1、生物芯片與高通量測(cè)序技術(shù)Honglin Z2012-06-04概述芯片與二代測(cè)序技術(shù)比較芯片與二代測(cè)序聯(lián)合應(yīng)用第三代測(cè)序的發(fā)展基因組學(xué)技術(shù)發(fā)展時(shí)間表生物芯片是傳統(tǒng)點(diǎn)雜交技術(shù)的高通量革命！是把大量已知序列探針集成在同一個(gè)基片上, 經(jīng)過(guò)處理和標(biāo)記的若干靶核苷酸序列與芯片特定位點(diǎn)上的探針雜交, 通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào), 對(duì)生物細(xì)胞或組織中大量的基因信息進(jìn)行分析高通量測(cè)序是傳統(tǒng)sanger技術(shù)的高通量革命！一次對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA 分子進(jìn)行序列測(cè)定,使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能。概述：芯片與高通量測(cè)序*芯片與高通量測(cè)序是兩種重要的高通量基因組學(xué)研究技術(shù), 對(duì)于揭示基因組的結(jié)構(gòu)

2、與功能已經(jīng)并正在發(fā)揮重要的作用.概述：芯片與高通量測(cè)序研究層次芯片平臺(tái)測(cè)序平臺(tái)用途基因組SNP芯片全基因組重測(cè)序、全基因組從頭測(cè)序、基因組捕獲測(cè)序用于研究各種生物DNA序列的差異和單核苷酸多態(tài)性，同時(shí)研究這些差異對(duì)疾病、診斷、預(yù)后的影響。CGH芯片用于研究基因拷貝數(shù)的變化，從而明確疾病相關(guān)遺傳基因，闡明其致病機(jī)制轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜芯片DGE 、RNA-Seq (針對(duì)不同種類(lèi)RNA的大小及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可采用不同的方法進(jìn)行分離和富集)用于大規(guī)模分析一定生物對(duì)象在特定條件下基因表達(dá)變化的全面信息Exon芯片RNA-Seq表達(dá)譜芯片只能檢測(cè)正常表達(dá)的mRNA；外顯子芯片除了檢測(cè)表達(dá)的mRNA外，還能檢測(cè)可變剪

3、接miRNA芯片miRNA-Seq (分離出miRNA)用于研究miRNA的功能及其在動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化和凋亡以及人類(lèi)疾病的發(fā)生等過(guò)程中的作用蛋白組蛋白芯片-用于檢測(cè)某一特定的生理或病理過(guò)程相關(guān)蛋白的表達(dá)豐度，目前主要用于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)組學(xué)、腫瘤及其它疾病相關(guān)研究。表觀遺傳學(xué)ChIp-on-chip芯片ChIp-Seq用于研究蛋白質(zhì)與DNA的相互作用。從而闡明真核生物基因表達(dá)機(jī)制。DNA甲基化芯片Bisulfite SequencingMBD-Sequencing在全基因組水平研究DNA甲基化在發(fā)育、染色體失活以及人類(lèi)疾病中的變化芯片和高通量測(cè)序目前已有的商業(yè)平臺(tái)Deep sequen

4、cing-based expression analysis shows major advances in robustness, resolution and inter-lab portability over five microarray platforms.Peter A. C. t Hoen1,*, Yavuz Ariyurek1, Helene H. Thygesen1, Erno Vreugdenhil2,Rolf H. A. M. Vossen1, etcNucleic Acids Research, 2008, Vol. 36, No. 21芯片與二代測(cè)序技術(shù)平臺(tái)比較-數(shù)

5、字表達(dá)譜與五種芯片平臺(tái)數(shù)字表達(dá)譜與五種芯片平臺(tái)五種芯片平臺(tái)，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)與NGS數(shù)據(jù)相關(guān)性很低？本文中測(cè)試的NGS與Realtime PCR相關(guān)性：R=0.35MAQC系列實(shí)驗(yàn)中，芯片數(shù)據(jù)與Realtime相關(guān)性不小于0.8The MicroArray Quality Control (MAQC) project shows inter- and intraplatform reproducibility of gene expression measurements. 2006, NatureBiotechnology-數(shù)字表達(dá)譜與五種芯片平臺(tái)數(shù)字表達(dá)譜與五種芯片平臺(tái)芯片與二代測(cè)序技術(shù)平臺(tái)比較

