1、蛋白質組學實驗蛋白質組學實驗2019.09考考 試試 安安 排排n科科 學學 素素 質：質：10%10%n實實 驗驗 操操 作：作：10%10%n實驗結果與報告：實驗結果與報告：40%40%n實驗原理檢驗：實驗原理檢驗： 40% 40%l課堂提問課堂提問l原始實驗記錄原始實驗記錄l團隊協作團隊協作l課堂紀律課堂紀律l儀器、器具的運用儀器、器具的運用l臺面整潔臺面整潔l考勤考勤l衛(wèi)生值日衛(wèi)生值日1 1、平常表現、平常表現2 2、以其中兩次實驗的操作為主要評分根據。、以其中兩次實驗的操作為主要評分根據。實驗結果與報告實驗結果與報告根據個人一切實驗的結果與實驗報告的根據個人一切實驗的結果與實驗報告的

2、評分，取平均分。評分，取平均分。實驗原理檢驗實驗原理檢驗 考試時間：第考試時間：第8 8周周 考試地點：本實驗室考試地點：本實驗室 考試方式：筆試考試方式：筆試 考試內容：考試內容： 實驗實際、知識、技巧：實驗中的各種小竅門，本卷實驗實際、知識、技巧：實驗中的各種小竅門，本卷須知，實際知識，操作要點等。須知，實際知識，操作要點等。實實 驗驗 一一目的基因的原核表達、純化及鑒定實驗目的實驗目的l掌握目的基因原核誘導表達的原理及方法掌握目的基因原核誘導表達的原理及方法l了解目的蛋白質了解目的蛋白質 “標簽純化的根本原理和方標簽純化的根本原理和方法法l掌握掌握PAGE變性凝膠電泳的原理及方法變性凝膠

3、電泳的原理及方法l掌握考馬斯亮藍染色的方法掌握考馬斯亮藍染色的方法l目的蛋白質的誘導表達l目的蛋白質的純化l目的蛋白質的檢測實驗原理實驗原理 轉化表達宿主菌轉化表達宿主菌 誘導優(yōu)化表達目的蛋白誘導優(yōu)化表達目的蛋白 純化目的蛋白純化目的蛋白1. 轉化帶有轉化帶有T7RNA 聚合酶基因聚合酶基因 的菌株的菌株1.確定表達時間和溫度的最正確條件確定表達時間和溫度的最正確條件2.分析蛋白溶解性分析蛋白溶解性3. SDS-PAGE, Western 印跡等印跡等 確定目的蛋白確定目的蛋白1. 放大培育放大培育2. 制備粗提物制備粗提物3. 親和純化親和純化一一目的蛋白的原核誘導表達目的蛋白的原核誘導表達

4、掌握蛋白質誘導表達的原理掌握蛋白質誘導表達的原理學習蛋白質誘導表達的方法學習蛋白質誘導表達的方法了解重組蛋白質表達的體系及其優(yōu)缺陷了解重組蛋白質表達的體系及其優(yōu)缺陷背景實際知識Section 1l蛋白質的表達是指為獲取大量的目的蛋白而進展的有目的性的蛋白質合成。l需將編碼所需蛋白的基因插入質?；蚱渌d體，然后導入活細胞，外源基因可在宿主細胞高效表達，從而獲得有重要價值的蛋白質產品。l包括外源基因的克隆、轉錄、翻譯、加工、分別純化。l進展大量表達和純化是為了在體外進展功能分析。外源基因的高效表達,獲得有重要價值的蛋白質產品需將編碼所需蛋白的基因插入質?；蚱渌d體,然后導入活細胞克隆獲得目的基因l

5、酵母表達系統酵母表達系統l 昆蟲表達系統昆蟲表達系統l 哺乳動物細胞表達系統哺乳動物細胞表達系統l表達的蛋白具有正常的活表達的蛋白具有正常的活性、構象性、構象l技術難度較大、耗時、耗技術難度較大、耗時、耗資資l大腸桿菌表達系統大腸桿菌表達系統l實驗技術簡單，時間較短，實驗技術簡單，時間較短，費用低，系統比較完備費用低，系統比較完備l不能有效地對重組蛋白質不能有效地對重組蛋白質進展修飾加工，易構成包進展修飾加工，易構成包涵體涵體原核細胞表達系統 真核細胞表達系統蛋白質表達系統蛋白質表達系統大腸桿菌系統由于遺傳學、生大腸桿菌系統由于遺傳學、生物化學、分子生物學方面已被物化學、分子生物學方面已被充分

