1、第六章第六章 目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞及重組子目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞及重組子的篩選的篩選第一節(jié)第一節(jié) 受體細(xì)胞受體細(xì)胞受體細(xì)胞（受體細(xì)胞（receptor cellreceptor cell）：又稱宿主細(xì)胞或寄主細(xì)胞：又稱宿主細(xì)胞或寄主細(xì)胞（host cellhost cell），從實驗技術(shù)上講是能攝取外源），從實驗技術(shù)上講是能攝取外源DNADNA并使其穩(wěn)定并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞；從實驗?zāi)康纳现v是有應(yīng)用價值和理論研究價值的維持的細(xì)胞；從實驗?zāi)康纳现v是有應(yīng)用價值和理論研究價值的細(xì)胞。細(xì)胞。 隨著基因工程的發(fā)展，從低等的原核細(xì)胞，到簡單的真核細(xì)隨著基因工程的發(fā)展，從低等的原核細(xì)胞，到簡單的真核細(xì)胞，進(jìn)一步

2、到結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高等動、植物細(xì)胞都可以作為基因工胞，進(jìn)一步到結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高等動、植物細(xì)胞都可以作為基因工程的受體細(xì)胞。程的受體細(xì)胞。1.1.受體細(xì)胞的概念受體細(xì)胞的概念2.2.受體細(xì)胞選擇所應(yīng)遵循的原則受體細(xì)胞選擇所應(yīng)遵循的原則便于重組便于重組DNADNA分子導(dǎo)入。分子導(dǎo)入。能使重組能使重組DNADNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中。（如：限制性內(nèi)切酶分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中。（如：限制性內(nèi)切酶缺陷型，避免其對重組缺陷型，避免其對重組DNADNA分子的降解破壞作用。）分子的降解破壞作用。）便于重組體的篩選。（選擇與載體所含的選擇標(biāo)記相匹配的便于重組體的篩選。（選擇與載體所含的選擇標(biāo)記相匹配的受體細(xì)胞基因型）受體細(xì)

3、胞基因型）遺傳穩(wěn)定性高，易于擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵生長。遺傳穩(wěn)定性高，易于擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵生長。安全性高，無致病性，不會對外界環(huán)境造成生物污染。安全性高，無致病性，不會對外界環(huán)境造成生物污染。選用內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的細(xì)胞，利于選用內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的細(xì)胞，利于外源基因蛋白表達(dá)產(chǎn)物在胞內(nèi)的積累，或促進(jìn)外源基因的高效外源基因蛋白表達(dá)產(chǎn)物在胞內(nèi)的積累，或促進(jìn)外源基因的高效分泌表達(dá)。分泌表達(dá)。受體細(xì)胞在遺傳密碼的應(yīng)用上無明顯的偏倚性。受體細(xì)胞在遺傳密碼的應(yīng)用上無明顯的偏倚性。具有較好的轉(zhuǎn)譯后加工機(jī)制，便于真核目的基因的高效表達(dá)。具有較好的轉(zhuǎn)譯后加工機(jī)制，便于真核目的基因的高效

4、表達(dá)。在理論研究和生產(chǎn)實踐上有較高的應(yīng)用價值。在理論研究和生產(chǎn)實踐上有較高的應(yīng)用價值。3.3.各種類型受體細(xì)胞的優(yōu)缺點(diǎn)各種類型受體細(xì)胞的優(yōu)缺點(diǎn)（1 1）原核細(xì)胞）原核細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)大部分原核細(xì)胞沒有纖維素組成的堅硬細(xì)胞壁，便于外源大部分原核細(xì)胞沒有纖維素組成的堅硬細(xì)胞壁，便于外源DNADNA的進(jìn)入。的進(jìn)入。沒有核膜，染色體沒有核膜，染色體DNADNA沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)，這為外源沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)，這為外源DNADNA與裸露的染色體與裸露的染色體DNADNA重組減少了麻煩。重組減少了麻煩?；蚪M簡單，不含線粒體和葉綠體基因組，便于對引入的外基因組簡單，不含線粒體和葉綠體基因組，便于對引入的外源

