellington和Szostak提出的。同年,Ellington等同樣利用SELEX技術(shù)成功篩選出了能夠與汽

4、巴克隆藍、活性藍4發(fā)生特異性結(jié)合的RNA,命名為aptamer(適配體,它來源于拉丁語aptus,意思為“合適”。兩年后,他們再次利用SELEX技術(shù)篩選到了一種單鏈DNA適配體。從以上開創(chuàng)性的工作來看,核酸適配體的發(fā)現(xiàn)在于SELEX技術(shù)的提出。3SELEX技術(shù)利用大容量的隨機寡核苷酸文庫與靶分子的相互作用,從中篩選出與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸并結(jié)合體外PCR擴增技術(shù),使其得到指數(shù)級富集。如此循環(huán)數(shù)輪最終進化成為高親和力和高特異性的寡核苷酸配體。SELEX 技術(shù)大致可分為以下幾步:建庫;篩選、分離、擴增;適配子的修飾。自1990年Tuerk和Gold首次利用該技術(shù)成功地從隨機RNA文庫中篩選出與

5、噬菌體T4DNA 聚合酶高特異性和高親和力結(jié)合的寡核苷酸配基以來,已成功應用于許多靶分子的篩選,包括金屬離子、有機染料、藥物、氨基酸、細胞因子、輔因子、氨基糖苷、抗生素、核苷酸和多肽等。4近年來,隨著一些改良SELEX體外篩選技術(shù)的不斷出現(xiàn)和應用,如切換SELEX,加尾SELEX、CE-SELEX、FluMag-SELEX、微流體SELEX等,使得適配子篩選效率大大提高,極大地拓展了適配子技術(shù)在有害物質(zhì)檢測、新藥研發(fā)、藥物傳遞系統(tǒng)的設(shè)計、生物成像、臨床治療等領(lǐng)域的應用空間。其檢測范圍也由蛋白質(zhì)、酶等大分子物質(zhì),擴展到毒素、金屬離子、有機染料、農(nóng)藥等外源性小分子污染物。52 核酸適配體傳感器2.

6、1電化學傳感器電化學傳感器主要依靠氧化還原探針得失電子時產(chǎn)生的電信號來實現(xiàn)目標物的檢測。核酸適配體能與多種目標物質(zhì)高特異性、高選擇性地結(jié)合,因此被廣泛應用于生物傳感器領(lǐng)域。當核酸適配體與目標物質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合時,核酸適配體自身的構(gòu)型會隨之發(fā)生變化。研究者把核酸適配體應用為探針,開發(fā)了很多基于核酸適配體的構(gòu)型變化的電化學傳感器,又稱為E-AB(Electrochemical aptamer-based傳感器,與電化學檢測方法的結(jié)合使之具備便攜化、操作簡單、成本低等特點,所以E-AB傳感器提高了核酸適配體在傳感器領(lǐng)域的應用。將核酸適配體探針應用到E-DNA傳感器的設(shè)想最早是在2003年的美國科學院

7、院刊(PNAS論文中提出,并于2005年在Plaxco 實驗室實現(xiàn)。該傳感器將一段能夠特異性和凝血酶結(jié)合的DNA序列(即凝血酶核酸適配體兩端分別修飾一個巰基和一個亞甲基藍基團,利用巰基和金之間的共價結(jié)合,將凝血酶核酸適配體組裝到金電極表面。在待測樣品中無凝血酶時,核酸適配體呈松散的單鏈狀態(tài),末端的亞甲基藍基團處于一定程度的自由狀態(tài),有機會接觸到金電極表面,繼而發(fā)生有效的電子傳遞過程,此時可以檢測到一定的法拉第電流信號;當有目標物質(zhì)凝血酶存在的時候,核酸適配體和凝血酶特異性結(jié)合,核酸適配體構(gòu)型發(fā)生變化,末端修飾的MB 基團和電極之間的距離發(fā)生變化,導致法拉第電流減小。利用這種信號電流的減小,可以

