1、流式細(xì)胞術(shù)的樣品制備2010年04月13日 星期二 02:03流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)檢測對象是單細(xì)胞懸液，因此需把樣品制備成細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為 105 107 個 ml 。制備成的單細(xì)胞懸液經(jīng)熒光或免疫熒光標(biāo)記即可上機(jī)檢測。樣本制備的基本原則： 1. 使各種液體和懸浮細(xì)胞樣本新鮮，盡快完成樣本制備和檢測； 2. 針對不同的細(xì)胞樣本進(jìn)行適當(dāng)洗滌、酶消化或 EDTA 處理，以清除雜質(zhì)，使粘附的細(xì)胞彼此分離而形成單細(xì)胞狀態(tài)； 3. 對新鮮實(shí)體瘤組織可選用或聯(lián)用酶消化法，機(jī)械打散法和化學(xué)分散法來獲得足夠數(shù)量的單細(xì)胞懸液； 4. 對石蠟包埋組織應(yīng)先切成若干 40-50 m 厚的蠟片，經(jīng)二甲苯脫蠟到水后，再用

2、前述方法制備單細(xì)胞懸液； 5. 單細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)不應(yīng)少于 107 個 /ml 。一、新鮮實(shí)體組織樣本的制備（ 一 ） 酶處理法 此法是實(shí)體組織分散為單個細(xì)胞的主要方法。由于不同酶對細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間不同組分有特異消化作用，所以應(yīng)根據(jù)所用組織類型確定使用酶的種類。此外，乙二胺四乙酸 (EDTA) 能結(jié)合組織中的二價鈣離子和鎂離子，而二價鈣離子和鎂離子有維持細(xì)胞表面完整性和維持細(xì)胞間質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用，因此，幾種酶和 EDTA 聯(lián)合使用有助于充分消化實(shí)體組織，提高細(xì)胞產(chǎn)出效率。下面僅介紹組織消化的一般過程，對于每種組織消化時所用的具體步驟需參考該組織細(xì)胞培養(yǎng)時的消化方法。1 將組織剪成 l 2mm 3 左

3、右的小塊。2 用胰蛋白酶或膠原酶消化組織塊，胰蛋白酶適用于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎、上皮、肝、腎等組織。胰蛋白酶工作濃度一般為 0 1 0 5 。對于纖維較多的組織或較硬的癌組織常用 0 25 膠原酶，膠原酶對組織中膠原蛋白類結(jié)構(gòu)消化作用強(qiáng)，它僅對細(xì)胞間質(zhì)有消化作用而對上皮細(xì)胞影響不大。膠原酶常用劑量為 0 1 0 3ug ml 。用大于組織量 30 50 倍的胰蛋白酶液或膠原酶液在 37 條件下消化組織，需每隔一定時間搖動一次。消化時間的長短依組織類型而定，一般來說，胰蛋白酶需作用 20 60 分鐘，膠原酶需 4 48 小時。在消化過程中，如發(fā)現(xiàn)組織塊已分散而失去塊的形狀，經(jīng)搖動即可

4、成為絮狀懸液，則可取出少量液體在顯微鏡下觀察，可見分散的單個細(xì)胞和少量的細(xì)胞團(tuán)，可認(rèn)為組織已消化充分。3 消化完畢后，將細(xì)胞懸液通過 100 目孔徑尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)濾過，以除掉未充分消化的組織。4 已過濾的細(xì)胞懸液經(jīng) 800 1000rpm 低速離心 5 10 分鐘后，棄上清液，加 PBS 液，輕輕吹打形成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后即可使用。（ 二 ） 機(jī)械法 機(jī)械法分散實(shí)體組織，用手術(shù)剪刀剪碎組織、用鋒利的解剖刀剁碎組織或用勻漿器制成組織勻漿，再用細(xì)注射針頭抽吸細(xì)胞或用 300 目尼龍網(wǎng)濾除單細(xì)胞懸液；采用網(wǎng)搓法也能獲得大量細(xì)胞。機(jī)械法易造成細(xì)胞碎片和細(xì)胞團(tuán)塊，所以常與其他方法配合使用。1 剪碎法