5、基因進(jìn)行遺傳分析。源基因進(jìn)行遺傳分析。原核生物多數(shù)為單細(xì)胞生物，容易獲得一致性的的實驗材料，原核生物多數(shù)為單細(xì)胞生物，容易獲得一致性的的實驗材料，并且培養(yǎng)簡單，繁殖迅速，實驗周期短，重復(fù)實驗快。并且培養(yǎng)簡單，繁殖迅速，實驗周期短，重復(fù)實驗快。缺點(diǎn)缺點(diǎn) 由于原核細(xì)胞缺乏真核生物具有的由于原核細(xì)胞缺乏真核生物具有的RNARNA轉(zhuǎn)錄后加工、修飾系轉(zhuǎn)錄后加工、修飾系統(tǒng)、蛋白質(zhì)翻譯后加工、修飾、折疊復(fù)性系統(tǒng)，使某些真核細(xì)統(tǒng)、蛋白質(zhì)翻譯后加工、修飾、折疊復(fù)性系統(tǒng)，使某些真核細(xì)胞中編碼蛋白的基因不能夠在原核細(xì)胞中表達(dá)，甚至即使獲得胞中編碼蛋白的基因不能夠在原核細(xì)胞中表達(dá)，甚至即使獲得了表達(dá)，也不具有正常的生

6、物學(xué)活性。了表達(dá)，也不具有正常的生物學(xué)活性。常用作受體細(xì)胞的原核生物：大腸桿菌、枯草桿菌、藍(lán)藻等。常用作受體細(xì)胞的原核生物：大腸桿菌、枯草桿菌、藍(lán)藻等。大腸桿菌：大腸桿菌：基因背景清楚，繁殖迅速，培養(yǎng)簡單。基因背景清楚，繁殖迅速，培養(yǎng)簡單。 細(xì)胞膜間隙中含有大量的內(nèi)毒素，可導(dǎo)致人體熱原細(xì)胞膜間隙中含有大量的內(nèi)毒素，可導(dǎo)致人體熱原 反映。目前已實現(xiàn)商品化的基因工程產(chǎn)品中，大部分是由大腸反映。目前已實現(xiàn)商品化的基因工程產(chǎn)品中，大部分是由大腸桿菌工程菌生產(chǎn)的。桿菌工程菌生產(chǎn)的?？莶輻U菌：枯草桿菌：基因背景清楚，繁殖迅速，培養(yǎng)簡單。能將基因基因背景清楚，繁殖迅速，培養(yǎng)簡單。能將基因表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基

7、中，不產(chǎn)生內(nèi)毒素，具有芽孢行成能力，表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，不產(chǎn)生內(nèi)毒素，具有芽孢行成能力，易于保存和培養(yǎng)。易于保存和培養(yǎng)。藍(lán)藻：藍(lán)藻：是一種自養(yǎng)生物，培養(yǎng)簡便易行；可成為植物基因表達(dá)是一種自養(yǎng)生物，培養(yǎng)簡便易行；可成為植物基因表達(dá)的宿主。的宿主。（2 2）真菌細(xì)胞）真菌細(xì)胞 真菌是低等的真核生物，基因結(jié)構(gòu)簡單，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制真菌是低等的真核生物，基因結(jié)構(gòu)簡單，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及蛋白質(zhì)的加工與分泌都有真核生物的特征，因此可用于表以及蛋白質(zhì)的加工與分泌都有真核生物的特征，因此可用于表達(dá)真核生物的基因。常用的真菌細(xì)胞有酵母等。達(dá)真核生物的基因。常用的真菌細(xì)胞有酵母等。（3 3）植物細(xì)胞）植物細(xì)

8、胞優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：植物細(xì)胞具有全能性，一個細(xì)胞就能分化成一株完整的植物細(xì)胞具有全能性，一個細(xì)胞就能分化成一株完整的植株，這就意味著一個獲得外源基因的植物細(xì)胞就能培養(yǎng)成穩(wěn)植株，這就意味著一個獲得外源基因的植物細(xì)胞就能培養(yǎng)成穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植物。定遺傳的轉(zhuǎn)基因植物。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：具有堅硬的細(xì)胞壁，外源基因無法直接導(dǎo)入。具有堅硬的細(xì)胞壁，外源基因無法直接導(dǎo)入。方法方法：（a a）經(jīng)纖維素酶處理去掉細(xì)胞壁后獲得原生質(zhì)體。）經(jīng)纖維素酶處理去掉細(xì)胞壁后獲得原生質(zhì)體。 （b b）不必去掉細(xì)胞壁，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍等。）不必去掉細(xì)胞壁，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍等。（4 4）動物細(xì)胞）動物細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：動物細(xì)胞具

