1、與氮素同化相關(guān)酶及測定方法與氮素同化相關(guān)酶及測定方法自 然 界 中 N 素 循 環(huán) 一、植物體內(nèi)氮的含量與分布一、植物體內(nèi)氮的含量與分布 含量：含量：占植物干重的占植物干重的0.35。植物種類：植物種類：豆科植物豆科植物非豆科植物非豆科植物品種：品種：高產(chǎn)品種高產(chǎn)品種低產(chǎn)品種低產(chǎn)品種器官：器官：種子種子葉葉根根莖稈莖稈二、氮的生理功能二、氮的生理功能 氮是蛋白質(zhì)的重要成分（蛋白質(zhì)含氮氮是蛋白質(zhì)的重要成分（蛋白質(zhì)含氮1618）2. 氮是核酸和核蛋白的成分（核酸中的氮約占植氮是核酸和核蛋白的成分（核酸中的氮約占植株全氮的株全氮的7）3. 氮是酶的成分氮是酶的成分4.氮是葉綠素（葉綠素氮是葉綠素（葉

2、綠素a:C55H72O5N4Mg)的成分的成分（葉綠體含蛋白質(zhì)（葉綠體含蛋白質(zhì)4560）5. 氮是多種維生素的成分氮是多種維生素的成分:如維生素如維生素B1 (C12H17ON3S)、B2 (C17H18O6N4 )、B6(C6H11O3N) 6. 氮是一些植物激素的成分（如氮是一些植物激素的成分（如IAA、CTK）7. 氮也是生物堿的組分（如煙堿、茶堿、可可氮也是生物堿的組分（如煙堿、茶堿、可可堿、咖啡堿、膽堿卵磷脂堿、咖啡堿、膽堿卵磷脂(磷脂酰膽堿）磷脂酰膽堿）氮素通常被稱為氮素通常被稱為生命元素生命元素三、植物對氮的吸收三、植物對氮的吸收(adsorption)與同化與同化 (assim

3、ilation)吸收的形態(tài)吸收的形態(tài)無機態(tài)：無機態(tài)： NO3-N、NH4+N （主要）（主要）有機態(tài)：有機態(tài)：NH2 N、氨基酸、氨基酸、 核酸等核酸等（少量）（少量） 植物從外界環(huán)境獲得植物從外界環(huán)境獲得N主要是通過主要是通過 3條途徑條途徑, 通過通過NO3- 還原把無還原把無機氮轉(zhuǎn)化為生命體可用的機氮轉(zhuǎn)化為生命體可用的有機氮有機氮, 通過通過固氮菌固氮菌對對 N2的固定的固定, 直接吸直接吸收土壤中的收土壤中的銨或有機氮銨或有機氮。 植物的氮源主要是銨鹽和硝酸鹽，占土壤含氮的植物的氮源主要是銨鹽和硝酸鹽，占土壤含氮的1%-2%。（一）植物對硝態(tài)氮的吸收與同化（一）植物對硝態(tài)氮的吸收與同化

4、1. 1. 吸收：吸收：旱地作物吸收旱地作物吸收NO3-N為主，為主，主動吸收主動吸收2. 同化同化(1) NO3-N的還原作用的還原作用(nitrate reduction)過程：過程：NO3- NO2- NH3NR：硝酸還原酶硝酸還原酶(nitrate reductase)NiR：亞硝酸還原酶亞硝酸還原酶(nitrite reductase) NR，Mo NiR，F(xiàn)e、Mn 根、葉細(xì)胞質(zhì)根、葉細(xì)胞質(zhì) 根、葉綠體根、葉綠體 氨的同化氨的同化 植物吸收銨鹽以后，或當(dāng)植物所吸收的硝酸鹽被植物吸收銨鹽以后，或當(dāng)植物所吸收的硝酸鹽被還原成氨后，氨必須立即被同化成氨基酸，否則就會還原成氨后，氨必須立即

