1、1、了解細(xì)菌總數(shù)檢驗(yàn)的意義。、了解細(xì)菌總數(shù)檢驗(yàn)的意義。2、掌握樣品稀釋處理的方法和菌落總數(shù)計(jì)數(shù)的方法、掌握樣品稀釋處理的方法和菌落總數(shù)計(jì)數(shù)的方法3、掌握食品細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定報(bào)告方式。、掌握食品細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定報(bào)告方式。4、熟練無(wú)菌操作技術(shù)。、熟練無(wú)菌操作技術(shù)。實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一 糕點(diǎn)中菌落總數(shù)的測(cè)定糕點(diǎn)中菌落總數(shù)的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?1 1、電熱恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、恒溫水浴鍋、托盤天、電熱恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、恒溫水浴鍋、托盤天平、電爐、吸管、廣口瓶、三角瓶、玻璃珠、平皿、平、電爐、吸管、廣口瓶、三角瓶、玻璃珠、平皿、試管、試管架、酒精燈、均質(zhì)器或乳缽、滅菌刀或試管、試管架、酒精燈、均質(zhì)器或乳缽、滅

2、菌刀或剪刀、滅菌鑷子、剪刀、滅菌鑷子、75%75%酒精棉球、玻璃蠟筆、登酒精棉球、玻璃蠟筆、登記薄記薄 2 2、培養(yǎng)基和試劑：、培養(yǎng)基和試劑：75%75%乙醇、生理鹽水乙醇、生理鹽水( (蒸餾蒸餾水）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。水）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。二、實(shí)驗(yàn)材料二、實(shí)驗(yàn)材料菌落總數(shù)是指食品檢樣經(jīng)過處理菌落總數(shù)是指食品檢樣經(jīng)過處理,在一定條件下培養(yǎng)后在一定條件下培養(yǎng)后(如培基如培基成分、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、成分、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、pH、需氧性質(zhì)等、需氧性質(zhì)等)，所得，所得1mL(g)檢樣檢樣中所含菌落的總數(shù)。中所含菌落的總數(shù)。本方法規(guī)定的培養(yǎng)條件下所得結(jié)果，只包括一群在營(yíng)養(yǎng)瓊脂本方法規(guī)定的培養(yǎng)條件下所得結(jié)果，只

3、包括一群在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)發(fā)育的嗜中溫性需氧的菌落總數(shù)。上生長(zhǎng)發(fā)育的嗜中溫性需氧的菌落總數(shù)。菌落總數(shù)主要作為判定食品被污染程度的標(biāo)志，也可以應(yīng)用菌落總數(shù)主要作為判定食品被污染程度的標(biāo)志，也可以應(yīng)用這一方法觀察細(xì)菌在食品中繁殖的動(dòng)態(tài)，以便對(duì)被檢樣品進(jìn)這一方法觀察細(xì)菌在食品中繁殖的動(dòng)態(tài)，以便對(duì)被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)提供依據(jù)。行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)提供依據(jù)。(一）最先準(zhǔn)備的器材（清洗、烘干、包扎、滅菌）一）最先準(zhǔn)備的器材（清洗、烘干、包扎、滅菌）*8規(guī)格名稱數(shù)量 用途1、500ml三角瓶 1個(gè) 稀釋樣品（配制生理鹽水）2、250ml三角瓶1個(gè) 配制營(yíng)養(yǎng)瓊脂 3、18180mm試管5支 稀釋樣品（9ml）4、

4、1ml移液管 5 支5、直徑為90mm平皿 8套 倒?fàn)I養(yǎng)平板6、250ml量筒 1支7、玻璃珠：直徑約5mm （二）應(yīng)滅菌、消毒的器材（二）應(yīng)滅菌、消毒的器材 剪刀1把 不銹鋼藥匙1把 稱量紙：適量 酒精消毒的器材：吸耳球1個(gè)，滴管膠頭5只 （三）應(yīng)制備的培養(yǎng)基（三）應(yīng)制備的培養(yǎng)基 培養(yǎng)基 總量 所用容器 蒸餾水 1瓶 225ml/瓶 500ml三角瓶 平板計(jì)數(shù)瓊脂 1瓶 150ml/瓶 250ml三角瓶 稀釋水： 每組5支 9ml/支 18180mm試管A.1 A.1 平板計(jì)數(shù)瓊脂（平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agarplate count agar，PCAPCA）培養(yǎng)基）培養(yǎng)基A

