1、病毒的細(xì)胞培養(yǎng) 一一 基本原理基本原理 二二 細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念 三三 主要優(yōu)點(diǎn)主要優(yōu)點(diǎn) 四四 培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品的前期處理培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品的前期處理 五五 培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式及類型培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式及類型 六六 細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)步驟 七七 病毒的細(xì)胞培養(yǎng)病毒的細(xì)胞培養(yǎng)三 分類 原代細(xì)胞培養(yǎng) 傳代細(xì)胞培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng) 概念：從供體獲取組織細(xì)胞后在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)。 優(yōu)點(diǎn)：生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，細(xì)胞染色體仍為二倍體，接近和反映體內(nèi)生長(zhǎng)特性，適合做藥物測(cè)試、細(xì)胞分化及病毒學(xué)方面的實(shí)驗(yàn) 缺點(diǎn)：傳代次數(shù)較多細(xì)胞就會(huì)衰亡。傳代細(xì)胞培養(yǎng) 概念：原代細(xì)胞經(jīng)過(guò)一系列傳代，產(chǎn)生變異

2、，轉(zhuǎn)化為能夠連續(xù)傳代的細(xì)胞。 傳代細(xì)胞可以直接從腫瘤組織獲得，又可以通過(guò)人工馴化獲得。 常用的傳代細(xì)胞：PK-15、IBRS-2、Vero、Marc-145、CHO、MDCK、CRFK、Hela 等 四四 培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品的前期處理培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品的前期處理1.1.清洗和浸泡清洗和浸泡: : (1)玻璃器皿玻璃器皿 (2)塑料器皿塑料器皿2.2.包裝包裝3.3.消毒：在組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中，務(wù)必保消毒：在組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中，務(wù)必保證組織細(xì)胞在無(wú)微生物的條件下生長(zhǎng)。證組織細(xì)胞在無(wú)微生物的條件下生長(zhǎng)。4.4.細(xì)胞培養(yǎng)用液及培養(yǎng)基（液）細(xì)胞培養(yǎng)用液及培養(yǎng)基（液）: : （1 1）水：蒸餾水、）水：蒸餾水、雙蒸

3、水，可高壓除菌。雙蒸水，可高壓除菌。（2 2）平衡鹽溶液（）平衡鹽溶液（PBS)PBS)：PHPH為為7.27.27.47.4，不含鈣鎂離子，不含鈣鎂離子 ， 可高壓除菌。可高壓除菌。（3 3）消化液）消化液 : : 胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的濃度為胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的濃度為0 02525，pHpH值值7.27.2左左右。需過(guò)濾除菌。右。需過(guò)濾除菌。 EDTA液：常用濃度為液：常用濃度為 002，配制時(shí)采用無(wú)，配制時(shí)采用無(wú)Ca2+、Mg2+平衡鹽液溶解，高壓滅菌后即可使用。平衡鹽液溶解，高壓滅菌后即可使用。 (4) 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天然培養(yǎng)基和合

4、成培養(yǎng)基。 天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基： 天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。 優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好 缺點(diǎn)：來(lái)源受限。成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，易發(fā)生支原體污染合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。成本低 缺點(diǎn)： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。 人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)

5、和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。 血清中含有： 多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等） 多種金屬離子 激素 促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。 各種生長(zhǎng)因子 轉(zhuǎn)移蛋白 不明成分 一般說(shuō)來(lái)含5小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加10血清 對(duì)于血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對(duì)血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚 血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。 優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污染。 血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56 ，30

6、分鐘（5）丙酮酸鈉、葡萄糖：）丙酮酸鈉、葡萄糖：是屬碳水化合物的成分，是細(xì)是屬碳水化合物的成分，是細(xì)胞生命的能量來(lái)源。胞生命的能量來(lái)源。（6）抗生素抗生素：最終濃度為青霉素最終濃度為青霉素 100 Uml，鏈霉素，鏈霉素100Uml（青霉素為（青霉素為80萬(wàn)萬(wàn)U瓶，將其溶解于瓶，將其溶解于4ml三蒸三蒸水中，每升培養(yǎng)液中加人水中，每升培養(yǎng)液中加人0.5ml；鏈霉素為；鏈霉素為100萬(wàn)萬(wàn)U瓶，瓶，將其溶解在將其溶解在5ml三蒸水中，每升培養(yǎng)液加三蒸水中，每升培養(yǎng)液加0.5ml）。）。（7）凍存液：二甲基亞砜）凍存液：二甲基亞砜（8）細(xì)胞生長(zhǎng)液：）細(xì)胞生長(zhǎng)液：是用以維持細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的液體。是用以維