5、被同化成氨基酸，否則就會毒害植物。因為氨可能抑制呼吸過程中的電子傳遞系毒害植物。因為氨可能抑制呼吸過程中的電子傳遞系統(tǒng)。統(tǒng)。 氨的同化方式為：進入谷氨酸合成酶循環(huán)。氨的同化方式為：進入谷氨酸合成酶循環(huán)。 作用酶類：作用酶類： GOGAT: GOGAT:谷氨酸合成酶；存在于葉綠體。谷氨酸合成酶；存在于葉綠體。 GS: GS:谷氨酰胺合成酶；存在于葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中。谷氨酰胺合成酶；存在于葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中。 GDH: GDH:谷氨酸脫氫酶；存在于線粒體中。谷氨酸脫氫酶；存在于線粒體中。過程過程（1）GDH（谷氨酸脫氫酶）途徑（谷氨酸脫氫酶）途徑酮戊二酸氨谷氨酸各種新的氨基酸酮酸酰胺氨谷氨酸脫氫酶谷氨

6、酸脫氫酶轉(zhuǎn)氨基作用轉(zhuǎn)氨基作用 （2 2）GS-GOGATGS-GOGAT途徑途徑 （谷氨酰胺合成酶谷氨酸合成酶）（谷氨酰胺合成酶谷氨酸合成酶） 是高等植物同化氨的主要途徑是高等植物同化氨的主要途徑谷氨酰胺合成酶COOHCHNH2CH2CH2CONH2COOHCHNH2CH2CH2COOH谷氨酸合成酶2H+，2eCOOHC=OCH2CH2COOHCOOHCHNH2CH2CH2COOH谷氨酸脫氫酶NH4+吸收NO3還原N2固定光呼吸NH3NH3NADH谷氨酰胺谷氨酸谷氨酸圖圖1 氨的同化途徑的模式氨的同化途徑的模式ATPNADH鐵氧還蛋白 轉(zhuǎn)氨基轉(zhuǎn)氨基作用作用含氮化含氮化合物合物反應(yīng)式：反應(yīng)式：N

7、H3谷氨酸谷氨酸ATP 谷氨酰胺谷氨酰胺ADPPi谷氨酰胺谷氨酰胺-酮戊二酸酮戊二酸2 2e e2H2H 2 2谷氨酸谷氨酸谷氨酸谷氨酸1717酮酸酮酸 17 17種種氨基酸氨基酸 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺合成酶谷氨酸合成酶谷氨酸合成酶轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)氨酶 合成合成 （transamination） （1）定義：是指一種-氨基酸和氨基酸和-酮酸在轉(zhuǎn)氨酶的作酮酸在轉(zhuǎn)氨酶的作用下生成相應(yīng)的用下生成相應(yīng)的-酮酸和新的氨基酸的過程。酮酸和新的氨基酸的過程。（2）生物體內(nèi)兩種重要的轉(zhuǎn)氨基作用）生物體內(nèi)兩種重要的轉(zhuǎn)氨基作用谷丙轉(zhuǎn)氨基作用谷丙轉(zhuǎn)氨基作用谷草轉(zhuǎn)氨基作用谷草轉(zhuǎn)氨基作用谷丙轉(zhuǎn)氨酶谷丙轉(zhuǎn)氨酶（

8、GPT）磷酸吡磷酸吡哆醛哆醛CHNH2CH3COOHCOOHCH2CH2C=OCOOHCOOHCH3C=OH-C-NH2COOHCH2CH2COOH+谷丙轉(zhuǎn)氨基作用谷丙轉(zhuǎn)氨基作用谷草轉(zhuǎn)氨基作用谷草轉(zhuǎn)氨基作用H-C-NH2COOHCH2COOH+COOHCH2CH2C=OCOOH谷草轉(zhuǎn)氨酶谷草轉(zhuǎn)氨酶（ GOT）磷酸吡磷酸吡哆醛哆醛COOHCH2COOHC=OH-C-NH2COOHCH2CH2COOH+3. 酰胺酰胺(amide)的形成及意義的形成及意義形成：形成：NH3意義：意義：貯存氨基；貯存氨基； 解除氨毒；解除氨毒； 參與代謝。參與代謝。 谷氨酸谷氨酸(Glu) 酰胺合成酶酰胺合成酶 谷氨