6、了解而成為表達異源蛋白充分了解而成為表達異源蛋白質的首選表達系統。其遺傳圖質的首選表達系統。其遺傳圖譜明確，容易培育且費用低，譜明確，容易培育且費用低，消費本錢低廉。消費本錢低廉。原核表達的特點l細菌細菌RNARNA聚合酶不能辨仔細核基因啟動子聚合酶不能辨仔細核基因啟動子l真核基因真核基因mRNAmRNA無無SDSD序列，不能啟動翻譯序列，不能啟動翻譯l缺乏轉錄后加工系統，不能切除內含子缺乏轉錄后加工系統，不能切除內含子, , 要求要求cDNAcDNAl表達的蛋白不穩(wěn)定，容易被細菌蛋白酶破壞表達的蛋白不穩(wěn)定，容易被細菌蛋白酶破壞l缺乏翻譯后加工體系缺乏翻譯后加工體系l不溶性的包涵體不溶性的包涵

7、體在在E.ColiE.Coli中表達重組蛋白：中表達重組蛋白：目的基因受噬菌體目的基因受噬菌體T7T7強轉錄及強轉錄及翻譯信號控制翻譯信號控制表達由宿主細胞提供的表達由宿主細胞提供的T7 RNAT7 RNA聚合酶誘導聚合酶誘導充分誘導充分誘導: : 幾乎一切的細胞資源都幾乎一切的細胞資源都用于表達目的蛋白用于表達目的蛋白, , 數小時后數小時后達細胞總蛋白的達細胞總蛋白的50%50%以上以上非誘導條件下非誘導條件下: : 可使目的基因完全處于可使目的基因完全處于沉默形狀而不轉錄沉默形狀而不轉錄實驗原理實驗原理目的蛋白質的誘導表達目的蛋白質的誘導表達lacI LactoselacI是大腸桿菌中是

8、大腸桿菌中l(wèi)ac 支配子支配子Operon的調理基因，它所表的調理基因，它所表達的阻遏蛋白是達的阻遏蛋白是lac 支配基因支配基因Operator的抑制因子，抑制的抑制因子，抑制轉錄啟動。轉錄啟動。當有乳糖存在時，這種阻遏蛋白能當有乳糖存在時，這種阻遏蛋白能與過量的乳糖結合而失去對支配基與過量的乳糖結合而失去對支配基因的抑制，使因的抑制，使lac 支配子上的構造支配子上的構造基因基因lacZ-半乳糖苷酶半乳糖苷酶)、lacY透性酶透性酶)、lacA(乙?；D移酶乙?；D移酶得以正常表達，啟動轉錄。得以正常表達，啟動轉錄。IPTG異丙基異丙基-D-1-硫代半乳糖硫代半乳糖苷苷) 作為乳糖的類似物

9、與作為乳糖的類似物與lacI阻遏阻遏蛋白結合而使支配基因不被抑制，蛋白結合而使支配基因不被抑制，因此因此IPTG經常作為經常作為lac 支配子的誘支配子的誘導劑而運用。導劑而運用。實驗原理E.Coli BL21E.Coli BL21DE3DE3：DE3DE3是整合在細菌基因組上的一是整合在細菌基因組上的一種攜帶種攜帶T7 RNAT7 RNA聚合酶基因和聚合酶基因和lacIlacI基因的基因的噬菌體，其噬菌體，其基因型為：基因型為：lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5lacIlacI產生的