5、.1.1 成分胰蛋白胨 5.0 g酵母浸膏 2.5 g葡萄糖 1.0 g瓊 脂 15.0 g蒸餾水 1000 mLpH 7.00.2A.1.2 制法將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH。分裝試管或錐形瓶，121 高壓滅菌15 min。1、檢驗(yàn)程序、檢驗(yàn)程序菌落總數(shù)檢驗(yàn)程序菌落總數(shù)檢驗(yàn)程序：檢樣檢樣做成幾個(gè)適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液做成幾個(gè)適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液選擇選擇2-32-3個(gè)適宜稀釋度個(gè)適宜稀釋度各以各以1ml1ml之量分別入滅菌平皿內(nèi)之量分別入滅菌平皿內(nèi)每皿內(nèi)加入每皿內(nèi)加入46460 0C C適量營(yíng)養(yǎng)適量營(yíng)養(yǎng)瓊脂瓊脂菌落數(shù)菌落數(shù)報(bào)告報(bào)告三、實(shí)驗(yàn)方法三、實(shí)驗(yàn)方法2、檢樣稀釋及培養(yǎng)檢樣稀釋及培養(yǎng)（1

6、）以無(wú)菌操作，將檢樣）以無(wú)菌操作，將檢樣25g（或（或25ml）剪碎以后，放于含有）剪碎以后，放于含有225ml滅菌滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)（瓶?jī)?nèi)預(yù)先置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)（瓶?jī)?nèi)預(yù)先置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。的均勻稀釋液。 固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質(zhì)器中以固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質(zhì)器中以8000100000r/min的速度處理的速度處理1min，做成，做成1：10的均勻稀釋液。的均勻稀釋液。（2）用）用1ml滅菌吸管吸取滅菌吸管吸取1：10稀

7、釋液稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌滅菌生理鹽水或其他稀釋的試管內(nèi)（注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液，下生理鹽水或其他稀釋的試管內(nèi)（注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液，下同），振搖試管混合均勻，做成同），振搖試管混合均勻，做成1：100的稀釋液。的稀釋液。（3）另取）另取1ml的滅菌吸管，按上項(xiàng)操作順序作的滅菌吸管，按上項(xiàng)操作順序作10倍遞增稀釋液，如此每遞倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次，即換用增稀釋一次，即換用1支支1ml滅菌吸管。滅菌吸管。注意：注意：加入檢樣液時(shí)，吸管尖端不要觸及瓶口或試管口外部，也不得觸及管內(nèi)稀加入檢樣液時(shí)，吸管尖端不要觸及瓶口或試管口外部，也

8、不得觸及管內(nèi)稀釋液，并將吸管內(nèi)的液體沿管壁小心流加入，以免增加檢液。釋液，并將吸管內(nèi)的液體沿管壁小心流加入，以免增加檢液。吸管插入檢樣液內(nèi)取樣稀釋時(shí)，插入深度要達(dá)吸管插入檢樣液內(nèi)取樣稀釋時(shí)，插入深度要達(dá)2.5cm以上以上,調(diào)整時(shí)應(yīng)使管尖調(diào)整時(shí)應(yīng)使管尖與容器內(nèi)緊貼與容器內(nèi)緊貼每遞增稀釋一次，即換用另一支每遞增稀釋一次，即換用另一支1ml滅菌吸管滅菌吸管 （4）根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計(jì)，選擇）根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計(jì)，選擇23個(gè)適宜稀釋個(gè)適宜稀釋度，分別在作度，分別在作10倍遞增稀釋的同時(shí)，即以吸取該稀釋度的吸管移倍遞增稀釋的同時(shí)，即以吸取該稀釋度的吸管移1ml