7、持細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的液體。其是配方：其是配方： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基 8090 血清血清 10% 雙抗雙抗 100u/ml （9）細(xì)胞維持液：）細(xì)胞維持液：用以維持細(xì)胞緩慢生長(zhǎng)或不死的培養(yǎng)用以維持細(xì)胞緩慢生長(zhǎng)或不死的培養(yǎng)液。液。其是配方：其是配方： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基 95 血清血清 25 雙抗雙抗 100u/ml 五 培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式及類型培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式及類型 貼附生長(zhǎng)型細(xì)胞貼附生長(zhǎng)型細(xì)胞 必須貼附于底物才能生長(zhǎng)的細(xì)胞。從形態(tài)上大體分為上皮細(xì)胞型及成纖維細(xì)胞型，還有一些難以確定其穩(wěn)定形態(tài)的細(xì)胞。 懸浮生長(zhǎng)型細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)型細(xì)胞 不需要附著于底物而于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)。每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)

8、過(guò)程 游離期 貼壁期 潛伏期 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 停止期（平臺(tái)期）貼附生長(zhǎng)型細(xì)胞生長(zhǎng)型細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)常用的培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)常用的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)皿、6孔板、孔板、96孔板孔板懸浮生長(zhǎng)型細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)型細(xì)胞六 細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)步驟1原代細(xì)胞的培養(yǎng) 以雞胚成纖維細(xì)胞為例 （1）取胚 （2）組織處理 （3）消化 （4）分裝、培養(yǎng)（1）取胚 選取9-11日齡SPF雞胚，大頭朝上直立于蛋架上，用碘酒、酒精消毒氣室外殼。用鑷子從氣室端打開(kāi)蛋殼，撕開(kāi)殼膜，用無(wú)菌鑷子輕輕取出雞胚，放入滅菌平皿中。（2）組織處理 用PBS液沖洗胚體2-3次，再將雞胚的頭、爪、內(nèi)臟去除，剩下的胚體在用PBS液沖洗胚體2-3次，然后再放入平

9、皿中，用剪刀將雞胚剪成碎塊。（3）消化 用PBS液充分沖洗組織碎塊2-3次，加入3-5倍量的胰蛋白酶消化液，置37消化10分鐘，每隔2-3分鐘輕輕搖動(dòng)一次。待組織碎塊聚合成團(tuán)，邊緣毛樣模糊時(shí)取出，輕輕吸取上層消化液，加適量DMEM培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打，使細(xì)胞分散。（4）分裝、培養(yǎng) 將細(xì)胞懸液移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入到10ml DMEM，充分混勻，讓細(xì)胞呈單個(gè)形式存在，最后將其放入恒溫箱中培養(yǎng)。2傳代細(xì)胞的培養(yǎng) （1）細(xì)胞的復(fù)蘇 （2）細(xì)胞的傳代 （3）細(xì)胞的換液 （4）細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的觀察 （5）細(xì)胞的凍存（1）細(xì)胞的復(fù)蘇概述概述 復(fù)蘇細(xì)胞與凍存的要求相反，應(yīng)采用快速?gòu)?fù)蘇細(xì)胞與凍存

10、的要求相反，應(yīng)采用快速融化的手段。這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的融化的手段。這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化。避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)時(shí)間內(nèi)即融化。避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損害。胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損害。操作步驟操作步驟 準(zhǔn)備好培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)液和離心管等放于超凈工作臺(tái)內(nèi)。準(zhǔn)備好培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)液和離心管等放于超凈工作臺(tái)內(nèi)。 從保存液氮或低溫冰箱中凍存管（安瓶）的小袋或凍存盒內(nèi)取出的從保存液氮或低溫冰箱中凍存管（安瓶）的小袋或凍存盒內(nèi)取出的凍存管（安瓶）應(yīng)直接投入凍存管（安瓶）應(yīng)直接投入3737溫水中，并輕輕搖動(dòng)令其內(nèi)容盡快融溫水中，并輕輕搖動(dòng)令其

11、內(nèi)容盡快融化?；?。 從從3737水浴中取出凍存管或安瓶，離心水浴中取出凍存管或安瓶，離心1000r1000r1min,1min,用酒精消毒用酒精消毒后開(kāi)啟，用滴管吸出上清液，注入培養(yǎng)液后開(kāi)啟，用滴管吸出上清液，注入培養(yǎng)液1ml1ml充分混勻，轉(zhuǎn)入刻度離充分混勻，轉(zhuǎn)入刻度離心管制成細(xì)胞懸液后低速離心，除去上清液，必要時(shí)再重復(fù)用培養(yǎng)液心管制成細(xì)胞懸液后低速離心，除去上清液，必要時(shí)再重復(fù)用培養(yǎng)液洗一次。洗一次。 用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，接種培養(yǎng)瓶，放入用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，接種培養(yǎng)瓶，放入COCO2 2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)。如果復(fù)蘇時(shí)細(xì)胞密度較高要及時(shí)傳次日更換一次