10、阻遏蛋白與產生的阻遏蛋白與laclac支配基因結合，從而不能支配基因結合，從而不能進展外源基因的轉錄和表達，此時宿主菌正常生長。進展外源基因的轉錄和表達，此時宿主菌正常生長。IPTGIPTG為乳糖的構造類似物，不能被細胞利用，特異結為乳糖的構造類似物，不能被細胞利用，特異結合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能與支配基因結合，那么外合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能與支配基因結合，那么外源基因大量轉錄并高效表達。源基因大量轉錄并高效表達。l原核表達系統菌株原核表達系統菌株l菌株內源的蛋白酶過多，能夠會呵斥外源表達產物菌株內源的蛋白酶過多，能夠會呵斥外源表達產物的不穩(wěn)定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成為理的不穩(wěn)定，所以

11、一些蛋白酶缺陷型菌株往往成為理想的起始表達菌株。想的起始表達菌株。l經典的經典的E. coli BL21系列就是系列就是lon和和ompT蛋白酶缺陷蛋白酶缺陷型。型。l大名鼎鼎的大名鼎鼎的BL21(DE3) 那么是添加那么是添加T7聚合酶基因，聚合酶基因，為為T7表達系統而設計。表達系統而設計。 l原核表達質粒的構建原核表達質粒的構建l目的基因目的基因l表達載體表達載體PlasmidTaglacIqPromoterAmpr多克隆位點多克隆位點l表達載體表達載體l能將外源基因運載到大腸桿菌細胞中能將外源基因運載到大腸桿菌細胞中;在根本在根本骨架的根底上添加表達元件，就構成了表達載骨架的根底上添加

12、表達元件，就構成了表達載體。體。l元件元件l啟動子、終止子、核糖體識別序列啟動子、終止子、核糖體識別序列l(wèi)誘導性表達所需求的元件誘導性表達所需求的元件l支配子序列支配子序列l(wèi)調控基因調控基因l多克隆位點多克隆位點l交融交融Tagl復制起始序列復制起始序列l(wèi)挑選標志挑選標志/報告基因報告基因l各種表達載體的不同之處各種表達載體的不同之處l 在于其表達元件的差別。在于其表達元件的差別。l啟動子的強弱是對表達量有決議性影響的要素之一。從轉錄方式上看有組成型表達和誘導調控型表達。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的啟動子，l 轉錄終止子l 核糖體結合位點啟動子、終止子、核糖體識別序列啟動子、終止

13、子、核糖體識別序列支配子序列及配套的調控基因支配子序列及配套的調控基因l誘導性表達所需求的元件多克隆位點多克隆位點復制起始序列復制起始序列l(wèi)挑選標志挑選標志/ /報告基因表達報告基因表達l抗藥性基因，抗藥性基因，AmpAmp是最常見的挑選標志，是最常見的挑選標志，kanakana，新霉素，四環(huán)素，紅霉素和氯霉素。新霉素，四環(huán)素，紅霉素和氯霉素。l抗性基因的選擇要留意能否會對研討對象產生抗性基因的選擇要留意能否會對研討對象產生干擾，比如代謝研討中要留意抗性基因編碼的干擾，比如代謝研討中要留意抗性基因編碼的酶能否和代謝物相互作用。酶能否和代謝物相互作用。lGFPGFP綠色熒光蛋白是最常用的報告基因

14、，綠色熒光蛋白是最常用的報告基因，半乳糖苷酶，熒光素酶。半乳糖苷酶，熒光素酶。l常用表達載體常用表達載體lpGEX系列載體是谷胱甘肽系列載體是谷胱甘肽S-轉移酶轉移酶GST交融蛋白表達系統的載體。交融蛋白表達系統的載體。lPtac PromoterlAmplpGEX KGlGST 26kDalpET系列的載體是系列的載體是His6交融蛋白的表達載體。交融蛋白的表達載體。lT7lKanalpET-DSBAl 6 His Tag 660Da-2kDapETpET系列系列pGEXpGEX系列系列DNADNA轉錄和轉錄和RNARNA翻譯，即遺傳信息從翻譯，即遺傳信息從基因流向基因流向RNARNA又流向

