1、細(xì)胞形態(tài)研究方法細(xì)胞形態(tài)研究方法一、顯微技術(shù)一、顯微技術(shù) 熒光顯微鏡熒光顯微鏡熒光顯微鏡和普通顯微鏡有以下的區(qū)別：熒光顯微鏡和普通顯微鏡有以下的區(qū)別：1.1. 照明方式通常為落射式，即光源通過物鏡投射于樣品上；照明方式通常為落射式，即光源通過物鏡投射于樣品上；2.2. 光源為紫外光，波長(zhǎng)較短，分辨力高于普通顯微鏡；光源為紫外光，波長(zhǎng)較短，分辨力高于普通顯微鏡；3.3. 有兩個(gè)特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和有兩個(gè)特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護(hù)人目。物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護(hù)人目。q 暗視野顯微鏡暗視野顯微鏡暗視野顯微鏡（暗視野

2、顯微鏡（dark field microscopedark field microscope）的聚光鏡中央的聚光鏡中央有擋光片，使照明光線不直接進(jìn)人物鏡，只允許被標(biāo)本反射有擋光片，使照明光線不直接進(jìn)人物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。利用這種顯微鏡能見到小至緣是亮的。利用這種顯微鏡能見到小至 4-200 4-200nmnm的微粒子，的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高分辨率可比普通顯微鏡高5050倍。倍。q 倒置顯微鏡倒置顯微鏡組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，組成和普通顯微鏡一樣，

3、只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺(tái)之下，后者在載物臺(tái)之上，用于觀察培養(yǎng)的活前者在載物臺(tái)之下，后者在載物臺(tái)之上，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，通常具有相差物鏡。細(xì)胞，通常具有相差物鏡。在裝配設(shè)計(jì)上趨于采用組合方式，集普通光鏡加相差、在裝配設(shè)計(jì)上趨于采用組合方式，集普通光鏡加相差、熒光、暗視野、熒光、暗視野、DICDIC、攝影裝置于一體，從而操作靈活，使用攝影裝置于一體，從而操作靈活，使用方便。方便。q 激光共聚焦掃描顯微鏡激光共聚焦掃描顯微鏡 負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé)人 羅禹羅禹 電話：電話：8265507782655077激光共聚焦掃描顯微鏡（激光共聚焦掃描顯微鏡（laser confocal scanning

4、 laser confocal scanning microscopemicroscope）用用激光作掃描光源激光作掃描光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個(gè)物鏡，物鏡的掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個(gè)物鏡，物鏡的焦點(diǎn)即掃描激光的聚焦點(diǎn)，也是瞬時(shí)成像的物點(diǎn)。由于激焦點(diǎn)即掃描激光的聚焦點(diǎn)，也是瞬時(shí)成像的物點(diǎn)。由于激光束的波長(zhǎng)較短，光束很細(xì)，所以共焦激光掃描顯微鏡有光束的波長(zhǎng)較短，光束很細(xì)，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通光學(xué)顯微鏡的較高的分辨力，大約是普通光學(xué)顯微鏡的3 3倍。系統(tǒng)經(jīng)一次倍。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個(gè)

5、平面內(nèi)，調(diào)焦深度不一樣時(shí)，調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個(gè)平面內(nèi)，調(diào)焦深度不一樣時(shí)，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲(chǔ)就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)內(nèi)，通過計(jì)算機(jī)重新組合，就能顯示細(xì)胞樣品的于計(jì)算機(jī)內(nèi)，通過計(jì)算機(jī)重新組合，就能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)，給出細(xì)胞內(nèi)各部分之間的定量關(guān)系及各種結(jié)構(gòu)立體結(jié)構(gòu)，給出細(xì)胞內(nèi)各部分之間的定量關(guān)系及各種結(jié)構(gòu)線度。線度。物鏡物鏡弧光燈弧光燈熒光濾光鏡熒光濾光鏡聚焦光圈聚焦光圈目鏡目鏡濾光鏡濾光鏡激光器激光器檢測(cè)針孔檢測(cè)針孔光源針孔光源針孔光電倍增管光電倍增管熒光顯微鏡的工作原理熒光顯微鏡的工作原理激光掃描共聚焦顯微鏡的工作原理