9、稀釋液稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度作兩個(gè)平皿。于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度作兩個(gè)平皿。（5）稀釋液移入平皿后，應(yīng)及時(shí)將涼至）稀釋液移入平皿后，應(yīng)及時(shí)將涼至460C營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基可放置在可放置在（461）0C）水浴鍋內(nèi)保溫）水浴鍋內(nèi)保溫注入平皿注入平皿15ml20mL，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻，同時(shí)將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有勻，同時(shí)將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內(nèi)稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。作空白對(duì)照。（6）等瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置（）等瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置（361）0C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)（恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)（482）h取取出，計(jì)算平

10、板內(nèi)菌落數(shù)目乘以倍數(shù)，即得出，計(jì)算平板內(nèi)菌落數(shù)目乘以倍數(shù)，即得1g（1mL）樣品所含菌落總數(shù)。）樣品所含菌落總數(shù)。 培養(yǎng)基不能觸及平皿口邊沿，加入培養(yǎng)基后可正反兩個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，但不可用培養(yǎng)基不能觸及平皿口邊沿，加入培養(yǎng)基后可正反兩個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，但不可用力過度，以免濺起觸及上蓋。力過度，以免濺起觸及上蓋。檢樣從開始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿，所用時(shí)間不宜超過檢樣從開始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿，所用時(shí)間不宜超過20min瓊脂凝固后，就立即將平板放入培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，以免細(xì)菌蔓延生長(zhǎng)。瓊脂凝固后，就立即將平板放入培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，以免細(xì)菌蔓延生長(zhǎng)。如果把不能立即計(jì)數(shù)，要將平板放入如果把不能立即計(jì)數(shù)，要將平板放

11、入04冰箱中，但不能超過冰箱中，但不能超過24 h。3、菌落計(jì)算方法、菌落計(jì)算方法（1）菌落計(jì)數(shù)方法）菌落計(jì)數(shù)方法 做平板菌落計(jì)數(shù)時(shí)，可用肉眼觀查，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防做平板菌落計(jì)數(shù)時(shí)，可用肉眼觀查，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落總遺漏。在記下各平板的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落總數(shù)。數(shù)。（2）菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告）菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告平板菌落數(shù)的選擇平板菌落數(shù)的選擇 選取菌落數(shù)在選取菌落數(shù)在3030300300之間的平板作為菌落總數(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。一個(gè)稀之間的平板作為菌落總數(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。一個(gè)稀釋度使用兩個(gè)平板，應(yīng)采用兩個(gè)平板平均數(shù)，其中一個(gè)平板有

12、較大片釋度使用兩個(gè)平板，應(yīng)采用兩個(gè)平板平均數(shù)，其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘2 2以代表全皿菌落數(shù)。平皿內(nèi)如有以代表全皿菌落數(shù)。平皿內(nèi)如有鏈狀菌落生長(zhǎng)時(shí)（菌落之間無(wú)明顯界線），若僅有一條鏈，可視為一鏈狀菌落生長(zhǎng)時(shí)（菌落之間無(wú)明顯界線），若僅有一條鏈，可視為一個(gè)菌落數(shù)；如果有不同來(lái)源的幾條鏈，則應(yīng)將每條鏈作

13、為一個(gè)菌落計(jì)。個(gè)菌落數(shù)；如果有不同來(lái)源的幾條鏈，則應(yīng)將每條鏈作為一個(gè)菌落計(jì)。 稀釋度的選擇稀釋度的選擇 應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在3030300300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。若有兩上稀釋度，其生長(zhǎng)的菌落數(shù)均在若有兩上稀釋度，其生長(zhǎng)的菌落數(shù)均在3030300300之間，則視兩者之比之間，則視兩者之比如何來(lái)決定。若其比值小于或等于如何來(lái)決定。若其比值小于或等于2 2，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)；若大于，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)；若大于2 2則報(bào)則報(bào)告其中較小的數(shù)字。告其中較小的數(shù)字。 若所有稀釋度平均菌落數(shù)均大于若所有稀釋度平均菌落數(shù)均大于300300，則應(yīng)按稀釋度