6、NATURE METHODS | VOL.6 NO.5 | MAY 2009mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cellFuchou Tang1,3, Catalin Barbacioru2,3, Yangzhou Wang2, Ellen Nordman2, Clarence Lee2, Nanlan Xu2, Xiaohui Wang2, John Bodeau2, Brian B Tuch2, Asim Siddiqui2, -利用單細(xì)胞表達(dá)譜測(cè)序利用單細(xì)胞表達(dá)譜測(cè)序芯片與二代測(cè)序技術(shù)平臺(tái)比較二輪放大之后的樣品分別采用：芯片

7、、測(cè)序和Taqman探針?lè)ㄟM(jìn)行檢測(cè)?！岸鷾y(cè)序技術(shù)”發(fā)現(xiàn)了不同樣品中外顯子的不同表達(dá)豐度結(jié)果顯示： 技術(shù)之間已開(kāi)始具有良好相關(guān)性 測(cè)序?qū)τ跈z測(cè)極低豐度轉(zhuǎn)錄本具有優(yōu)勢(shì)-利用單細(xì)胞表達(dá)譜測(cè)序利用單細(xì)胞表達(dá)譜測(cè)序芯片與二代測(cè)序技術(shù)平臺(tái)比較以生物學(xué)材料作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)樣品本身的真實(shí)情況缺乏客觀評(píng)估。該項(xiàng)研究利用人工合成的microRNA pool比較芯片與高通量測(cè)序檢測(cè)microRNA的定量效果和發(fā)現(xiàn)新信息的能力。Quantitative miRNA expression analysis: Comparing microarrays with next-generation sequencingHA

8、NNI WILLENBROCK, JESPER SALOMON,ROLF SKILDE,KIM BUNDVIG BARKEN,THOMAS NHR HANSEN, FINN CILIUS NIELSEN,4SREN MLLER,1and THOMAS LITMARNA (2009), 15:20282034. -利用人工合成的利用人工合成的microRNA PoolmicroRNA Pool芯片與二代測(cè)序技術(shù)平臺(tái)比較但兩種技術(shù)顯示出較高的相關(guān)性 R=0.93相比較芯片方法，測(cè)序在定量上稍遜一籌人工樣品庫(kù)的制備：16個(gè)合成的microRNA Pool形成從0.0625到16倍的濃度梯度，log2

9、范圍從-4到4.檢測(cè)兩種方法的定量能力。-利用人工合成的利用人工合成的microRNA PoolmicroRNA Pool芯片與二代測(cè)序技術(shù)平臺(tái)比較Mapping/AlignmentDe novo assemblyBiological verification and interpretationBiological questionExperimental designMicroarray experimentSequencingRaw intensityRaw readsQC + preprocessFused genesAlternative splice identifyDE anal

10、ysisGO & PathwayClusterAnalyzecSNP callingSSRdepth analysis芯片與二代測(cè)序技術(shù)分析流程比較（以Expression Array vs RNA-Seq為例）NormalizationRMA PLIER Quantile LOWESSRPM RPKM等測(cè)序的發(fā)展對(duì)計(jì)算和數(shù)據(jù)分析提出了挑戰(zhàn)高通量測(cè)序技術(shù)產(chǎn)生的速度超過(guò)目前計(jì)算科學(xué)的發(fā)展速度高性能計(jì)算+高速網(wǎng)絡(luò)+高效能存儲(chǔ)芯片是一個(gè)封閉的檢測(cè)系統(tǒng)，只能檢測(cè)已知的信息；測(cè)序是一個(gè)開(kāi)放的發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)，可以發(fā)現(xiàn)新的信息；芯片平臺(tái)經(jīng)過(guò)了近20年的發(fā)展，具有完整成熟的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)和分析手段；測(cè)序系統(tǒng)的數(shù)據(jù)

11、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)和分析方法有待更完善和標(biāo)準(zhǔn)化芯片平臺(tái)比較穩(wěn)定，在檢測(cè)上與Realtime吻合性較高，測(cè)序平臺(tái)準(zhǔn)確性正逐步提高，并且對(duì)于檢測(cè)極低豐度轉(zhuǎn)錄本或低頻SNP位點(diǎn)具有優(yōu)勢(shì)芯片數(shù)據(jù)分析PC機(jī)可以完成，測(cè)序分析需要“高性能計(jì)算+高速網(wǎng)絡(luò)+高效能存儲(chǔ)”整套解決方案芯片與二代測(cè)序技術(shù)平臺(tái)比較比較結(jié)論： 芯片在Targeted Sequencing中發(fā)揮作用 二代測(cè)序獲得許多未知序列物種信息，利用芯片可以進(jìn)行大量樣本研究芯片與二代測(cè)序聯(lián)合應(yīng)用Targeted Sequencing 采用Target enrichment（Agilent）+NGS(solexa)的技術(shù)，對(duì)一個(gè)已知疾病，F(xiàn)reeman-She