9、有動物細(xì)胞具有RNARNA的轉(zhuǎn)錄后的剪接、加工機(jī)制，蛋白質(zhì)翻譯的轉(zhuǎn)錄后的剪接、加工機(jī)制，蛋白質(zhì)翻譯后的加工、修飾機(jī)制，蛋白產(chǎn)物的生物學(xué)活性及免疫原性好。后的加工、修飾機(jī)制，蛋白產(chǎn)物的生物學(xué)活性及免疫原性好。易被重組質(zhì)粒易被重組質(zhì)粒DNADNA轉(zhuǎn)染，具有遺傳穩(wěn)定性和可重復(fù)性。轉(zhuǎn)染，具有遺傳穩(wěn)定性和可重復(fù)性?？蓪⒈磉_(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，便于分離、純化?？蓪⒈磉_(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，便于分離、純化。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 不能通過一個細(xì)胞的培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因動物。在獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)不能通過一個細(xì)胞的培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因動物。在獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞后，需采用體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因動物。胞后，需采用體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因動物。

10、第二節(jié)第二節(jié) 重組重組DNADNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞分子導(dǎo)入受體細(xì)胞1.1.重組重組DNADNA分子導(dǎo)入原核細(xì)胞分子導(dǎo)入原核細(xì)胞（1 1）重組質(zhì)粒）重組質(zhì)粒DNADNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)化（transformation)transformation)：重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒DNADNA分子通過與膜蛋白結(jié)分子通過與膜蛋白結(jié)合進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程稱之合進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程稱之為轉(zhuǎn)化。為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化的方法制備感受態(tài)細(xì)胞法制備感受態(tài)細(xì)胞法感受態(tài)細(xì)胞：處于能吸收周圍環(huán)境中感受態(tài)細(xì)胞：處于能吸收周圍環(huán)境中DNADNA分子的生理狀

11、態(tài)的細(xì)分子的生理狀態(tài)的細(xì)胞。胞。制備感受態(tài)大腸桿菌一般利用制備感受態(tài)大腸桿菌一般利用CaClCaCl2 2處理。處理。電穿孔轉(zhuǎn)化法電穿孔轉(zhuǎn)化法 其基本原理是利用電穿孔儀的高壓電脈沖作用，在大腸桿菌其基本原理是利用電穿孔儀的高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細(xì)胞膜上進(jìn)行電穿孔，形成可逆的瞬間的通道，從而促進(jìn)外源細(xì)胞膜上進(jìn)行電穿孔，形成可逆的瞬間的通道，從而促進(jìn)外源DNADNA的有效吸收。轉(zhuǎn)化效率受電場強(qiáng)度、脈沖時間和外源的有效吸收。轉(zhuǎn)化效率受電場強(qiáng)度、脈沖時間和外源DNADNA濃濃度的影響。度的影響。三親本雜交接合轉(zhuǎn)化大腸桿菌三親本雜交接合轉(zhuǎn)化大腸桿菌轉(zhuǎn)化率的計算及其影響因素轉(zhuǎn)化率的計算及其影響因素轉(zhuǎn)化

12、率：轉(zhuǎn)化率：DNADNA分子轉(zhuǎn)化受體菌獲得轉(zhuǎn)化子的效率。分子轉(zhuǎn)化受體菌獲得轉(zhuǎn)化子的效率。轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率 = = 轉(zhuǎn)化子數(shù)轉(zhuǎn)化子數(shù) / DNA/ DNA分子數(shù)分子數(shù) （1010-5-5表示表示10105 5個個DNADNA分子獲分子獲 得一個轉(zhuǎn)化子）得一個轉(zhuǎn)化子）或或 轉(zhuǎn)化子數(shù)轉(zhuǎn)化子數(shù) / DNA/ DNA質(zhì)量（質(zhì)量（10106 6/ /g g表示表示1 1 g DNAg DNA分子得分子得10106 6個轉(zhuǎn)個轉(zhuǎn)化子）化子）影響轉(zhuǎn)化率的因素影響轉(zhuǎn)化率的因素a a：重組：重組DNADNA分子的大小、構(gòu)型、濃度、純度及載體與受體細(xì)胞分子的大小、構(gòu)型、濃度、純度及載體與受體細(xì)胞的親和性。的親和性。b b