6、激光掃描共聚焦顯微鏡的工作原理濾光鏡濾光鏡物鏡物鏡熒光濾光鏡熒光濾光鏡 激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)，也可以激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)，也可以用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計(jì)以及細(xì)胞形態(tài)的用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計(jì)以及細(xì)胞形態(tài)的定量。定量。激光器的特點(diǎn)激光器的特點(diǎn): : 1) 1) 方向性好方向性好: : 激光基本沿直線傳播。激光基本沿直線傳播。 2) 2) 單色性好單色性好: : =10-8=10-8nmnm。 3) 3) 高高 亮亮 度度: : 激光方向性好激光方向性好, , 其在空間上的能量分布是高其在空間上的能量分布是高度集中的。度集

7、中的。 4) 4) 偏偏 振振 性性: : 激光為平面偏振光激光為平面偏振光, , 光纖耦合。光纖耦合。激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計(jì)特點(diǎn)：激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計(jì)特點(diǎn)： 1) 1)點(diǎn)照明點(diǎn)照明 2) 2)具有照明具有照明pinholepinhole和探測(cè)和探測(cè)pinholepinhole 3) 3)照明照明pinholepinhole和探測(cè)和探測(cè)pinholepinhole共軛共軛( (共焦共焦), ), 共焦點(diǎn)即被探共焦點(diǎn)即被探測(cè)點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)所在的平面為共焦平面測(cè)點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)所在的平面為共焦平面 4) 4)具有掃描系統(tǒng)具有掃描系統(tǒng) 逐點(diǎn)掃描成像逐點(diǎn)掃描成像 5) 5)具有多個(gè)（四個(gè)）具有多個(gè)（四

8、個(gè)） 熒光通道，可同時(shí)探測(cè)多個(gè)被標(biāo)記物熒光通道，可同時(shí)探測(cè)多個(gè)被標(biāo)記物 激光共聚焦顯微鏡的應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡的應(yīng)用q 單、雙、三單、雙、三, ,四色標(biāo)記檢測(cè)。四色標(biāo)記檢測(cè)。q 精確的一、二、三、四維觀察。精確的一、二、三、四維觀察。q 高品質(zhì)的熒光成像、透射成像、物體表面反射成像。高品質(zhì)的熒光成像、透射成像、物體表面反射成像。q 靜態(tài)和動(dòng)態(tài)觀察靜態(tài)和動(dòng)態(tài)觀察( (CACA2+2+,pH,pH,膜電位膜電位, ,膜流動(dòng)性等膜流動(dòng)性等) )。q 定性以及定量分析。定性以及定量分析。q 特殊的光反應(yīng)特殊的光反應(yīng)( (FREP,FRAP,CAGED-UNCAGEDFREP,FRAP,CAGED-UN

9、CAGED等等) )。細(xì)胞內(nèi)自由基的變化細(xì)胞內(nèi)自由基的變化細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)NONO的變化的變化細(xì)胞膜蛋白相互作用細(xì)胞膜蛋白相互作用 掃描電子隧道顯微鏡掃描電子隧道顯微鏡二、顯微操作技術(shù)二、顯微操作技術(shù)顯微操作技術(shù)（顯微操作技術(shù)（micromanipulation techniquemicromanipulation technique）是指是指在高倍復(fù)式顯微鏡下，利用顯微操作器進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎在高倍復(fù)式顯微鏡下，利用顯微操作器進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法。顯微操作器是用以控制顯微注射針在顯微操作的一種方法。顯微操作器是用以控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動(dòng)的機(jī)械裝置。鏡視野內(nèi)移動(dòng)的機(jī)械裝置。三

