1、關(guān)于基因治療的原理 (2)第一頁，講稿共四十六頁哦基因治療分類體細(xì)胞(somatic cell)基因治療生殖細(xì)胞(germline)基因治療只限于某一體細(xì)胞的基因的改變只限于某個(gè)體的當(dāng)代對缺陷的生殖細(xì)胞進(jìn)行矯正當(dāng)代及子代第二頁，講稿共四十六頁哦一、基因治療的策略 內(nèi)容提要二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 三、基因干預(yù)第三頁，講稿共四十六頁哦一、基因治療的策略第四頁，講稿共四十六頁哦 （一）基因置換（gene replacement） 定義：指將特定的目的基因?qū)胩囟?xì)胞，通過定位重組，以導(dǎo)入的正常基因置換基因組內(nèi)原有的缺陷基因。 目的：將缺陷基因的異常序列進(jìn)行橋正。 對缺陷基因的缺陷部位進(jìn)行精確的原位修復(fù)，不

2、涉及基因組的任何改變。 第五頁，講稿共四十六頁哦要實(shí)現(xiàn)基因置換，需要采用同源重組技術(shù)使相應(yīng)的正?；蚨ㄏ?qū)胧荏w細(xì)胞的基因缺陷部位。定向?qū)氲陌l(fā)生率約1/100萬，采用胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的方法，這種同源重組的檢出率最高可達(dá)1/10。第六頁，講稿共四十六頁哦（二） 基因添加 基因添加或稱基因增補(bǔ)（gene augmentation）: 通過導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)其本身不表達(dá)的基因。類型:在有缺陷基因的細(xì)胞中導(dǎo)入相應(yīng)的正常基因，而細(xì)胞內(nèi)的缺陷基因并未除去，通過導(dǎo)入正?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)物，補(bǔ)償缺陷基因的功能；向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞本來不表達(dá)的基因，利用其表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。第七頁，講稿共四十六頁哦（

3、三）基因干預(yù)基因干預(yù)（gene interference）: 采用特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)，或者通過破壞某個(gè)基因的結(jié)構(gòu)而使之不能表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。第八頁，講稿共四十六頁哦（四）自殺基因治療自殺基因治療:惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。原理:將“自殺”基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，這種基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性代謝物，誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生“自殺”效應(yīng)，從而達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的。第九頁，講稿共四十六頁哦（五）基因免疫治療 通過將抗癌免疫增強(qiáng)細(xì)胞因子或MHC基因?qū)肽[瘤組織，以增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中的抗癌免疫反應(yīng)。 第十頁，講稿共四十六頁哦二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)第十一頁，講稿共四十六頁哦基因

4、治療的兩種途徑載體目的基因in vivoex vivo靶細(xì)胞第十二頁，講稿共四十六頁哦 基因轉(zhuǎn)移(gene transfer)技術(shù) 1.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。 2.非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。第十三頁，講稿共四十六頁哦 1.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng) 病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率較高，因此它也是使用最多的基因治療載體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有72%的臨床實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和71%的病例使用了病毒載體，其中用得最多的是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。第十四頁，講稿共四十六頁哦Retrovirus逆轉(zhuǎn)錄病毒 第十五頁，講稿共四十六頁哦逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)由兩部分組成： (1) 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 (2) 輔助細(xì)胞株(如PA317)第十六頁

5、，講稿共四十六頁哦 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點(diǎn) 逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜上由env編碼的糖蛋白，能夠被許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上的特異性受體識(shí)別，從而使逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的遺傳物質(zhì)高效地進(jìn)入靶細(xì)胞。 逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因gag、env和pol的缺失不影響其他部分的活性。 前病毒可以高效整合至靶細(xì)胞基因組中，有利于外源基因在靶細(xì)胞中的永久表達(dá)。 包裝好的假病毒顆粒（攜帶目的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體）以芽生的方式分泌至輔助細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中，易于分離制備。 第十七頁，講稿共四十六頁哦 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要缺點(diǎn) 隨機(jī)整合，有插入突變、激活癌基因的潛在危險(xiǎn)； 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的容量較小，只能容納7 kb以下的外源基因。第十八頁，講

6、稿共四十六頁哦 （2）腺病毒(adenovirus，AV)載體 腺病毒是一種大分子(36 kb)雙鏈無包膜DNA病毒。它通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中。 腺病毒是人類呼吸道感染的病原體，但目前尚未發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生有關(guān)聯(lián)。宿主細(xì)胞范圍廣，可感染分裂和非分裂終末分化細(xì)胞，如神經(jīng)元等。 第十九頁，講稿共四十六頁哦腺病毒的優(yōu)點(diǎn)1.基因?qū)胄矢?，對人類安全?.宿主范圍廣；3.基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞分裂無關(guān)；4.重組腺病毒可通過口服經(jīng)腸道吸收、或噴霧吸入或氣管內(nèi)滴注；5.腺病毒載體容量較大，可插入7.5 kb外源基因；第二十頁，講稿共