13、：菌株類型：菌株類型c c：轉(zhuǎn)化方法：電穿孔法最高，：轉(zhuǎn)化方法：電穿孔法最高，CaClCaCl2 2誘導(dǎo)法居中，三親本雜交誘導(dǎo)法居中，三親本雜交接合法最低。接合法最低。（2 2）重組）重組嗜菌體嗜菌體DNADNA分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)染（transfectiontransfection）及轉(zhuǎn)導(dǎo)（）及轉(zhuǎn)導(dǎo)（transductiontransduction）轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染：將重組將重組噬菌體噬菌體DNADNA分子直接導(dǎo)入受體細(xì)胞中的過程稱分子直接導(dǎo)入受體細(xì)胞中的過程稱為轉(zhuǎn)染。為轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)導(dǎo)：轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過通過噬菌體顆粒感染宿主細(xì)胞的途徑把外源噬菌體顆粒感染宿主細(xì)胞的途徑把外源DNADNA分

14、子分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)的過程。轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)的過程。 采用采用噬菌體噬菌體DNADNA直接轉(zhuǎn)染大腸桿菌的效率很低，所以需對直接轉(zhuǎn)染大腸桿菌的效率很低，所以需對重組的重組的噬菌體噬菌體DNADNA進(jìn)行體外包裝后，再通過轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法感染進(jìn)行體外包裝后，再通過轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法感染大腸桿菌。大腸桿菌。體外包裝體外包裝體外包裝：體外包裝：在體外模擬在體外模擬噬菌體噬菌體DNADNA分子在受體細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的分子在受體細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的一系列特殊的包裝反應(yīng)過程，將重組一系列特殊的包裝反應(yīng)過程，將重組噬菌體噬菌體DNADNA分子包裝成分子包裝成成熟的具有感染能力的成熟的具有感染能力的噬菌體顆粒的技術(shù)。噬菌體顆粒的技術(shù)。原理

15、：原理：根據(jù)根據(jù)噬菌體噬菌體DNADNA分子體內(nèi)包裝的途徑，分別獲得缺失分子體內(nèi)包裝的途徑，分別獲得缺失D D包裝蛋白的包裝蛋白的噬菌體突變株和缺失噬菌體突變株和缺失E E包裝蛋白的包裝蛋白的噬菌體突變噬菌體突變株。由于兩種突變株均不具有完整的包裝蛋白，都不能單獨(dú)的株。由于兩種突變株均不具有完整的包裝蛋白，都不能單獨(dú)的包裝包裝噬菌體噬菌體DNADNA。但將兩種突變株分別感染大腸桿菌后，從。但將兩種突變株分別感染大腸桿菌后，從中提取缺失中提取缺失D D蛋白的包裝物（含蛋白的包裝物（含E E蛋白）和缺失蛋白）和缺失E E蛋白的包裝物蛋白的包裝物（含（含D D蛋白），兩者混合后就能包裝蛋白），兩者混

16、合后就能包裝噬菌體噬菌體DNADNA。2.2.重組重組DNADNA分子轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞分子轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞 由于真核生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、基因組成和基因表達(dá)較為復(fù)雜，由于真核生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、基因組成和基因表達(dá)較為復(fù)雜，適用于原核生物的轉(zhuǎn)基因方法大多難以有效的用于真核生物。適用于原核生物的轉(zhuǎn)基因方法大多難以有效的用于真核生物。但近年來經(jīng)過摸索，建立了一系列適用于真核生物的轉(zhuǎn)基因方但近年來經(jīng)過摸索，建立了一系列適用于真核生物的轉(zhuǎn)基因方法，并用這些方法有效的獲得了轉(zhuǎn)基因真核生物。法，并用這些方法有效的獲得了轉(zhuǎn)基因真核生物。（1 1）重組）重組DNADNA分子導(dǎo)入植物細(xì)胞分子導(dǎo)入植物細(xì)胞農(nóng)桿菌介導(dǎo)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti

17、Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌能侵入植物傷口處細(xì)胞中，其所具有的內(nèi)源質(zhì)粒農(nóng)桿菌能侵入植物傷口處細(xì)胞中，其所具有的內(nèi)源質(zhì)粒-Ti-Ti質(zhì)粒的質(zhì)粒的T-DNAT-DNA能轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)部。因此，將外源基因與能轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)部。因此，將外源基因與TiTi質(zhì)粒質(zhì)粒重組構(gòu)建載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)可將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞中。重組構(gòu)建載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)可將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞中。多聚物介導(dǎo)法多聚物介導(dǎo)法 一些多聚物（聚乙二醇、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等）和二一些多聚物（聚乙二醇、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等）和二價陽離子（價陽離子（CaCa2+2+、 MgMg2+2+、 MnMn2+2+等）于等）于DNAD

18、NA混合，能在原生質(zhì)體混合，能在原生質(zhì)體表面形成沉淀顆粒，通過原生質(zhì)體的內(nèi)吞噬作用而被吸收進(jìn)入表面形成沉淀顆粒，通過原生質(zhì)體的內(nèi)吞噬作用而被吸收進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)。電穿孔法電穿孔法 同原核細(xì)胞的電穿孔法。同原核細(xì)胞的電穿孔法。激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法 利用直徑很小，能量很高的激光微束在細(xì)胞膜上造成可逆性利用直徑很小，能量很高的激光微束在細(xì)胞膜上造成可逆性微孔，處于細(xì)胞周圍的微孔，處于細(xì)胞周圍的DNADNA分子隨之進(jìn)入細(xì)胞。分子隨之進(jìn)入細(xì)胞。超聲波介導(dǎo)轉(zhuǎn)化超聲波介導(dǎo)轉(zhuǎn)化 超聲波處理原生質(zhì)體，使其細(xì)胞膜上形成可逆性微孔，使外超聲波處理原生質(zhì)體，使其細(xì)胞膜上形成可逆性微孔，使外源源DNA

19、DNA進(jìn)入細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞?；驑尫ɑ驑尫?利用高速運(yùn)行的金屬顆粒轟擊細(xì)胞時能進(jìn)入細(xì)胞，將包裹在利用高速運(yùn)行的金屬顆粒轟擊細(xì)胞時能進(jìn)入細(xì)胞，將包裹在金屬顆粒表面的外源金屬顆粒表面的外源DNADNA分子隨之帶入細(xì)胞。分子隨之帶入細(xì)胞。脂質(zhì)體介導(dǎo)法脂質(zhì)體介導(dǎo)法 脂質(zhì)體（脂質(zhì)體（liposomeliposome）是由人工構(gòu)建的磷脂雙分子層組成的膜是由人工構(gòu)建的磷脂雙分子層組成的膜狀結(jié)構(gòu)，可以將狀結(jié)構(gòu)，可以將DNADNA包在其中，并通過脂質(zhì)體與原生質(zhì)體的融包在其中，并通過脂質(zhì)體與原生質(zhì)體的融合或由于原生質(zhì)體的吞噬過程，把外源合或由于原生質(zhì)體的吞噬過程，把外源DNADNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。顯微

20、注射法顯微注射法 顯微注射法是一種利用顯微操作儀，通過機(jī)械的方法把外源顯微注射法是一種利用顯微操作儀，通過機(jī)械的方法把外源DNADNA直接注入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核的基因轉(zhuǎn)移方法。早期該技術(shù)主直接注入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核的基因轉(zhuǎn)移方法。早期該技術(shù)主要用于動物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化等方面，現(xiàn)在逐步應(yīng)用到植物細(xì)胞要用于動物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化等方面，現(xiàn)在逐步應(yīng)用到植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化操作中，成為一種重要的植物轉(zhuǎn)基因手段。的轉(zhuǎn)化操作中，成為一種重要的植物轉(zhuǎn)基因手段。花粉管通道法花粉管通道法 此法是將外源此法是將外源DNADNA涂于授粉的枝頭上，使涂于授粉的枝頭上，使DNADNA沿花粉管通道或沿花粉管通道或傳遞組織通過珠心進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)