10、、圖像分析系統(tǒng)三、圖像分析系統(tǒng) 主要用于照片、實(shí)物、組織切片、細(xì)胞爬片等組織化學(xué)取主要用于照片、實(shí)物、組織切片、細(xì)胞爬片等組織化學(xué)取圖和灰度分析。圖和灰度分析。免疫組織化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源免疫組織化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源MAPKp42MAPKp42蛋白表達(dá)蛋白表達(dá)E 172174176178180182184186188190192Hela細(xì)胞p42MAPK表達(dá)的灰度值CKLPsiRNA-1siRNA-2siRNA-3三、激光顯微切割技術(shù)三、激光顯微切割技術(shù) 第四節(jié)第四節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)一、細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件一、細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件 無菌操作室、超凈工作臺(tái)（生物安全柜）、倒置顯微鏡、無菌操作室、超

11、凈工作臺(tái)（生物安全柜）、倒置顯微鏡、COCO2 2培培養(yǎng)箱、消毒設(shè)備、超聲清洗儀、烤箱、離心機(jī)、蒸餾水器（超純養(yǎng)箱、消毒設(shè)備、超聲清洗儀、烤箱、離心機(jī)、蒸餾水器（超純水）、液氮罐、冰箱、濾器以及天平等。水）、液氮罐、冰箱、濾器以及天平等。 相關(guān)設(shè)備：流式細(xì)胞儀、微板測(cè)試系統(tǒng)。相關(guān)設(shè)備：流式細(xì)胞儀、微板測(cè)試系統(tǒng)。二、細(xì)胞培養(yǎng)的基本知識(shí)二、細(xì)胞培養(yǎng)的基本知識(shí)培養(yǎng)細(xì)胞的基本概念培養(yǎng)細(xì)胞的基本概念原代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)：直接從活體組織中分離出細(xì)胞，在培養(yǎng)條件下傳直接從活體組織中分離出細(xì)胞，在培養(yǎng)條件下傳1 1至至1010代代的培養(yǎng)方法。原代培養(yǎng)一般不能傳代太多，否則培養(yǎng)細(xì)胞會(huì)走向衰的培養(yǎng)方法。原代培養(yǎng)一般

12、不能傳代太多，否則培養(yǎng)細(xì)胞會(huì)走向衰老死亡。老死亡。傳代培養(yǎng)：傳代培養(yǎng)：經(jīng)過一定處理，細(xì)胞適應(yīng)在體外條件下連續(xù)傳代的培養(yǎng)經(jīng)過一定處理，細(xì)胞適應(yīng)在體外條件下連續(xù)傳代的培養(yǎng)方法。方法。 細(xì)胞株（細(xì)胞株（ cell line ）：）：一般可傳一般可傳4040至至5050代的細(xì)胞。代的細(xì)胞。 細(xì)胞系（細(xì)胞系（ cell strain ）：）：細(xì)胞株經(jīng)過轉(zhuǎn)化后可傳細(xì)胞株經(jīng)過轉(zhuǎn)化后可傳5050代以上或代以上或無限傳代的細(xì)胞。無限傳代的細(xì)胞。原代培養(yǎng)細(xì)胞的生命歸宿原代培養(yǎng)細(xì)胞的生命歸宿n 原代培養(yǎng)期原代培養(yǎng)期n 傳代期傳代期n 衰退期衰退期2.2.培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式和類型培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式和類型 生長(zhǎng)方式：貼

13、附生長(zhǎng)型、懸浮生長(zhǎng)型。生長(zhǎng)方式：貼附生長(zhǎng)型、懸浮生長(zhǎng)型。 類型：上皮樣細(xì)胞、成纖維樣細(xì)胞。類型：上皮樣細(xì)胞、成纖維樣細(xì)胞。3.3.培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn) 細(xì)胞生長(zhǎng)過程存在三個(gè)過程：細(xì)胞生長(zhǎng)過程存在三個(gè)過程：滯留期：滯留期：細(xì)胞接種于新的培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞開始貼壁，細(xì)胞形態(tài)由圓形細(xì)胞接種于新的培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞開始貼壁，細(xì)胞形態(tài)由圓形恢復(fù)原來形態(tài)的時(shí)期。此時(shí)，細(xì)胞尚未進(jìn)入增殖期?；謴?fù)原來形態(tài)的時(shí)期。此時(shí)，細(xì)胞尚未進(jìn)入增殖期。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞增殖旺盛，成倍增長(zhǎng)，活力最強(qiáng)的時(shí)期。適用于實(shí)細(xì)胞增殖旺盛，成倍增長(zhǎng)，活力最強(qiáng)的時(shí)期。適用于實(shí)驗(yàn)研究。驗(yàn)研究。平臺(tái)期：平臺(tái)期：細(xì)胞生長(zhǎng)的底面積