9、酰胺谷氨酰胺(Gln) 天門冬氨酸天門冬氨酸(Asp) ATP 天門冬酰胺天門冬酰胺(Asn) 銨態(tài)氮配方銨態(tài)氮配方非脲酶途徑：非脲酶途徑：直接同化直接同化尿素尿素 氨甲酰磷酸氨甲酰磷酸 瓜氨酸瓜氨酸 精氨酸精氨酸（二）植物對有機氮的吸收與同化（二）植物對有機氮的吸收與同化1. 尿素尿素 urea（酰胺態(tài)氮（酰胺態(tài)氮 amide nitrogen） (1) 吸收：吸收：根、葉均能直接吸收根、葉均能直接吸收(2) 同化：同化：脲酶途徑：脲酶途徑：尿素尿素 NH3 氨基酸氨基酸 脲酶脲酶水解水解尿素的毒害：尿素的毒害：當(dāng)介質(zhì)中尿素濃度過高時，植物當(dāng)介質(zhì)中尿素濃度過高時，植物會出現(xiàn)受害癥狀會出現(xiàn)受害

10、癥狀2. 氨基態(tài)氮氨基態(tài)氮(amino nitrogen)可直接吸收，效果因種類而異可直接吸收，效果因種類而異第一類第一類 效果效果 硫酸銨：如甘氨酸、天門冬酰胺等硫酸銨：如甘氨酸、天門冬酰胺等第二類，第二類，尿素尿素 AA效果效果 硫酸銨：如天門冬氨酸等硫酸銨：如天門冬氨酸等第三類，第三類，效果效果 尿素：如脯氨酸、纈氨酸等尿素：如脯氨酸、纈氨酸等第四類，第四類，有抑制作用：如蛋氨酸有抑制作用：如蛋氨酸植物轉(zhuǎn)氨酶植物轉(zhuǎn)氨酶(GOT和和GPT)活度比色測定方法及其應(yīng)及活度比色測定方法及其應(yīng)及GOGAT酶活酶活性的測定性的測定主要試劑主要試劑(1)0.05mol/L Tris-HCL緩沖液(pH

11、7.2):0.2mol/L三羥甲基氨基甲烷(24.2g三羥甲基氨基甲烷用蒸餾水溶解并定容至200ml)50ml和0.2mol/L HCl44.2ml,用蒸餾水稀釋至200ml。(2)0.1mol/L磷酸鹽緩沖液:稱取磷酸氫二鈉 (AR)11.928g,磷酸二氫鉀(AR)2.176g,加少量蒸餾水溶解并定容至1000ml。(3)2,4-二硝基苯肼溶液:稱取2,4-二硝基苯肼19.8mg,用10mol/L HCL10ml溶解后,加蒸餾水至100ml,保存于棕色瓶中備用,此液可保存3個月。(4)0.4mol/L氫氧化鈉溶液:16g氫氧化鈉(AR)加蒸餾水溶解并定容至1000ml。(5)1mol/L氫

12、氧化鈉溶液:40g氫氧化鈉(AR)加蒸餾水溶解并定容至1000ml。(6)丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液(2mol/ml):精確稱取純丙酮酸鈉22.0mg于100ml容量瓶中,加0.1mol/L磷酸鹽緩沖液至刻度。此液應(yīng)新鮮配制。(7)GOT底物液(DL-門冬氨酸200mmol/L,-酮戊二酸2mmol/L):稱取-酮戊二酸29.2mg和DL-門冬氨酸2.66g置于一小燒杯中,加入1mol/L氫氧化鈉20.5ml使溶解,并校正pH至7.4,然后將溶液移入100ml容量瓶內(nèi),用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液定容至刻度。放置冰箱內(nèi)保存。(8)GPT底物液:(DL-丙氨酸200mmol/L,-酮戊二酸2mmol/L):