21、化還不具正常細(xì)胞壁的卵、合傳遞組織通過珠心進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化還不具正常細(xì)胞壁的卵、合子及早期的胚胎細(xì)胞。子及早期的胚胎細(xì)胞。3.3.重組重組DNADNA分子導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞分子導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞 哺乳動物的細(xì)胞很難捕獲外源哺乳動物的細(xì)胞很難捕獲外源DNADNA，這明顯影響了哺乳動物，這明顯影響了哺乳動物基因工程的發(fā)展。近年來通過探索已建立了幾種能有效地將外基因工程的發(fā)展。近年來通過探索已建立了幾種能有效地將外源源DNADNA導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的方法。導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的方法。病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法磷酸鈣轉(zhuǎn)染法磷酸鈣轉(zhuǎn)染法 哺乳動物的細(xì)胞能捕獲黏附在細(xì)胞表面的哺乳動物的細(xì)胞能捕獲黏附在細(xì)胞表面的DN

22、A-DNA-磷酸鈣沉淀物，磷酸鈣沉淀物，使使DNADNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)入細(xì)胞。DEAE-DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法葡聚糖轉(zhuǎn)染法 二乙胺乙基葡聚糖是一種高分子質(zhì)量的多聚陽離子試劑，能二乙胺乙基葡聚糖是一種高分子質(zhì)量的多聚陽離子試劑，能促進(jìn)哺乳動物細(xì)胞捕獲外源促進(jìn)哺乳動物細(xì)胞捕獲外源DNADNA，實現(xiàn)短時間的有效表達(dá)。，實現(xiàn)短時間的有效表達(dá)。聚陽離子聚陽離子-DMSO-DMSO轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染法 此方法采用聚陽離子此方法采用聚陽離子poly-brenepoly-brene處理哺乳動物細(xì)胞，增加細(xì)處理哺乳動物細(xì)胞，增加細(xì)胞表面對胞表面對DNADNA的吸附能力，然后再用的吸附能力，然后再用25%-30%DMSO2

23、5%-30%DMSO短暫處理細(xì)胞，短暫處理細(xì)胞，增加膜的通透性，提高對增加膜的通透性，提高對DNADNA的捕獲量。的捕獲量。顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)電穿孔電穿孔DNADNA轉(zhuǎn)移技術(shù)轉(zhuǎn)移技術(shù)脂質(zhì)體介導(dǎo)法脂質(zhì)體介導(dǎo)法活化菌種，擴(kuò)大培養(yǎng)，使其活化菌種，擴(kuò)大培養(yǎng)，使其處 于 對 數(shù) 生 長 后 期處 于 對 數(shù) 生 長 后 期（OD600=0.4）3-4 ml菌液冰水浴中菌液冰水浴中10分鐘，分鐘，4 離心集菌離心集菌菌 體 懸 浮 于 含菌 體 懸 浮 于 含CaCl2的預(yù)冷緩的預(yù)冷緩沖液中，冰水浴沖液中，冰水浴15min， 4 離離心集菌，棄上清，心集菌，棄上清，沉 淀 物 重 懸 于

24、沉 淀 物 重 懸 于CaCl2的預(yù)冷緩的預(yù)冷緩沖液中，沖液中，4 下下放置放置12-14 h0.2 ml新制備好新制備好的感受細(xì)胞中加的感受細(xì)胞中加入緩沖液溶解的入緩沖液溶解的重組重組DNA，置于，置于冰水浴中冰水浴中1 h以以上，期間輕搖幾上，期間輕搖幾次次轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)入42 水浴水浴上上2 min，使，使感受態(tài)細(xì)胞吸感受態(tài)細(xì)胞吸收重組收重組DNA。轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)入37 水浴水浴上上5 min， 加入加入1 ml不含選擇性不含選擇性藥物的藥物的LB培養(yǎng)培養(yǎng)基基篩選轉(zhuǎn)化子篩選轉(zhuǎn)化子37 震蕩培養(yǎng)震蕩培養(yǎng)30-60 min鋪板培養(yǎng)鋪板培養(yǎng)圖圖6.1 6.1 感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化圖圖6