5、（ 1 ）將組織塊放入平皿中，加入少量生理鹽水；（ 2 ）用剪刀將組織剪至勻漿狀；（ 3 ）加入 10ml 生理鹽水；（ 4 ）用吸管吸取組織勻漿，先以 100 目尼龍網(wǎng)過濾到試管中；（ 5 ）離心沉淀 1000r/min ， 45min ，再用生理鹽水洗 3 遍，每次以低速（ 500800r/min ）短時離心沉淀去除細(xì)胞碎片。（ 6 ）以 300 目尼龍網(wǎng)濾去細(xì)胞團(tuán)塊；（ 7 ）細(xì)胞用固定液固定或低溫保存?zhèn)溆谩? 網(wǎng)搓法（ 1 ）將 100 目、 300 目尼龍網(wǎng)扎在小燒杯上；（ 2 ）把剪碎的組織放在網(wǎng)上，以眼科鑷子輕輕搓組織塊，邊搓邊加生理鹽水沖洗，直到將組織搓完；（ 3 ）收集細(xì)胞懸

6、液， 500800r/min 離心沉淀 2min ；（ 4 ）固定細(xì)胞或低溫保存?zhèn)溆谩? 研磨法（ 1 ）先將組織剪成 12mm2 大小組織塊；（ 2 ）放入組織研磨器中加入 12ml 生理鹽水；（ 3 ）轉(zhuǎn)動研棒，研至勻漿。（ 4 ）加入 10ml 生理鹽水，沖洗研磨器；（ 5 ）收集細(xì)胞懸液，并經(jīng) 300 目尼龍網(wǎng)過濾，離心沉淀 500800r/min ， 12min ，再以生理鹽水水洗 3 遍，離心沉淀；（ 6 ）固定或低溫保存細(xì)胞懸液，備用。二、組織活檢、內(nèi)鏡取材標(biāo)本單細(xì)胞懸液的制備正常組織、瘤組織和淋巴結(jié)等活檢組織以及內(nèi)鏡（胃鏡、食管鏡等）取材標(biāo)本，由于材料較少、制備起來比較麻煩，但

7、其制備方法與實(shí)體組織基本相似。1 取材后立即放入盛有少許 PBS 液的青霉素小瓶中；2 另取一只小燒杯，杯口用 300 目尼龍網(wǎng)蓋住，用線繩固定好，并用 PBS 液濕潤；取新鮮組織標(biāo)本置尼龍網(wǎng)上，因標(biāo)本量少，尤其是內(nèi)鏡取材至少要取 3 塊以上。3 在操作前，先將剪刀用 PBS 液浸潤一下，然后開始剪碎組織；4 先剪幾下，視基本無組織塊存在時，用原來裝標(biāo)本的青霉素小瓶中的 PBS 液，沖洗細(xì)胞勻漿并過濾于小燒杯中，如果這時仍有可見組織塊，再用剪刀剪碎，再加適量該 PBS 液沖洗，直至網(wǎng)上無組織塊為止。這樣可盡量多地收集細(xì)胞。5 細(xì)胞加固定液或低溫保存，備用。三、石蠟包埋組織的流式細(xì)胞樣品制備 外

8、科手術(shù)獲得的新鮮實(shí)體組織，往往已進(jìn)行石蠟包埋處理。石蠟包埋組織單細(xì)胞分散方法的建立，擴(kuò)大了流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用范圍。1 把石蠟包埋組織切成 1050um 厚的組織片 35 片，或用乳缽研成 0.5mm 直徑大小顆粒狀，放入 10ml 的試管中；2 加入二甲苯 58ml ，在室溫下脫蠟 12 天，視石蠟脫凈與否，更換 12 次二甲苯，石蠟脫凈后，棄去二甲苯；3 水化：依次加入 100% 、 95% 、 70% 、 50% 梯度乙醇 5ml ，每步為 10min ，去乙醇，加入蒸餾水 35ml ， 10min 后棄之；4 消化：加入 2ml 0.5% 胰蛋白酶（ pH 1.52.0 ）消化液，置 37

9、 恒溫水浴中消化 30min ，在消化期間，沒隔 10min 用振蕩器振蕩 1 次；5 消化 30min 后，立即加生理鹽水終止消化；6 經(jīng) 300 目尼龍網(wǎng)過濾，未消化好的組織可做第二次消化；7 收集細(xì)胞懸液，離心沉淀 1500r/min ，再以生理鹽水洗滌 12 次，離心沉淀 500800r/min ，去碎片；8 保存細(xì)胞備用。四、外周血單個核細(xì)胞的制備1 取外周血 2ml ，肝素抗凝，用生理鹽水將血稀釋成 4ml ，混勻；2 將稀釋后的血液沿試管壁徐徐加入 4ml 淋巴細(xì)胞分離液 ficoll 到液面之上，勿用力過大，以免造成血液與分離液混合，保持清晰地分層狀態(tài)；3 離心 2000r/m