13、稱取-酮戊二酸29.2mg和DL-丙氨酸1.79g置于一小燒杯中,加入0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)約80ml煮沸溶解后,待冷,用1mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至7.4(約加0.5ml),再加0.1mol/L磷酸鹽緩沖液至100ml混勻,加氯仿數(shù)滴防腐,貯于冰箱內(nèi)。1酶粗制劑的提取酶粗制劑的提取將新鮮植物材料剪碎,取鮮重0.2g左右放入研缽,加0.05mol/LTris-HCl緩沖液(pH7.2)2.0ml,在冰浴中研磨,得到的勻漿用高速離心機20000g離心20min,上清液供測酶活度用。2谷草轉(zhuǎn)氨酶谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活度測定活度測定取10ml試管2支,一支作測定管,分別加酶粗制劑

14、0.1ml和GOT底物液0.5ml,另一支作對照管,僅加酶粗制劑0.1ml。將二管同時置37水浴,60min后取出,各管加2,4二硝基苯肼液0.5ml終止反應(yīng),對照管再加GOT底物液0.5ml。將二管再置37水浴中20min,取出后各管加0.4mol/L NaOH 5.0ml,混勻,10min后用分光光度計比色,波長500nm,蒸餾水調(diào)零點,讀取吸光度。將測定管吸光度減去對照管吸光度,得吸光度差值,查工作曲線即可查得丙酮酸體積(ml)。若查得的丙酮酸體積超過0.2ml時應(yīng)將酶粗制液稀釋后再進行測定,測定結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)即得丙酮酸體積V(ml)。工作曲線繪制工作曲線繪制:取10ml試管5支,各管

15、加0.1mol/L磷酸鹽緩沖液0.1ml,分別加GOT底物液0.5、0.45、0.40、0.35、0.30ml,丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液0(對照管)、0.05、0.10、0.15、0.20ml。置37水浴5min,各管加2,4-二硝基苯肼溶液0.5ml,混勻,再置37水浴中20min,取出后各管加0.4mol/L氫氧化鈉溶液5ml,混勻,10min后同上比色,讀取各管吸光度。各管吸光度分別減去對照管吸光度,以各管丙酮酸體積為橫座標(biāo),以相應(yīng)的吸光度差值為縱座標(biāo)繪制工作曲線。3谷丙轉(zhuǎn)氨酶谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活度測定活度測定取10ml試管2支,一支作測定管,分別加酶粗制劑0.1ml和GPT底物液0.5ml,另一

16、支作對照管,僅加酶粗制劑0.1ml。將二管同時置37水浴,30min后取出,各管加2,4-二硝基苯肼液0.5ml終止反應(yīng),對照管再加GPT底物液0.5ml。將二管再置37水浴中20min,取出后各管加0.4mol/L NaOH 5.0ml,混勻,10min后用分光光度計比色,波長500nm,蒸餾水調(diào)零點,讀取吸光度。將測定管吸光度減去對照管吸光度,得吸光度差值,查工作曲線工作曲線即可查得丙酮酸體積(ml),若查得的丙酮酸體積超過0.2ml時應(yīng)將酶粗制液稀釋后再進行測定,測定結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)即得丙酮酸體積V(ml)。工作曲線繪制:取10ml試管6支,各管加0.1mol/L磷酸鹽緩沖液0.1ml,

17、分別加GPT底物液0.5、0.45、0.40、0.35、0.30、0.25ml,丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液0(對照管)、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25ml。置37水浴中5min,各管加2,4-二硝基苯肼溶液0.5ml,混勻,再置37水浴中20min,取出后各管加0.4mol/L氫氧化鈉溶液5ml,混勻,10min后同上比色,讀取各管吸光度。各管吸光度分別減去對照管吸光度,以各管丙酮酸體積為橫座標(biāo),以相應(yīng)的吸光度差值為縱座標(biāo)繪制工作曲線。(四四)結(jié)果計算結(jié)果計算轉(zhuǎn)氨酶活度以每克植物鮮樣在30min內(nèi)反應(yīng)生成的丙酮酸微摩爾(mol)表示。GOT活度,mol/g30min=(CV20)/(m2)