8、靈敏檢測到6.4nmol/L凝血酶,而且通過實驗證明該探針不但可以重復利用,而且可以應用于血清樣品的實際檢測。這種傳感策略有很多類似的應用,例如Radi等利用類似策略成功檢測了0.1mmol/L K+;Lai 等使用E-AB策略成功檢測了50pmol/L血小板源性生長因子。6根據(jù)是否采用標記物(酶、納米粒子和氧化還原分子對適配體進行修飾以產(chǎn)生檢測信號,電化學核酸適配體傳感器可分為標記型和非標記型。標記型核酸適配體傳感器的標記過程復雜、費用高,而且會在一定程度上影響適配體與目標分子的結(jié)合親和力。因此,構(gòu)建簡單、價廉和靈敏的非標記型電化學核酸適配體傳感器具有重要意義。聚硫堇具有良好的氧化還原可逆性

9、和穩(wěn)定性,近年來被用于免疫傳感器、酶傳感器、DNA傳感器和化學傳感器中作為優(yōu)異的電子介體。Ahammad等利用聚硫堇對鄰苯二酚和對苯二酚的催化氧化作用構(gòu)建了簡單、高靈敏度同時測定二者的化學傳感器。金納米粒子(GNPs具有比表面積大、吸附能力強和生物相容性好等優(yōu)點,可將生物分子有效地固定在其表面,用于構(gòu)建生物傳感器可提高靈敏度和穩(wěn)定性,已在電化學生物傳感器中得到廣泛的應用。用電聚合法制備了聚硫堇氧化還原電化學探針,以金納米粒子為固定核酸適配體的載體構(gòu)建了非標記型核酸適配體傳感器。用電化學阻抗譜對傳感器的組裝過程進行了監(jiān)測,用循環(huán)伏安法和差分脈沖伏安法考察了傳感器的電化學行為。結(jié)果表明,該傳感器對

10、凝血酶的檢測在1.0pg/mL500pg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.998,檢出限為0.38pg/mL。該傳感器制備簡單、靈敏度高且抗干擾能力強。72.2 光學傳感器熒光檢測方法的有效性已經(jīng)被廣泛證實。量子點或者半導體納米顆粒是熒光納米材料的一種,具有集中獨特的光學特性。Levy等首次將適配體與量子點結(jié)合在一起,通過能量的轉(zhuǎn)化對凝血酶進行監(jiān)測。在研究工作中,他們將標記了量子點的適配體與標記了猝滅物質(zhì)的DNA進行雜交。加入凝血酶,量子點接近猝滅物質(zhì),使能量由量子點向猝滅物傳遞,從而使得量子點的熒光信號被截斷;當凝血酶存在時,凝血酶和適配體相互作用,導致帶有猝滅物的互補鏈釋放,使量

11、子點恢復了熒光信號。Strano等引研制了另外一種量子點適配體傳感器,他們用量子點標記凝血酶的適配體,當凝血酶存在時,它與適配體相互作用并且靠近量子點,電荷由凝血酶轉(zhuǎn)移到量子點,從而產(chǎn)生熒光。這種傳感器非常敏感,其檢測限為1nmoL/L,并且有較高的選擇性。Liu等啪3用量子點和金納米顆粒(Au nanoparticle,AuNP對腺嘌呤核苷和可卡因進行了復合檢測。實驗分為兩組,一組將光吸收峰為525 am的量子點和標記AuNP的腺嘌呤核苷適配體結(jié)合;另一組將光吸收峰為585 nm的量子點和標記AuNP的可卡因適配體結(jié)合在一起。結(jié)果顯示:兩組實驗最初組裝體上的熒光都是猝滅的,加入腺嘌呤核苷和可

12、卡因,二者與適配體相互作用,量子點-納米金顆粒聚合物會被拆裝,能量就由各自的量子點向AuNP轉(zhuǎn)移,以致于在525nm或585nm時熒光信號增強,并且能夠在兩種波長時觀察到熒光的增強。作為一種適配體傳感器模型體系,適配體或者脫氧核酶還可以結(jié)合到微流控設(shè)備上,這種設(shè)備具有低流量輸出的優(yōu)點,而且檢測材料的消耗也較少,有再生性能。依賴于Pb2+的脫氧核酶結(jié)合了神經(jīng)細胞黏著分子(neural cell adhesion molecule,NCAM后,在微流體設(shè)備的基礎(chǔ)上,每次檢測Pb2+消耗4.2PL脫氧核酶,檢測限為11nmoL/L。Li等將AuNP固定在微流控芯片的管道中,將一端含巰基另一端標記熒光

