1、艾塞那肽的合成艾塞那肽的合成1113510105 高燕1. 實驗材料 醋酸艾塞那肽標準品 0.23mmol/L Rink 酰胺 MBHA 樹脂 TFA （三氟乙酸） TIS DIC DCM DMF Cl-HOBt 哌啶 苯酚 甲醇 乙腈 無水乙醚 苯甲醚 五氧化二磷 無水碳酸鉀 水合茚三酮 1. 實驗材料 多肽試劑 Fmoc-Ala-OH Fmoc-Arg(Pbf)-OH 9 Fmoc-Asn(Trt)-OH Fmoc-Asp(OtBu)-OH 9 Fmoc-Gln(Trt)-OH Fmoc-Glu(OtBu)-OH Fmoc-Gly-OH Fmoc-His(Trt)-OH Fmoc-Ile-

2、OH Fmoc-Leu-OH Fmoc-Lys(Boc)-OH Fmoc-Met-OH Fmoc-Phe-OH Fmoc-Pro-OH Fmoc-Ser(tBu)-OH Fmoc-Thr(tBu)-OH Fmoc-Trp(Boc)-OH Fmoc-Val-OHFmoc：9-芴甲氧羰基可用作氨基保護基2 實驗儀器手動合成反應(yīng)器LC-10A型高效液相DK-S24 型電熱恒溫水浴鍋TDL80-2B型臺式離心機SHB-循環(huán)水式多用真空泵FDU-1200型冷凍干燥儀BS124S型電子天平HZQ-Q全溫振蕩器ZORBAX SB-C18型色譜柱；半制備柱(9.4*250mm)；分析柱（4.6*250mm）。

3、化學(xué)實驗室常用設(shè)備及玻璃儀器：鐵架臺；升降臺；圓底燒瓶；抽濾瓶；冷凝管；燒杯；試管等。 3 試劑處理 DMF（4L）加 80g 五氧化二磷放置 48h 以上，期間適當(dāng)搖晃，然后 105油浴減壓蒸餾出 DMF。此處理過的 DMF 專門用于配DIC、Cl-HOBt、25%哌啶溶液等。DCM（4L）加 100g 碳酸鉀放置 48h 以上。3 試劑處理 合成前需配備溶液： （1）DIC: 8mL DIC 加 DMF 至 100mL； （2）Cl-HOBt: 8.5g Cl-HOBt 加 DMF 溶解至 100mL； （3）脫保護試劑：25%哌啶溶液，哌啶加 DMF 配制； （4）茚三酮溶液：A：0.5

4、g 茚三酮加乙醇至 10mL；B：40g 苯酚加乙醇 10mL；C：吡啶溶液。 （5）切割試劑：TFA：10mL；苯甲醚：0.5mL；苯酚：0.5g；Tis：0.5mL；水：0.5mL。 （6）純化及分析流動相：A：乙腈（含 0.1%TFA）；B：水（含 0.1%TFA）。4 實驗原理 肽合成是一個反復(fù)添加氨基酸的過程，合成一般從 C-端（羧基端）向 N-端（氨基端）合成。固相合成基本過程是：先將所要合成肽鏈的 C-末端氨基酸以共價鍵的形式同一個不溶性的高分子樹脂相連，然后脫去 N-端的氨基保護基使氨基暴露出來同下一步氨基酸的活化羧基反應(yīng)，接長肽鏈。根據(jù)目標產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)重復(fù)（縮合洗滌去保護洗滌

5、下一輪縮合）操作，最后將肽鏈從樹脂上切割下來得到粗品，再經(jīng)過純化等處理，即得到所要的多肽。標準固相合成 按照艾塞那肽的氨基酸序列從 Ser 開始到 His 逐步縮合，氨基酸序列為： His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser。 分子量為 4186.6。稱取 435mg(0.1mmol) Rink 酰胺 MBHA 樹脂（負載量 0.

6、23 mmol/L）裝入反應(yīng)器，加入 DMF 溶液 4mL 溶脹 30min。事先稱好每步待反應(yīng)的氨基酸，用量為樹脂的 5 倍（0.5mmol）?？s合反應(yīng) 反應(yīng)從 Ser 開始。反應(yīng)步驟：加 25%哌啶溶液 4mL 混勻室溫振蕩 15min 脫樹脂F(xiàn)moc 保護基，過濾后換新的哌啶重復(fù)一次，依次用 DMF、甲醇、DCM 洗滌樹脂各2 次后抽干，加入第一步反應(yīng)物 Ser（192mg）和縮合劑（1.1mL 的 Cl-HOBt 和 DIC溶液）室溫振蕩反應(yīng) 2h，DMF、甲醇、DCM 洗滌樹脂 2 次后抽干。之后按氨基酸順序重復(fù)脫 Fmoc 保護基、縮合、洗滌 39 步至 N-端 His。最后脫除

7、His 上的 Fmoc 保護基，依次用 DCM、甲醇、DMF、DCM 各洗 2 次并抽干。 反應(yīng)程度鑒定 在每一次縮合及脫保護結(jié)束后需鑒定一下反應(yīng)是否完全，檢測試劑為茚三酮試劑A、B、C，茚三酮試劑可與游離氨基反應(yīng)程藍色。取小米粒大小樹脂顆粒放于試管中，分別加入茚三酮試劑 A、B、C 各 3 滴，100水浴加熱 3min，縮合反應(yīng)時，若樹脂顆粒為亮黃色說明游離氨基全被縮合，反應(yīng)完全，若顯藍色或淡藍色，說明反應(yīng)不完全，需減半劑量再次反應(yīng)。脫保護反應(yīng)時則相反，茚三酮反應(yīng)顯藍色證明脫保護完全。Pro 本身不顯色，延長反應(yīng)時間即可，無需鑒定。切割樹脂 加入切割試劑（TFA：10mL；苯甲醚：0.5mL

8、；苯酚：0.5g；Tis：0.5mL；水：0.5mL）室溫下反應(yīng) 2 小時，過濾反應(yīng)液至 50mL 離心管中，用少量 TFA（1mL）洗2 次樹脂，合并濾液，向離心管中直接加入無水乙醚（事先冰中冷卻）至 45mL 以上，充分混勻后放置此離心管于冰中冷卻 30min 沉淀多肽，離心，倒掉上清液，乙醚洗滌多肽沉淀 2-3 次后離心，得到的粗肽空氣中干燥。鑒定粗肽 將粗肽溶于醋酸：乙腈：水（1:1:8）中。高效液相色譜條件：安捷倫 ZORBAXSB-C18 型分析色譜柱(4.6*250mm)；波長 220nm；流速 1mL/min；進樣量 20L；流動相 A：水（含 0.1%TFA）；流動相 B：乙腈（含 0.1%TFA），洗脫梯度：初始梯度為 A 占 70%，A 的比例在 10min 內(nèi)降到 55%，然后保持 55%運行 15min，5min 內(nèi)降到 0%并保持 10min。質(zhì)譜分析粗品主峰分子量。純化粗肽 將粗肽溶解于醋酸：乙腈：水（1:1:8）中。半制備型高效液相梯度洗脫，采用安捷倫 ZORBAX SB-C18 型半制備色譜柱(9.4*250mm)，流速 4mL/min；波長 220nm；進樣量每次 1mL；流動相 A：水（含 0.1%TFA）；流動相 B：乙腈（含 0.1%TFA），摸索合適的洗脫梯度；收集產(chǎn)物峰，冷凍干燥得到純品。鑒定純肽 HPLC 法摸索合