18、GPT活度,mol/g30min=(CV20)/(m2)式中,C丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mol/ml);V由工作曲線查得的丙酮酸體積(ml);20稀釋倍數(shù);2反應(yīng)時間換算系數(shù),GOT實際反應(yīng)時間為1h,按習(xí)慣本法酶活性以30min計算4,故應(yīng)除以2;m植物鮮重(g) 粗酶液制備粗酶液制備取1g水稻根/葉，置于冰浴的研缽中，加入少量石英砂和3ml提取緩沖液（100mmol/L Tris-HCl(pH7.6)含1.0mmol/L EDTA，1.0mmol/LMgCl26H2O，10mmol/L -琉基乙醇）于4研磨成勻漿。混合均勻后于高速冷凍離心機4、20,000g離心離心20min（13，000g

19、 30min），收集上清，即為粗酶提取液，置于-80冰箱中凍存，待測。粗酶液用于Gs、NADH-GOGATH的活力測定。提取液配置：提取液配置：（Tris，121.14；EDTA，372.24；MgCl26H2O，203.3；-琉基乙醇原液14.4mol/L）1L提取液的配置：12.114g Tris+0.3722g EDTA+0.2033g MgCl26H2O用900ml水溶解，+0.7ml-琉基乙醇原液后，用1mmol/L HCl調(diào)pH值至7.6，然后定容至1L。500ml提取液的配置：提取液的配置：6.057g Tris+0.1861g EDTA+0.1016g MgCl26H2O用用4

20、50ml水溶解，水溶解，+0.35ml -琉基乙醇原液后，用琉基乙醇原液后，用1mmol/L HCl（原液稀釋（原液稀釋12000倍倍,83ul定容至定容至100ml）調(diào)）調(diào)pH值至值至7.6，然后定容至，然后定容至500ml。GS測定：測定：（1）合成酶活性反應(yīng)液配制：）合成酶活性反應(yīng)液配制：(50mmol/L咪唑-HCl(pH7.2)含40mmol/LMgSO4,90mmol/L L-谷氨酸, 6 mmol/L羥胺)(咪唑，68.077；無水氯化鎂無水氯化鎂，120；L-谷氨酸，147.13；羥胺，33.03)500ml反應(yīng)液：1.702g咪唑+2.4g MgSO4+6.621g L-谷氨

21、酸+0.099g羥胺用450ml蒸餾水溶解，再用1mM HCl調(diào)節(jié)pH至7.2，定容至500mL250ml反應(yīng)液：反應(yīng)液：0.851g咪唑咪唑+1.2g MgSO4+3.311g L-谷氨酸谷氨酸+0.050g羥胺用羥胺用200ml蒸餾水溶解，再用蒸餾水溶解，再用1mM HCl調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH至至7.2，定容至，定容至250mL（2）10 mmol/L ATP-Na(3個水，606.24): 0.0666g 定容至11ml（3）酸性）酸性FeC13終止液（終止液（2% (WV/) TCA+3.5% (WV/) FeC136H2O+2%HCl）配制）配制: 2g TCA+3.5g FeC136H2O

22、+ 5.333ml HCl原液（分析純濃鹽酸一般為37.5%，摩爾濃度近似為12mol/L），用蒸餾水溶解后，定容至100ml.（4）測定（）測定（1個處理，個處理，3個管（個管（1個對照，兩個重復(fù)）個對照，兩個重復(fù)）反應(yīng)總體積2ml：1.9ml(1ml活性反應(yīng)液+0.8ml蒸餾水+0.1ml粗酶液)混合液在37預(yù)熱預(yù)熱2-3min后加入后加入0.1ml 10 mmol/L ATP啟動反應(yīng)?；旌暇鶆蚝螅?7室溫保溫室溫保溫15min后，立刻加入后，立刻加入1ml FeC13終止液終止反應(yīng)，然后終止液終止反應(yīng)，然后3000g離心離心5min，上清液于，上清液于540nm處測定吸光值。空白對照：按