7、四十六頁哦 腺病毒載體缺點(diǎn)2.宿主的免疫反應(yīng)導(dǎo)致腺病毒載體表達(dá)短暫。3.有兩個(gè)環(huán)節(jié)可能產(chǎn)生復(fù)制型腺病毒。4.靶向性差。 1.不能整合到靶細(xì)胞的基因組DNA中。分裂增殖快的細(xì)胞，導(dǎo)入的重組病毒載體，隨分裂而丟失的機(jī)會(huì)增多，表達(dá)時(shí)間相對較短。(1)腺病毒產(chǎn)生過程中與293輔助細(xì)胞內(nèi)E1區(qū)序列發(fā)生同源重組；(2)腺病毒載體與被治療的患者體內(nèi)已感染的野生型腺病毒，甚至乳頭瘤病毒、巨細(xì)胞病毒發(fā)生重組。第二十一頁，講稿共四十六頁哦 （3）腺病毒相關(guān)病毒載體 腺病毒相關(guān)病毒(adenovirus associated virus，AAV)是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒。其基因組DNA小于5 kb，無包膜，外

8、形為裸露的20面體顆粒。AAV不能獨(dú)立復(fù)制，只有在輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒）存在時(shí)，才能進(jìn)行復(fù)制和溶細(xì)胞性感染，否則只能建立溶源性潛伏感染。AAV Virus Particles第二十二頁，講稿共四十六頁哦AAV的特點(diǎn) 以潛伏感染為主； 病毒基因組與細(xì)胞共存； 只要宿主細(xì)胞正常，AAV基因表達(dá)就處于抑制而維持潛伏狀態(tài)； 若細(xì)胞受刺激，表達(dá)應(yīng)激基因，AAV基因表達(dá)從而使AAV病毒復(fù)制； 產(chǎn)生子代病毒并釋放，又感染新的細(xì)胞，建立新的潛伏狀態(tài)。第二十三頁，講稿共四十六頁哦 AAV載體是目前正在研究的一類新型安全載體，它對人類無致病性。 AAV可以高效定點(diǎn)整合至人19號染色體的特定區(qū)

9、域19q13.4中，并能較穩(wěn)定地存在。這種靶向定點(diǎn)整合可以避免隨機(jī)整合可能帶來的抑癌基因失活和原癌基因激活的潛在危險(xiǎn)性，而且外源基因可以持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，并可受到周圍基因的調(diào)控，兼具逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體兩者的優(yōu)點(diǎn)。 第二十四頁，講稿共四十六頁哦 AAV載體的缺陷： AAV載體容量小，目前最多只能容納5 kb外源DNA片段；感染效率比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體低。在40%-80%的成人中存在過感染，可能會(huì)引起免疫排斥。第二十五頁，講稿共四十六頁哦 2.非病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng) （1）脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低廉。 基本原理:利用陽離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可

10、以自動(dòng)形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細(xì)胞一起孵育，即可通過細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)行表達(dá)。 第二十六頁，講稿共四十六頁哦 （2）受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù) 將DNA與細(xì)胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，可使DNA具有靶向性。這種偶聯(lián)通常通過多聚陽離子（如多聚賴氨酸）來實(shí)現(xiàn)。多聚陽離子與配體共價(jià)連接后，又通過電荷相互作用與帶負(fù)電荷的DNA結(jié)合，將DNA包圍，只留下配體暴露于表面。這樣形成的復(fù)合物可被帶有特異性受體的靶細(xì)胞吞飲，從而將外源DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞。第二十七頁，講稿共四十六頁哦 （3）基因直接注射技術(shù) 不需要進(jìn)行基因工程的繁瑣操作，直接將裸露基因DNA注入動(dòng)物肌肉或某些器官

11、組織內(nèi)。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：接受注射外源DNA的小鼠能夠按其基因編碼合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，并能維持?jǐn)?shù)月之久。 1.將促進(jìn)心臟血管生長的基因直接注入實(shí)驗(yàn)鼠的心臟，可使其心臟壁內(nèi)毛細(xì)血管增加30%40%； 2.將胰島素基因直接注入鼠骨骼肌細(xì)胞，能分泌糖尿病所缺少的胰島素； 3.肌內(nèi)注射凝血因子基因，可產(chǎn)生血友病所需的凝血因子等等。第二十八頁，講稿共四十六頁哦 基因直接注射法的優(yōu)點(diǎn)1.制備具有調(diào)控部件的質(zhì)粒DNA重組體的技術(shù)較容易；2.排除病毒載體可能潛在的致癌性或其他副作用；3.導(dǎo)入的基因不需整合即可表達(dá)，避免了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入整合后，一旦發(fā)生副作用不易中止或逆轉(zhuǎn)的缺點(diǎn)；4.基因直接注射法可反復(fù)使用，而