14、最高的平均，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于3030，則應(yīng)按稀釋度最低的平均，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。 若所有稀釋度均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于若所有稀釋度均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于1 1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之。之。 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在3030300300之間，其中一部分大之間，其中一部分大于于300300或小于或小于3030時(shí)，則以最接近時(shí)，則以最接近3030或或300300的平均菌落數(shù)乘

15、以稀釋倍數(shù)報(bào)的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。告之。菌落數(shù)的報(bào)告菌落數(shù)的報(bào)告 菌落數(shù)在菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)，按其實(shí)有數(shù)報(bào)告，大于以內(nèi)時(shí)，按其實(shí)有數(shù)報(bào)告，大于100時(shí)，采用二位時(shí)，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計(jì)算。為了有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計(jì)算。為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)，也可用縮短數(shù)字后面的零數(shù)，也可用10的指數(shù)來(lái)表示。的指數(shù)來(lái)表示。思考題及實(shí)驗(yàn)作業(yè)思考題及實(shí)驗(yàn)作業(yè)食品檢驗(yàn)為什么要測(cè)定細(xì)菌菌落總數(shù)？食品中檢出的菌落總數(shù)是否代表該食品上的所有細(xì)菌數(shù)？為什么？為什么營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基在使用前要保持地（461）的溫度？培養(yǎng)時(shí)為什么要把培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)？在

16、菌落總數(shù)測(cè)定和霉菌、酵母菌的計(jì)數(shù)中，兩者在樣品處理過程中有何不同？列表說(shuō)明？計(jì)數(shù)時(shí)又有何異同處？雙人單面垂直風(fēng)超凈工作臺(tái),潔凈等級(jí)100級(jí)閉合工作臺(tái)面,不銹鋼臺(tái)面材質(zhì)工作區(qū):1360*700*620mm 1. 目的 規(guī)范凈化工作臺(tái)操作與維護(hù)工作，確保儀器正常運(yùn)作。 2. 適用范圍：本實(shí)驗(yàn)方法適用于微生物檢驗(yàn)中凈化工作臺(tái)操作與維護(hù)管理。 3. 檢驗(yàn)人員職責(zé)：負(fù)責(zé)此儀器操作和維護(hù)管理超凈工作臺(tái)的使用、維護(hù)保養(yǎng)與清潔標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程超凈工作臺(tái)的使用、維護(hù)保養(yǎng)與清潔標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 4. 4. 操作及維護(hù)規(guī)程操作及維護(hù)規(guī)程 4.1操作規(guī)程4.1.1使用工作臺(tái)時(shí)，應(yīng)提前50分鐘開機(jī)，同時(shí)開啟紫外殺菌燈，處理操作

17、區(qū)內(nèi)表面積累的微生物，30分鐘后關(guān)閉殺菌燈（此時(shí)日光燈即開啟），啟動(dòng)風(fēng)機(jī)。4.1.2對(duì)新安裝的或長(zhǎng)期未使用的工作臺(tái)，使用前必需對(duì)工作臺(tái)和周圍環(huán)鏡先用超靜真空吸塵器或用不產(chǎn)生纖維的工具進(jìn)行清潔工作，再采用藥物滅菌法或紫外線滅菌法進(jìn)行滅菌處理。4.1.3 操作區(qū)內(nèi)不允許存放不必要的物品，保持工作區(qū)的潔凈氣流流型不受干擾。4.1.4 操作區(qū)內(nèi)盡量避免作用明顯擾亂氣流流型的動(dòng)作。4.1.5 操作區(qū)的使用溫度不可以超過60。 4.2 維護(hù)規(guī)程及維護(hù)方法4.2.1 根據(jù)環(huán)境的潔凈程度，可定期（一般23個(gè)月）將粗濾布（滌綸無(wú)紡布）拆下清洗或給予更換。4.2.2 定期（一般為一周）對(duì)環(huán)境周圍進(jìn)行滅菌工作，同時(shí)經(jīng)常用紗布沾酒精或丙酮等有機(jī)溶劑將紫外線殺菌燈表面擦干凈，保持表面清潔，否則會(huì)影響殺菌效果。4.2.3 當(dāng)加大風(fēng)機(jī)電壓已不能使風(fēng)