25、.2 6.2 噬菌體的體外包裝噬菌體的體外包裝圖圖6.3 6.3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法第三節(jié)第三節(jié) 重組子的篩選重組子的篩選 在重組在重組DNADNA分子的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，并非所有的受分子的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，并非所有的受體細(xì)胞都能被導(dǎo)入重組體細(xì)胞都能被導(dǎo)入重組DNADNA分子，一般僅有少數(shù)重組分子，一般僅有少數(shù)重組DNADNA分子能分子能進(jìn)入受體細(xì)胞。再者，在這些被轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞中，除部分含進(jìn)入受體細(xì)胞。再者，在這些被轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞中，除部分含有我們期待的有我們期待的DNADNA分子外，另外一些還可能是由于載體自身或分子外，另外一些還可能是由于載體自身或一個載體與多個外源一個

26、載體與多個外源DNADNA片段形成的非期待重組片段形成的非期待重組DNADNA分子導(dǎo)入所分子導(dǎo)入所致。因此，需要采取必要的方法將重組子從大量的受體細(xì)胞中致。因此，需要采取必要的方法將重組子從大量的受體細(xì)胞中篩選出來。篩選出來。轉(zhuǎn)化子：轉(zhuǎn)化子：導(dǎo)入外源導(dǎo)入外源DNADNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)分子后能穩(wěn)定存在的受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)化子?；印Ｖ亟M子：重組子：含有重組含有重組DNADNA分子的轉(zhuǎn)化子稱為重組子。分子的轉(zhuǎn)化子稱為重組子。陽性克隆子（期望重組子）：陽性克隆子（期望重組子）：含有外源目的基因的重組子稱含有外源目的基因的重組子稱為陽性克隆子或期望重組子。為陽性克隆子或期望重組子。篩選（

27、選擇）：篩選（選擇）：經(jīng)過各種方法將外源經(jīng)過各種方法將外源DNADNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞分子導(dǎo)入受體細(xì)胞后，獲得所需陽性克隆子的過程稱為克隆子的篩選或選擇。后，獲得所需陽性克隆子的過程稱為克隆子的篩選或選擇。1.1.遺傳表型直接篩選法遺傳表型直接篩選法 在構(gòu)建基因工程載體時，載體在構(gòu)建基因工程載體時，載體DNADNA分子上通常攜帶了一定的分子上通常攜帶了一定的選擇性遺傳標(biāo)記基因選擇性遺傳標(biāo)記基因，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后可以使后者呈現(xiàn)，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后可以使后者呈現(xiàn)出特殊的表型或遺傳學(xué)特征，據(jù)此可進(jìn)行轉(zhuǎn)化子或重組子的初出特殊的表型或遺傳學(xué)特征，據(jù)此可進(jìn)行轉(zhuǎn)化子或重組子的初步篩選。步篩選。 一般的

28、做法是將轉(zhuǎn)化處理后的菌液（包括對照處理）適量涂一般的做法是將轉(zhuǎn)化處理后的菌液（包括對照處理）適量涂布在布在選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基上，在最適生長溫度條件下培養(yǎng)一段時間，觀上，在最適生長溫度條件下培養(yǎng)一段時間，觀察菌落生長情況，即可挑選出轉(zhuǎn)化子。察菌落生長情況，即可挑選出轉(zhuǎn)化子?？顾幮院Y選抗藥性篩選 氨芐青霉素（氨芐青霉素（AmpAmp）、氯霉素（）、氯霉素（CmpCmp）、卡那霉素（）、卡那霉素（KanKan）、）、四環(huán)素（四環(huán)素（TetTet）、鏈霉素（）、鏈霉素（StrStr） 主要用于重組質(zhì)粒主要用于重組質(zhì)粒DNADNA分子的轉(zhuǎn)化子的篩選。在含相應(yīng)抗生分子的轉(zhuǎn)化子的篩選。在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)