13、基團的適配體溶液通入管道中。適配體上的巰基與AuNP 結(jié)合后,適配體成拱狀結(jié)構(gòu),發(fā)生熒光猝滅,當通入互補適配體溶液后,雙鏈互補,適配體成直鏈狀結(jié)構(gòu),熒光基團與AuNP之間距離發(fā)生改變,從而恢復熒光。AuNP的適配體熒光探針在微流控方面的交叉應用有很好的發(fā)展前景。8比色傳感器的設(shè)計比較簡單,不需要對適配體進行固載,其中最常用的比色探針為金納米粒子,原因為金納米的分散度容易受到環(huán)境的影響,進而產(chǎn)生顏色的轉(zhuǎn)變。Zheng等基于比色方法,利用納米金和RNA核酸適配體對多巴胺進行檢測,檢測原理為:納米金會在高濃度的氯化鈉溶液中發(fā)生聚集,當溶液中存在單鏈的核酸適配體時,適配體會吸附在納米金表面阻止納米金的

14、聚集。然而當溶液中存在適配體的靶目標時,適配體會從納米金的表面脫落下來與靶目標結(jié)合,而納米金對適配體一靶目標復合物沒有結(jié)合力。這時納米金發(fā)生聚集,顏色由紅色變?yōu)樗{色,從而實現(xiàn)對多巴胺濃度的檢測。Song等同樣利用比色方法實現(xiàn)了對藥物卡那徽素的檢測。2.3共振傳感器表面等離子共振(surface plasmon resonance,SPR是指在光波的作用下,在金屬和電介質(zhì)的交界面上形成的改變光波傳輸?shù)闹C振波。當光以大于全反射的入射角射到交界面上時,有一部分光被反射,另一部分光被耦合進等離子體內(nèi),在表面等離子中存在光的消失波。如果入射光的波矢量沿著平行于界面的分量和表面等離子波的波矢量相等,表面等

15、離子在光的作用下發(fā)生諧振,光波在傳輸過程中發(fā)生能量的損失,表現(xiàn)為光波的強烈吸收,這種現(xiàn)象稱為等離子體的諧振。由此現(xiàn)象設(shè)計制作的SPR傳感器通常將一種具有特異性識別功能的分子即配體固定于金屬表面,監(jiān)控溶液中的被分析物和該配體相結(jié)合的過程,在復合物形成或解離的過程中,觀察金屬膜表面溶液的折射率變化,從而達到檢測靶物質(zhì)的目的。共振光散射作為一種新型分析技術(shù),因其靈敏度高、使用簡便和應用面廣而引起了人們的廣泛關(guān)注,在物理化學、膠體化學和高分子化學研究中有十分重要的地位,并在生物分子分析中得到了研究和應用。研究表明,納米金的聚集程度與共振光散射信號存在密切關(guān)系，納米金顆粒越聚集共振光散射信號越強，納米

16、金顆粒越分散共振光散射信號越弱。Li 等利用巰基化寡核苷酸功能化金納米顆 粒， 通過與目標寡核苷酸序列互補雜交實現(xiàn)了納米金聚集組裝，然后測定共振光 散射信號的大小實現(xiàn)了對特定序列 DNA 的均相快速檢測。 將納米探針技術(shù)、 核酸適配體識別與共振光散射檢測技術(shù)有機結(jié)合，以腺苷 為模式分析物， 通過均相腺苷與其特異結(jié)合核酸適配體識別反應，使形成網(wǎng)絡(luò)聚 集結(jié)構(gòu)的金納米結(jié)構(gòu)解聚，引起共振光散射信號強烈變化?；诖?，建立了均相 體系中核酸適配體識別的腺苷新型檢測方法。 該方法對腺苷檢測的濃度線性范圍 為 0.1-10molL，檢測限為 0.04molL（3S/N） 。該方法對腺苷的檢測靈敏度 高、選擇性