14、被生長(zhǎng)的細(xì)胞占滿，由于接觸抑制而細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)的底面積被生長(zhǎng)的細(xì)胞占滿，由于接觸抑制而細(xì)胞停止增殖的時(shí)期。停止增殖的時(shí)期。4. 4. 細(xì)胞培養(yǎng)的注意事項(xiàng)細(xì)胞培養(yǎng)的注意事項(xiàng) 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞密度、培養(yǎng)基儲(chǔ)存時(shí)間、細(xì)胞培養(yǎng)傳代數(shù)（衰退期）。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞密度、培養(yǎng)基儲(chǔ)存時(shí)間、細(xì)胞培養(yǎng)傳代數(shù)（衰退期）。三、細(xì)胞系建立的方法三、細(xì)胞系建立的方法原代培養(yǎng)的方法原代培養(yǎng)的方法（1 1）組織塊培養(yǎng)法）組織塊培養(yǎng)法（2 2）消化培養(yǎng)法）消化培養(yǎng)法細(xì)胞純化的方法細(xì)胞純化的方法（1 1）自然純化）自然純化（2 2）人工純化）人工純化 酶消化法、差速貼壁法、機(jī)械鏟除法、克隆法、酶消化法、差速貼壁法、機(jī)械鏟除法、克隆法、培養(yǎng)基限定法

15、以及流式細(xì)胞儀分離法。培養(yǎng)基限定法以及流式細(xì)胞儀分離法。四、培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件四、培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件n 細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要n 細(xì)胞的生存環(huán)境細(xì)胞的生存環(huán)境 溫度溫度: 37 : 37 O O2 2 CO CO2 2: 5% CO: 5% CO2 2 +H +H2 2O HO H2 2COCO3 3 H H+ + + HCO + HCO3 3- - pH: 7.2-7.4 pH: 7.2-7.4 滲透壓滲透壓n 無污染無污染n 無毒無毒五、細(xì)胞檢測(cè)五、細(xì)胞檢測(cè) 計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)n 血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞n Coulter Coulter計(jì)數(shù)儀：人工計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)儀：人工

16、計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn)細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn) 單個(gè)細(xì)胞在體外增殖單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6 6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體形成肉眼可見的克隆?？寺⌒纬勺溆脕肀硎炯?xì)胞的增殖體形成肉眼可見的克隆?？寺⌒纬勺溆脕肀硎炯?xì)胞的增殖能力。能力。 n 克隆形成率比克隆形成數(shù)接種細(xì)胞數(shù)克隆形成率比克隆形成數(shù)接種細(xì)胞數(shù)n 缺點(diǎn)：操作繁瑣缺點(diǎn)：操作繁瑣n 優(yōu)點(diǎn)：精確、可靠?jī)?yōu)點(diǎn)：精確、可靠 臺(tái)盼藍(lán)法臺(tái)盼藍(lán)法 活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，用活細(xì)胞占細(xì)胞活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞恬力。中的百分比表示細(xì)胞恬力。 四唑鹽（四唑鹽（MTTMTT）比色法比色法 四唑

17、鹽（四唑鹽（MTTMTT）商品名為噻唑藍(lán)。商品名為噻唑藍(lán)。 四吐鹽比色法的原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還四吐鹽比色法的原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSODMSO）能溶解沉積在能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazanformazan量量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定ODOD值值 MTTMTT法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒牲試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。牲試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。六、細(xì)胞凍存和復(fù)蘇六、細(xì)胞凍存和復(fù)蘇 凍存和復(fù)蘇的原則：凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融慢凍快融 當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶?？扇苄晕镔|(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)