29、基上，含重組質(zhì)粒的受體菌能存活，不含重組質(zhì)粒的素的培養(yǎng)基上，含重組質(zhì)粒的受體菌能存活，不含重組質(zhì)粒的受體菌不能存活。受體菌不能存活。插入失活篩選法插入失活篩選法 外源外源DNADNA的插入特定載體后導(dǎo)致遺傳標(biāo)記基因失活，借此篩的插入特定載體后導(dǎo)致遺傳標(biāo)記基因失活，借此篩選重組子。選重組子。插入表達(dá)篩選法插入表達(dá)篩選法 與插入失活策略向相反，插入表達(dá)法是利用外源與插入失活策略向相反，插入表達(dá)法是利用外源DNADNA插入特插入特定載體后導(dǎo)致遺傳標(biāo)記基因表達(dá)，借此篩選重組子。定載體后導(dǎo)致遺傳標(biāo)記基因表達(dá)，借此篩選重組子。顯色互補(bǔ)篩選法顯色互補(bǔ)篩選法 LacZLacZ基因的藍(lán)白斑篩選基因的藍(lán)白斑篩選形

30、成嗜菌斑篩選法形成嗜菌斑篩選法 對于對于DNADNA載體系統(tǒng)，只有在外源載體系統(tǒng)，只有在外源DNADNA插入載體后，重組的插入載體后，重組的DNADNA分子大小在野生型分子大小在野生型DNADNA分子的分子的7878%-105%-105%范圍內(nèi)時，才能范圍內(nèi)時，才能在體外包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。后者在轉(zhuǎn)導(dǎo)受體菌在體外包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。后者在轉(zhuǎn)導(dǎo)受體菌后，轉(zhuǎn)化子在培養(yǎng)基上被裂解形成嗜菌斑，而非轉(zhuǎn)化子能正常后，轉(zhuǎn)化子在培養(yǎng)基上被裂解形成嗜菌斑，而非轉(zhuǎn)化子能正常生長，兩者很容易區(qū)分。生長，兩者很容易區(qū)分。2.DNA2.DNA電泳檢測法電泳檢測法直接電泳檢測法直接電泳檢測法 重組

31、的質(zhì)粒重組的質(zhì)粒DNADNA分子由于有外源分子由于有外源DNADNA的插入，比未插入外源的插入，比未插入外源DNADNA的質(zhì)粒載體大，通過凝膠電泳就可將重組子篩選出來。的質(zhì)粒載體大，通過凝膠電泳就可將重組子篩選出來。酶切電泳篩選法酶切電泳篩選法 通過直接電泳檢測法篩選出來的重組子，插入的外源通過直接電泳檢測法篩選出來的重組子，插入的外源DNADNA不不一定是目的一定是目的DNADNA片段。通過將重組子中的質(zhì)粒進(jìn)行酶切，然后片段。通過將重組子中的質(zhì)粒進(jìn)行酶切，然后再進(jìn)行電泳，就可將陽性克隆子篩選出來。再進(jìn)行電泳，就可將陽性克隆子篩選出來。PCRPCR檢測法檢測法 外源外源DNADNA的兩側(cè)序列多

32、為已知序列，通過的兩側(cè)序列多為已知序列，通過PCRPCR擴(kuò)增外源擴(kuò)增外源DNADNA，然后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，就可篩選出陽性克隆子。然后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，就可篩選出陽性克隆子。3.3.核酸分子雜交檢測法核酸分子雜交檢測法4.4.免疫化學(xué)檢測法免疫化學(xué)檢測法 基本過程與核酸分子雜交檢測法相似，不同的是該法使用抗基本過程與核酸分子雜交檢測法相似，不同的是該法使用抗體探針，而非體探針，而非DNADNA探針來鑒定目的基因表達(dá)產(chǎn)物。因而其前提探針來鑒定目的基因表達(dá)產(chǎn)物。因而其前提條件是克隆基因可在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并且有目的蛋白的抗體。條件是克隆基因可在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并且有目的蛋白的抗體。放射性抗體檢測法放射性抗體檢測法免疫沉淀檢測法免疫沉淀檢測法酶聯(lián)免疫檢測法（酶聯(lián)免疫檢測法（ELISAELISA） 采用非放射性標(biāo)記物（辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）偶采用非放射性標(biāo)記物（辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）偶合第二抗體，然后與目的蛋白抗原合第二抗體，然后與目的蛋白抗原- -抗體復(fù)合物結(jié)合，通過檢抗體復(fù)合物結(jié)合，通過檢測非放射性標(biāo)記