12、ldon syndrome進(jìn)行捕獲測(cè)序。通過(guò)采用多步驟分類(lèi)檢測(cè)法，濾掉普通變異和個(gè)人獨(dú)具的變異后，研究人員從4名Freeman-Sheldon綜合征患者的DNA中準(zhǔn)確找出了致病基因(MYH3)變異。他們的研究表明，對(duì)于單個(gè)基因變異引起的疾病，外顯子測(cè)序同樣可以準(zhǔn)確找到致病基因。外顯子測(cè)序也可用于多重基因變異引起的常見(jiàn)疾病，如糖尿病和癌癥的研究中，來(lái)揭示該種疾病的致病基因。應(yīng)用案例一：應(yīng)用案例二： Alexander Hoischen等用Agilent Sureselect human exome kits結(jié)合SOLiD測(cè)序技術(shù)分別對(duì)無(wú)血緣關(guān)系的4名Schinzel-Giedion綜合癥患者的外

13、顯子組序列進(jìn)行了測(cè)序，發(fā)現(xiàn)這4個(gè)樣本在SETBP1位點(diǎn)均存在雜合新生突變（heterozyous de novo mutation），用Sanger法對(duì)另外8個(gè)患兒的SETBP1位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，亦發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)同時(shí)出現(xiàn)了突變，而所有的點(diǎn)突變集中在高度保守的11nt的外顯子區(qū)域。隨后的研究表明，這些突變引發(fā)了Schinzel-Giedion綜合癥。Nature GeneticsVOLUME 42 | NUMBER 6 | JUNE 2010 1.Nicholas AK, Khurshid M, Dsir J, Carvalho OP, Cox JJ,Thornton G, Kausar R, An

14、sar M, Ahmad W, Verloes A,Passemard S, Misson JP, Lindsay S, Gergely F, Dobyns WB, Roberts E, Abramowicz M, Woods CG. WDR62 is associated with the spindle pole and is mutated in human microcephaly. Nat Genet, 2010, 42(11): 10101014.2.Sun Y, Almomani R, Aten E, Celli J, van der Heijden J, Venselaar H

15、, Robertson SP, Baroncini A, Franco B, Basel-Vanagaite L, Horii E, Drut R, Ariyurek Y, den Dunnen JT, Breuning MH. Terminal osseous dysplasia is caused by a single recurrent mutation in the FLNA gene. Am J Hum Genet, 2010, 87(1): 146153.3.Nikopoulos K, Gilissen C, Hoischen A, van Nouhuys CE, Boonstr

16、a FN, Blokland EA, Arts P, Wieskamp N, Strom TM, Ayuso C, Tilanus MA, Bouwhuis S, Mukhopadhyay A, Scheffer H, Hoefsloot LH, Veltman JA, Cremers FP, Collin RW. Next-generation sequencing of a 40 Mb linkage interval reveals TSPAN12 mutations in patients with familial exudative vitreoretinopathy. Am J

17、Hum Genet, 2010, 86(2): 240247.4.Rehman AU, Morell RJ, Belyantseva IA, Khan SY, Boger ET, Shahzad M, Ahmed ZM, Riazuddin S, Khan SN, Riazuddin S, Friedman TB. Targeted capture and next-generation sequencing identifies C9orf75, encoding taperin, as the mutated gene in nonsyndromic deafness DFNB79. Am

18、 J Hum Genet, 2010, 86(3): 378388.5.Rosa-Rosa JM, Gracia-Aznrez FJ, Hodges E, Pita G, Rooks M, Xuan ZY, Bhattacharjee A, Brizuela L, Silva JM, Hannon GJ, Benitez J. Deep sequencing of target linkage assay-identified regions in familial breast cancer: methods, analysis pipeline and troubleshooting. P

19、LoS One, 2010, 5(4): e9976.6.Chou LS, Liu CSJ, Boese B, Zhang XM, Mao R. DNA sequence capture and enrichment by microarray followed by next-generation sequencing for targeted resequencing: neurofibromatosis type 1 gene as a model. Clin Chem, 2010, 56(1): 6272. 2012年1月10日，Illumina公司宣布推出HiSeq2500，這款新一