23、順序加入處測定吸光值。空白對照：按順序加入1ml活性反應(yīng)液+0.8ml蒸餾水+0.1ml 10 mmol/L ATP+1ml FeC13終止液終止液+0.1ml粗酶液，然后然后3000g離心離心5min，上清液于，上清液于540nm處測定吸光值。處測定吸光值。（5）一個GS活性單位定義為每分鐘于37產(chǎn)生1umol的r谷氨酰異羥肟酸一glutamyl hydroxmate)所需的酶量。（6）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：以r谷氨酰異羥肟酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線取1ml反應(yīng)液，37預(yù)保溫，5min后分別加入0，0.5，1.0，1.5，2.0，3，4，5，6，7mM的谷氨?；惲u肟酸1ml，混合均勻后，37室溫保溫室溫保溫1

24、5min后，立刻加入后，立刻加入1ml FeC13終止液終止反應(yīng)，搖勻后在終止液終止反應(yīng)，搖勻后在540nm波長下比色，以蒸餾波長下比色，以蒸餾水作對照，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出谷氨酰基異羥肟酸計算公式：水作對照，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出谷氨?；惲u肟酸計算公式：=7.9*OD540-0.162 NADH-GOGAT活性的測定活性的測定NADH-GOGAT活性測定按singh(1986)報道的方法進行。測活貯備液:A:20mmol/L谷氨酰胺(146.15) 0.2923g定容至100mlB:100mmol/L a-酮戊二酸(146.11) 1.4611g定容至100mlC:10 mm

25、ol/L KCl(74.551) 0.0745g定容至100mlD:25mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.6) 1.514g 定容至500mlE:3mmol/L NADH(新鮮配制) (709.4) 0.017g 定容至8ml空白對照為0.4mL(A)+0.05mL(B)+0.lmL(C)+2.45mL(D)。測活管:0.05mLB+0.lmL C+ 1.95mLD (測定前可以按照10:20:390比例混勻后，取混合液2.1ml)30水浴中預(yù)熱幾分鐘后,按順序加入0.2mLE和0.3mL酶液,再加入0.4mL A,混勻,立即啟動反應(yīng)，紫外分光光度計在340nm處測光吸收,倒回試管

26、,30水浴,三分鐘后再測一次光吸收,計算差值。NADH-GOGAT酶活性單位定義為:每分鐘反應(yīng)混合液于30減少1umol NADH為一個酶活性單位。NADH-GDH活性的測定活性的測定:NADH-GDH(還原型還原型GDH)和和NAD+-GDH (氧化型氧化型GDH)的活性測定的活性測定,參照參照Loulkakais等等(1990)的方法。的方法。NADH-GDH測活貯備液測活貯備液:6.9898g Tris+1.6876g-酮戊二酸酮戊二酸+6.179g NH4Cl 定容至定容至500ml(pH怎么調(diào)？還怎么調(diào)？還是分開配是分開配)？115.4 mmol/L Tris-HCI(pH8.0)，

27、23.1 mmol/L -酮戊二酸，酮戊二酸，231 mmol/L NH4Cl(53.5)NADH貯備液貯備液(709.4): 6 mmol/L 0.017g 定容至定容至4mlCaCl2:貯備液貯備液(110.98): 30 mmol/L 0.3329g定容至定容至100ml先在準(zhǔn)備好的試管中加入先在準(zhǔn)備好的試管中加入2.6mL測活貯備液，按順序加入測活貯備液，按順序加入0.l mL CaC12，0.lmL NADH，0.lmL蒸餾水。再加入蒸餾水。再加入0.lmL酶液啟動反應(yīng)，并于酶液啟動反應(yīng)，并于340mn處測定吸光值，三分鐘后再測定一處測定吸光值，三分鐘后再測定一次，計算差值。以水代替次，計算差值。以水代替NADH和酶液作為空白對照管。和酶液作為空白對照管。NADH-GDH活性以每分鐘在活性以每分鐘在30下氧化下氧化1umol