12、培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)。如果復(fù)蘇時(shí)細(xì)胞密度較高要及時(shí)傳代。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)細(xì)胞數(shù)可以做代。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)細(xì)胞數(shù)可以做10102020倍稀釋，接種密度以倍稀釋，接種密度以5 510105 5 mlml為宜。為宜。（2）細(xì)胞的傳代原理原理 在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后，已基本上飽和（細(xì)胞增值在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后，已基本上飽和（細(xì)胞增值達(dá)到一定密度后），為使細(xì)胞能繼續(xù)生長(zhǎng)，同時(shí)也將細(xì)胞達(dá)到一定密度后），為使細(xì)胞能繼續(xù)生長(zhǎng)，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各將細(xì)胞種保存下去的方法。同時(shí)也是利用培

13、養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過(guò)程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過(guò)程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。操作步驟操作步驟 將長(zhǎng)滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中原來(lái)的培養(yǎng)液棄去。將長(zhǎng)滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中原來(lái)的培養(yǎng)液棄去。 用用1-2ml營(yíng)養(yǎng)液或營(yíng)養(yǎng)液或PBS緩沖液，清洗培養(yǎng)瓶，倒出緩沖液，清洗培養(yǎng)瓶，倒出 加入加入1ml含有含有EDTA的胰酶，清洗五面，倒出的胰酶，清洗五面，倒出 在加入在加入1ml含有含有EDTA的胰酶，當(dāng)看到培養(yǎng)瓶上含有的胰酶，當(dāng)看到培養(yǎng)瓶上含有一兩個(gè)小空斑，也可看到有灰白色渾濁時(shí)，將胰酶倒掉一兩個(gè)小空斑，也可看到有灰白色渾濁時(shí)，將胰酶倒掉

14、加入培養(yǎng)液，用移液管吹洗貼有細(xì)胞的一面，將細(xì)加入培養(yǎng)液，用移液管吹洗貼有細(xì)胞的一面，將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上吹下來(lái)胞從培養(yǎng)瓶壁上吹下來(lái) 然后進(jìn)行傳代然后進(jìn)行傳代消化傳代的步驟消化傳代的步驟（3）細(xì)胞的換液 原理： 當(dāng)細(xì)胞的量很少，未能鋪滿整個(gè)生長(zhǎng)表面，但細(xì)胞培養(yǎng)液的pH值已經(jīng)發(fā)生很大變化；或者是細(xì)胞形態(tài)很差等情況時(shí)，需要給細(xì)胞換液。 操作步驟 （1）吸棄或倒掉培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的舊培養(yǎng)液 （2）加入PBS溶液清洗細(xì)胞瓶五面 （3）加入足量的細(xì)胞生長(zhǎng)液，放入37、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。（4）細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的觀察 原理： 應(yīng)每日或隔日觀察一次細(xì)胞，及時(shí)了解細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量及培養(yǎng)液pH值、污染與否等情況，以便采取相

15、應(yīng)的措施處理。 肉眼觀察 顯微鏡觀察（5）細(xì)胞的凍存 傳代細(xì)胞應(yīng)有充足的凍存儲(chǔ)備。 一則防止細(xì)胞因污染等原因造成細(xì)胞系的絕種。 二則防止細(xì)胞因傳的代次太多，造成細(xì)胞衰老或細(xì)胞發(fā)生變異。細(xì)胞凍存方法 （1）選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用常規(guī)傳代的方法將細(xì)胞制成懸液并計(jì)數(shù)，800-1000r/min離心5min，棄上清。 （2）用細(xì)胞凍存液將沉淀重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至106-107個(gè)/ml，分裝于凍存管，注明細(xì)胞名稱，傳代及凍存日期。 （3）冷凍保存：將凍存管于4放置30min，然后移入-80超低溫冰箱過(guò)夜，再放入液氮罐長(zhǎng)期保存。亦可使用程序降溫劑逐漸降溫，凍存速度先為每分鐘下降速度1-2，當(dāng)溫度達(dá)到-25時(shí)，可調(diào)整下降速度為每分鐘5-10，溫度降至-100時(shí)，再放入液氮罐中長(zhǎng)期保存。七 病毒的細(xì)胞培養(yǎng) 以禽流感感染雞胚成纖維細(xì)胞為例。 （1）病料的處理 （2）病毒分離、繁殖 （3）細(xì)胞病變的觀察 （4）效價(jià)測(cè)定 （5）中和實(shí)驗(yàn)（1）病料的處理 采集疑是感染禽流感禽的心、腦、肺、淋巴結(jié)在含有雙抗的PBS液中研磨，4過(guò)夜，3000r/min離心10min，上清通過(guò)0.22m抽濾（2）病毒分離、繁殖 1 將病毒液稀釋成多個(gè)濃度分別接種在雞胚中，雞胚死亡后收集尿囊液。取效價(jià)最高的尿囊液接種細(xì)胞。 2 將長(zhǎng)成單層致密的雞胚成纖維細(xì)胞液倒掉，用PBS反復(fù)清洗3次，將死亡或脫落