15、蛋白質的過程又流向蛋白質的過程總稱為基因表達總稱為基因表達, ,基因表達可以在基因表達可以在不同的程度上進展調控，如控制基不同的程度上進展調控，如控制基因的開啟、封鎖和活性的大小，影因的開啟、封鎖和活性的大小，影響和控制轉錄和翻譯等都屬于基因響和控制轉錄和翻譯等都屬于基因表達的調控。表達的調控。影響轉錄程度的要素：強啟動子，影響轉錄程度的要素：強啟動子，強終止子等。強終止子等。影響翻譯程度的要素：影響翻譯程度的要素：SDSD序列，序列，mRNAmRNA穩(wěn)定性等。穩(wěn)定性等。影響蛋白質程度的要素：異源蛋白，影響蛋白質程度的要素：異源蛋白，易降解。易降解。影響表達效率的主要要素優(yōu)化表達 1l添加蛋白

16、質溶解性及折疊添加蛋白質溶解性及折疊: :l 溫度溫度: 37: 37C C 蛋白質以聚集的方式表達蛋白質以聚集的方式表達-包包涵體涵體l 30 30C C 可溶的有活性的蛋白可溶的有活性的蛋白l 細胞周質定位細胞周質定位: : 有利于蛋白折疊及二硫鍵有利于蛋白折疊及二硫鍵的構成的構成l稀有密碼子稀有密碼子: : l 多數氨基酸都有一個以上的密碼子多數氨基酸都有一個以上的密碼子, , 但有但有一些一些 E. Coli E. Coli很少很少l 運用運用, , 當異源目的基因的當異源目的基因的mRNAmRNA過表達時過表達時, , tRNA tRNA 的數量直接的數量直接l 反響密碼子的偏倚性反

17、響密碼子的偏倚性, , 一個或多個一個或多個tRNAtRNA的的稀有或短少會導稀有或短少會導l 致翻譯的停頓致翻譯的停頓l毒性基因和質粒穩(wěn)定性毒性基因和質粒穩(wěn)定性: :l 抗生素的運用抗生素的運用 l 補充葡萄糖補充葡萄糖l提高翻譯程度：提高翻譯程度：l 調整調整SDSD序列與序列與AUGAUG間的間隔、點突變改動堿基、間的間隔、點突變改動堿基、添加添加mRNAmRNA穩(wěn)定性穩(wěn)定性l減輕細胞的代謝負荷，提高表達程度：減輕細胞的代謝負荷，提高表達程度：l 細菌的生長和外源基因的誘導表達分開。細菌的生長和外源基因的誘導表達分開。l 化學誘導，溫度誘導。化學誘導，溫度誘導。l提高蛋白質穩(wěn)定性，防止降

18、解。提高蛋白質穩(wěn)定性，防止降解。l 表達交融蛋白，表達分泌蛋白防止降解，減表達交融蛋白，表達分泌蛋白防止降解，減輕代謝負荷、恢復天然構象輕代謝負荷、恢復天然構象優(yōu)化表達 2實驗操作Section 2實驗器材1 1、E. coli BL21(DE3)/pET-DSBAE. coli BL21(DE3)/pET-DSBA 每組同窗每組同窗30ml30ml菌液菌液/ /三角瓶三角瓶2 2、IPTG IPTG 乳糖構造類似物乳糖構造類似物3 3、LB(Ampr)LB(Ampr)4 4、搖床、搖床5 5、離心機、離心機實驗步驟(1)l原核表達載體轉化到原核表達載體轉化到BL21(DE3)BL21(DE3)菌株中。菌株中。l挑取單菌落于挑取單菌落于2 mL Amp+ LB2 mL Amp+ LB培育基培育基3737振振蕩培育過夜。已做蕩培育過夜。已做l以以1%1%的比例轉接于的比例轉接于20 mL Ampr LB20 mL Ampr LB培育基中，培育基中， 3737振蕩培育約振蕩培育約1 1小時至小時至OD600=0.4-0.6OD600=0.4-0.6，即可開場誘導目的蛋白的表達。即可開場誘導目的蛋白的表達。l取取1mL1mL菌液菌液, ,制樣作為未誘導對照。制樣作為未誘導對照。l三角瓶中參與三角瓶中參與IPTG 20 uLIPTG 20 uL至終濃度為至終濃