17、好，鳥苷、胸苷、胞苷、尿苷等對檢測不產(chǎn)生干擾。9 3 核酸適配體檢測識別技術(shù)具體應用舉例 3.1 核酸適配體識別熒光法檢測 OTA 將核酸適配體識別技術(shù)與高靈敏熒光分析方法結(jié)合，建立了檢測 OTA 的新 方法。采用固定的核酸適配體識別目標 OTA 分子，通過與核酸適配體互補雜交 的熒光標記 DNA 短鏈的解離引起的熒光信號變化來定量分析目標分子，涉及的 適配體及 FAM 標記的適配體互補鏈可預先在微孔板上組裝好，測定時只需將樣 品簡單處理直接加樣反應即可。 反應結(jié)束后略沖洗即可檢測熒光信號， 具有簡單、 靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點，已成功應用于實際樣品中 OTA 的檢測。10 3.2 核酸適配體識別熒光

18、法檢測汞離子 通過對 Ni2+的 RNA 適體進行改造，期望獲得兩條原本針對 Ni2+起作用的 DNA 適體，即 DNA1-B(N1。但實驗表明，N1 對 Ni2+不起作用，對 Hg2+卻有較 強的結(jié)合作用。核酸適體標記有熒光基團 FAM，再與標記有熒光猝滅基團 DABCYL 的一段互補序列結(jié)合，通過加入 Hg2+與互補序列競爭結(jié)合適體而引起 的熒光信號變化，可定量分析 Hg2+。據(jù)此可設(shè)計出多種寡核苷酸的 Hg2+檢測方 法，如熒光信號轉(zhuǎn)換法、膠體金檢測法、熒光染料法；但均是采用核苷酸鏈中的 胸腺嘧啶（T）可與汞配位的原理構(gòu)筑器件，其核苷酸一級序列單一，二級結(jié)構(gòu) 簡單甚至無二級結(jié)構(gòu)。本研究表

19、明，與 Hg2+有作用的適體 N1 與此前所使用的多 數(shù)適體結(jié)構(gòu)不同；對 N1 序列和結(jié)構(gòu)進行改造，得到與 H92+作用更靈敏的新適 體 N5。本方法只需將樣品簡單處理直接加樣反應即可，且樣品用量少，適用于 實際樣品中 Hg2+的檢測。11 4 總結(jié) 作為一種特異性的識別分子， 核酸適配體因穩(wěn)定性高、 靶目標廣泛備受關(guān)注。 盡管在理論上講， 只要寡核苷酸的隨機序列庫的庫容量足夠大，可以篩選出任何 靶目標對應的核酸適配體。 基于核酸適配體的光學傳感技術(shù)操作簡便、 選擇性好， 靶物質(zhì)范圍非常廣泛：金屬離子、有機分子、核酸、多肽、蛋白、細胞、細胞聚 集體、亞細胞器、大分子聚集物、新鮮分離到的整塊組織

20、或體外培養(yǎng)的組織等， 理論上都可以通過 SELEX 技術(shù)篩選到其相應適配體設(shè)計相應的核酸適配體傳感 器實現(xiàn)檢測。 雖然核酸適配體光生化傳感器向我們展示了非常廣闊的應用前景。 但這類光 生化傳感器也存在著很多缺陷： 與靶物質(zhì)形成復合體及熒光物質(zhì)修飾這類熒光檢 測方法主要是基于核酸適配體與靶物質(zhì)作用之后產(chǎn)生的熒光偏振度或是熒光強 度的改變來實現(xiàn)檢測。 隨著納米科技的飛速發(fā)展， 許多生物相容性好、低毒性的納米材料和核酸適 配體相結(jié)合，有望用來進一步提高適配體傳感器的實用性能。 參考文獻 1李瑜,王源升,于斌,張靜秋,董瑞等.核酸適配體在光生化檢測中的應用J.廣州 化工,2012,40(14:1-3. 2李艷芬.電化學核酸