1、準(zhǔn)備工作：1、進(jìn)入細(xì)胞室前，首先用75%酒精擦試工作臺，接著紫外滅菌30-50min，過后，關(guān)閉紫外燈，通風(fēng)10min。2、從冰箱中取出胰酶、PBS緩沖液、培養(yǎng)基開紫外時即將當(dāng)天實驗所用物品拿出，室溫放置一段時間注意事項：1、所有實驗用的器械，儀器滅菌，消毒，烘干。2、打開溶劑，培養(yǎng)瓶瓶蓋時，瓶口及瓶蓋在酒精燈上烤一下。3、用完溶劑，培養(yǎng)瓶時，瓶口及瓶蓋也要在酒精燈上烤一下。開始工作：1、實驗前換衣帽，開風(fēng)淋，吹風(fēng)。2、75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下臺面，點燃酒精燈。3、取待用的細(xì)胞，旋緊瓶蓋。4、棄去舊的培養(yǎng)液，把培養(yǎng)瓶放回原處。5、取移液管一支，塞棉花端，及管身，均在酒精燈上烤一下

2、，套好吸球。6、用移液管加入適量的PBS緩沖液，緩慢蕩洗一下細(xì)胞，然后將PBS緩沖液棄掉。7、用移液管（微量槍）吸取適量胰酶約2ml（所用胰酶的量），棄掉槍頭。8、將細(xì)胞置于5%CO2、37度培養(yǎng)箱中1min-2min，目的：提高酶活性，促進(jìn)消化。9、取待用細(xì)胞，取移液管一支，塞棉花端，及管身，均在酒精燈上烤一下，套好吸球。10、用移液管加入適量的完全培養(yǎng)液沖洗（吹散細(xì)胞）細(xì)胞，將瓶底粘著的細(xì)胞吹散下來，再將細(xì)胞懸液移入的離心管中，封口，標(biāo)簽。11、離心5min，1000轉(zhuǎn)/min。以下分別介紹：一 換液1、取待用的細(xì)胞，旋緊瓶蓋。2、棄去舊的培養(yǎng)液，把培養(yǎng)瓶放回原處。3、取移液管一支，塞棉花

3、端，及管身，均在酒精燈上烤一下，套好吸球。4、用移液管加入適量的PBS緩沖液，緩慢蕩洗一下細(xì)胞，然后將PBS緩沖液棄掉。5、取移液管一支，塞棉花端，及管身，均在酒精燈上烤一下，套好吸球。6、用移液管加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液于培養(yǎng)瓶中。7、將細(xì)胞置于5%CO2、37度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。二 傳代1、細(xì)胞離心畢，拆封，瓶口及瓶蓋在酒精燈上烤一下，棄去上清液，吸取已配制的培養(yǎng)基適量，加入離心管中，將細(xì)胞重懸、吹勻。2、取4-6滴細(xì)胞懸液到新的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶中應(yīng)先加好適量細(xì)胞培養(yǎng)液，吹散細(xì)胞，鏡下觀察，細(xì)胞密度適宜則置入5%CO2、37度細(xì)胞培養(yǎng)箱中。三 凍存1、細(xì)胞離心畢，拆封，瓶口及瓶蓋在酒精燈上烤一下，棄

4、去上清液。2、按胎牛血清：DMSO=9:1的比例配制凍存液，裝入青霉素瓶中。3、用移液管將凍存液平均加入離心管中，混勻離心管中細(xì)胞凍存液。4、用移液管將含細(xì)胞的凍存液移入凍存管中，封口，標(biāo)簽。5、凍存，需緩慢凍存，先放置4度冰箱1小時，然后放置-20度冰箱2小時，再置于-80度冰箱過夜，最后置于液氮灌中保存。四 種板1、細(xì)胞離心畢，拆封，瓶口及瓶蓋在酒精燈上烤一下，棄去上清液。2、取培養(yǎng)瓶及小燒杯各一只，擺放好。3、取移液管一支，塞棉花端，及管身，均在酒精燈上烤一下，套好吸球。4、先移取2ml，5ml，20ml完全培養(yǎng)液,分別加入到離心管，培養(yǎng)瓶，小燒杯中。5、混勻離心管中含完全培養(yǎng)液的細(xì)胞，

5、再從離心管中取適量細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)瓶，吹散細(xì)胞。鏡下觀察，細(xì)胞密度適宜則置入5%CO2、37度細(xì)胞培養(yǎng)箱中。（細(xì)胞傳代目的）6、取細(xì)胞計數(shù)板，蓋玻片酒精擦拭，均在酒精燈上烤一下，用微量槍從小燒杯中取出細(xì)胞懸液（約10l），棄掉槍頭，滴入蓋玻片下（不能有氣泡，不然會影響細(xì)胞計數(shù)），鏡下觀察細(xì)胞數(shù)（每個象限5個細(xì)胞，總和20個細(xì)胞，5×104個），不斷調(diào)整小燒杯中細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度，直至鏡下觀察細(xì)胞數(shù)目符合要求。7、取1個96孔板，用酒精棉繞96孔板邊緣處擦拭一周，孔板蓋在酒精燈上烤一下。8、用微量槍從小燒杯中取出細(xì)胞懸液（約100l），依次滴入96孔板中（槍頭至孔下1/3處），同時用移

6、液槍吸取完全培養(yǎng)液（約100l）作為對照或調(diào)零，邊緣孔用無菌PBS填充。9、滴完后，仍用酒精棉繞96孔板邊緣處擦拭一周。10、將96孔板置于5%CO2、37度細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。五 MTT實驗1、接種細(xì)胞：用含10胎牛血清的培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔100010000個細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積100l。2、稱取3mg MTT粉末，加6ml完全培養(yǎng)液，配制成濃度5%的MTT溶液，0.22m的微孔濾膜除菌。3、培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)35天（可根據(jù)試驗?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時間）。4、培養(yǎng)35天后，取出96孔板，用酒精棉繞96孔板邊緣處擦拭一周，孔板蓋在酒精燈上烤一下。5、用（120l

7、）移液槍小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液（包括調(diào)零孔內(nèi)的培養(yǎng)上清液），棄去槍頭。再用移液槍按每孔100l加MTT溶液也包括調(diào)零孔，但邊緣孔除外（槍頭在孔上1/3處）。6、呈色：繼續(xù)孵育4小時，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150l DMSO，置搖床上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。7、比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。六 復(fù)蘇1、準(zhǔn)備工作：開啟恒溫水浴鍋，將溫度調(diào)節(jié)在37，取一離心管，加入5ml細(xì)胞培養(yǎng)基。2、取出凍存管，立即放入水浴鍋中快速搖晃，讓凍存液迅速融化。3、用酒精棉球擦洗凍存管外部以降低污染機會。4、打開凍存管，將凍存液小心轉(zhuǎn)移到預(yù)先加入有培養(yǎng)基的離心管中，800rpm離心5分鐘。5、小心棄掉上清，加入約5ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。6、將所得細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)瓶中，蓋上瓶塞，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。換液，傳代實驗用材：牛奶瓶2個-PBS緩沖液，DMEM培養(yǎng)基血清瓶1個-胰蛋白酶換液：移液管2個傳代：培養(yǎng)瓶1個，移液管3個，離心管1