10、in ， 30min ，室溫 18 20 ，離心后可見試管內(nèi)的血液清楚地分為 4 層，上層為血漿層，中層為分離液層（單個核細(xì)胞處于血漿層和分離液層中間），底層為紅細(xì)胞層，紅細(xì)胞層上為粒細(xì)胞層；4 用吸管將上層與中層之間的單個核細(xì)胞層吸出收集到另 1 試管中，用生理鹽水洗 2 遍，每次均以 1500r/min ，離心 10min ，棄上清后即得到高純度的單個核細(xì)胞懸液；5 用適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ汗潭ɑ蛑玫蜏乇浔４娲?。五、骨髓?xì)胞單細(xì)胞懸液的制備1 無菌抽取骨髓液 0.5ml;2 將骨髓標(biāo)本滴入含 1000U/ml 肝素抗凝劑的 1ml PBS 液中；3 再加入 PBS 液稀釋至 10ml ；4 用吸

11、管吸取 5ml 稀釋骨髓液徐徐加入盛有 4ml 的人類淋巴細(xì)胞分離液液面之上；5 以上條件下，骨髓有核細(xì)胞分層在 PBS- 人類淋巴細(xì)胞分離液之間形成的界面上；6 取有核細(xì)胞層，加入到 10ml PBS 液中，混勻；7 以 1000r/min 離心 5min ，棄上清，收集骨髓細(xì)胞，加固定液或置低溫冰箱備用。六、單層培養(yǎng)細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備1 棄去培養(yǎng)細(xì)胞 ( 對數(shù)生長期 ) 中的舊培養(yǎng)液，加入 1 2ml 0 25 胰蛋白酶，倒置顯微鏡下觀察，見細(xì)胞稍變圓時，停止胰蛋白酶作用。也可直接觀察培養(yǎng)瓶，靜置消化 2 3 分鐘，待細(xì)胞逐漸變白，有脫落趨勢時，立即豎立培養(yǎng)瓶，停止胰蛋白酶作用，棄去胰蛋

12、白酶；2 加入 3 4ml 無鈣離子和鎂離子的 PBS 液，用吸管反復(fù)吹打，使其分散為單個細(xì)胞懸液，移人離心管中；3 短時低速離心，即 8001000r/min ，離心 5min ；4 去掉上清液，加入 58ml PBS 液，低速短時離心， 8001000r/min ，離心 35min ；重復(fù) 23 次，以去除細(xì)胞懸液中的細(xì)胞碎片。5 加少許 PBS 液，將沉淀細(xì)胞輕輕吹打均勻。加固定液或低溫保存待用。七、脫落細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備在臨床工作中，可以收集到大量自然脫落細(xì)胞，這些細(xì)胞標(biāo)本經(jīng)過簡單處理，便可成為較好的單細(xì)胞懸液供流式細(xì)胞術(shù)分析。主要包括脫落細(xì)胞、胸腹水細(xì)胞、尿液、內(nèi)鏡刷檢細(xì)胞等。（一

13、）食管拉網(wǎng)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液的制備1 將食管拉網(wǎng)器上的細(xì)胞洗脫到 20ml PBS 液中，以 1500r/min 離心后，再用 PBS 液洗 2 次，離心 500800r/min ， 12min ，棄上清；2 再加入 PBS 液 5ml ，以 300 目尼龍濾網(wǎng)過濾，離心沉淀去上清；3 加少許 PBS 液混勻沉淀細(xì)胞，加固定液或低溫保存，備用。（二）尿液脫落細(xì)胞的單細(xì)胞懸液的制備1 用以清潔器皿收集 24h 尿液，置 4 冰箱中自然沉淀 2h ，輕輕倒去上清液，留下少許帶細(xì)胞的沉淀物，用吸管移至 1020ml 離心管中；2 500r/min 離心 10min ， 去上清 ；3 加 PBS 液 810ml ，以 1000r/min 離心 10min ，去上清，重復(fù)再洗 1 次；4 再加 5ml PBS 液混勻，用 300 目尼龍濾網(wǎng)過濾，離心沉淀去上清；5 再加少許 PBS 液，混勻。加固定液或低溫保存，備用。（三）胸、腹水脫落細(xì)胞的制備1 抽取胸、腹水 50100ml ，加入 1000U/ml 肝素液 1ml ，放鹽水瓶中置于 4 冰箱中靜置 612h ，棄去上清；2 將底部 1020ml 用長吸管移入試管中，用 PBS 液洗 3 次，以 1500r/min 離心沉淀 5min ；3 再加 5ml PBS 液混勻，用 300 目尼龍濾網(wǎng)過濾，離心