20、代測(cè)序系統(tǒng)讓研究人員和臨床醫(yī)生能夠在大約24小時(shí)內(nèi)完成整個(gè)基因組的測(cè)序，即“一天一個(gè)基因組”。HiSeq 2500充分利用了HiSeq 2000和MISeq平臺(tái)上不斷的技術(shù)進(jìn)步。 公司預(yù)計(jì)在2012年下半年全面發(fā)售HiSeq 2500，標(biāo)價(jià)74萬(wàn)美元，也可從HiSeq 2000升級(jí)，升級(jí)價(jià)格5萬(wàn)美元。英國(guó)牛津納米孔公司亮相的比手掌還小的測(cè)序儀 2012年2月25日，英國(guó)牛津納米孔技術(shù)公司在佛羅里達(dá)州基因組生物學(xué)與技術(shù)會(huì)議上宣布了一個(gè)爆炸性消息，即推出GridION和MinION兩款基于新一代DNA測(cè)序技術(shù)的便攜式基因組測(cè)序儀，后者僅有U盤(pán)大小，可插入電腦USB端口完成測(cè)序，價(jià)格僅900美元。兩

21、個(gè)儀器都是基于納米孔測(cè)序技術(shù)，采用一種特殊的蛋白在薄膜結(jié)構(gòu)上打出納米級(jí)小洞或小孔，在膜的一側(cè)施加電壓將單條DNA鏈（帶負(fù)電）拉進(jìn)納米孔。當(dāng)DNA的化學(xué)堿基通過(guò)時(shí)，引起細(xì)微的電流變化，測(cè)量這種變化即可識(shí)別出不同的堿基（T、C、G和A）組成順序，然后通過(guò)電腦將每一部分的結(jié)果編織在一起呈現(xiàn)。2012年測(cè)序儀市場(chǎng)動(dòng)態(tài) 在基因測(cè)序儀器裝備上，美國(guó)宣稱(chēng)要在2012年底推出第三代基因測(cè)序儀，英國(guó)、日本和其它歐洲國(guó)家也有相關(guān)的研發(fā)計(jì)劃。 中國(guó)，在2009年12月，中科院與浪潮集團(tuán)宣布聯(lián)手共同研制國(guó)產(chǎn)第三代基因測(cè)序儀，并計(jì)劃在3年內(nèi)問(wèn)世。如若成功，將有望緩解目前國(guó)內(nèi)研究所使用的基因測(cè)序儀完全依賴(lài)進(jìn)口、價(jià)格昂貴的

22、窘境，并填補(bǔ)我國(guó)在基因測(cè)序基礎(chǔ)裝備領(lǐng)域的空白。 第三代測(cè)序的發(fā)展第三代測(cè)序基因測(cè)序儀發(fā)展中科院與浪潮集團(tuán)宣布聯(lián)手共同研制國(guó)產(chǎn)第三代基因測(cè)序儀第三代測(cè)序技術(shù)原理（基于納米孔單分子讀取） 在納米孔測(cè)序技術(shù)中，DNA分子依靠被稱(chēng)為核酸外切酶的蛋白質(zhì)以一次一個(gè)堿基的速度通過(guò)小孔。這個(gè)酶能清楚地區(qū)分出4個(gè)DNA堿基編碼：A、C、G、T，也可以檢測(cè)出該堿基是否被甲基化。 納米孔嚴(yán)格限制了 DNA 單鏈可以通過(guò)的空間,每次只允許一個(gè)核苷酸按照原有的次序通過(guò). DNA 分子通過(guò)納米孔時(shí),它們的序列會(huì)被逐一分辨出。 納米孔技術(shù)不需要熒光標(biāo)記物并且很可能不需要進(jìn)行擴(kuò)增，能直接并快速“讀”出DNA，同時(shí)足夠廉價(jià)，使進(jìn)行大量重復(fù)實(shí)驗(yàn)成為可能。 第三代測(cè)序的發(fā)展納米孔測(cè)序有下列的難題待于快速解決：1. 控制核酸外切酶精確的切割DNA分子.2. 如何實(shí)現(xiàn)對(duì)長(zhǎng)DNA序列的測(cè)序.3. 控制堿基在納米孔內(nèi)的移動(dòng).4. 納米孔的穩(wěn)定性和可靠性.1、它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，一秒可以測(cè)10個(gè)堿