12、病毒載體則可能誘導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答，致使反復(fù)治療效果下降。 第二十九頁，講稿共四十六頁哦三、基因干預(yù)第三十頁，講稿共四十六頁哦基因干預(yù)的種類：1.反義RNA (antisense RNA)2.干擾RNA (RNA interference)3.核酶 (ribozyme)第三十一頁，講稿共四十六頁哦 （一）反義RNA 1. 反義RNA與基因表達(dá)調(diào)控 利用反義RNA對體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控，通常采用的方法有兩種： （1）體外合成反義RNA，直接作用于培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞吸收RNA后，發(fā)揮作用。 （2）構(gòu)建能轉(zhuǎn)錄反義RNA的重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄出反義RNA而發(fā)揮作用。第三十二頁，講稿共四十六

13、頁哦2.受體介導(dǎo)反義RNA技轉(zhuǎn)移術(shù) 受體介導(dǎo)的RNA轉(zhuǎn)移十分專一，而且效率高；被轉(zhuǎn)移的RNA是被保護(hù)的，與周圍環(huán)境之間存在多聚賴氨酸的保護(hù)層, 可以抵抗環(huán)境中的核酸酶的降解作用。 將脫唾液酸血清類粘蛋白（ASGP）與多聚賴氨酸（PL）共價(jià)連接，得到ASGP-PL復(fù)合物，成為運(yùn)載核酸的工具。ASGP-PL反義RNA復(fù)合物可以專一性地被肝細(xì)胞表面的ASGP受體所識(shí)別，并吞噬到肝細(xì)胞中，反義RNA進(jìn)入肝細(xì)胞后，可被逐漸釋放出來發(fā)揮作用。 借助受體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)移方法把DNA換成反義RNA，就可以實(shí)現(xiàn)受體介導(dǎo)的反義RNA的轉(zhuǎn)移。第三十三頁，講稿共四十六頁哦 3. 反義RNA的應(yīng)用前景 受體介導(dǎo)的反義RN

14、A基因治療有其自身的優(yōu)點(diǎn)，而在一定程度上補(bǔ)充了轉(zhuǎn)基因治療的不足。 （l）安全性高 （2）反義RNA設(shè)計(jì)和制備方便 （3）具有劑量調(diào)節(jié)效應(yīng) （4）能直接作用于一些RNA病毒 反義RNA只作用于特異的mRNA分子，不改變所調(diào)節(jié)基因的結(jié)構(gòu)。反義RNA分子無論怎樣修飾，最終將在細(xì)胞內(nèi)部被降解，不留“殘?jiān)薄?在治療RNA病毒感染性疾病時(shí)，受體介導(dǎo)的反義RNA基因治療比一般的DNA基因治療有更大的優(yōu)勢。利用反義RNA可以直接作用于病毒RNA，阻斷RNA病毒的繁殖。第三十四頁，講稿共四十六頁哦（二）干擾RNA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，有義鏈RNA（sense RNA）或反義鏈RNA（antisense RNA）均能

15、抑制線蟲基因的表達(dá)，雙鏈RNA比單鏈RNA更為有效。將特異的雙鏈RNA注入線蟲體內(nèi)可抑制有同源序列的基因的表達(dá)。得到的結(jié)果是有義鏈RNA和反義鏈RNA都同樣阻斷基因表達(dá)途徑。這與傳統(tǒng)上對反義RNA技術(shù)的解釋正好相反。而且其抑制基因表達(dá)的效率比反義RNA至少高2個(gè)數(shù)量級。1.RNA干擾現(xiàn)象 RNA干擾（RNA interference， RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因的表達(dá)。 對RNA干擾的認(rèn)識(shí)來源于用線蟲（C. elegans）和果蠅所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。第三十五頁，講稿共四十六頁哦 2.RNA干擾的機(jī)制

16、 RNA干擾過程主要有2個(gè)步驟： （1）小干擾性RNA（siRNA）（2）siRNA與細(xì)胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex, RISC)。 該復(fù)合體可識(shí)別與siRNA有同源序列的mRNA，并在特異的位點(diǎn)將該mRNA切斷。 長雙鏈RNA被細(xì)胞內(nèi)的雙鏈RNA特異性核酸酶Dicer切成21-23個(gè)堿基對的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA（small interfering RNA，siRNA）。第三十六頁，講稿共四十六頁哦3.RNA干擾的應(yīng)用前景 RNA干擾研究目前已經(jīng)在功能基因組學(xué)研究、微生物學(xué)研究、基因治療和信號

17、轉(zhuǎn)導(dǎo)等廣泛領(lǐng)域取得了令人矚目的進(jìn)展，使其在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用有著廣闊的前景。第三十七頁，講稿共四十六頁哦（1） 研究基因功能的新工具 由于 RNA干擾技術(shù)具有高度的序列專一性和有效的干擾能力，可以使特定基因沉默或功能喪失，因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強(qiáng)有力的研究工具。 RNA干擾技術(shù)能夠在哺乳動(dòng)物中抑制特定基因的表達(dá)，建立多種表型；抑制基因表達(dá)的時(shí)間可以控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。 第三十八頁，講稿共四十六頁哦 （2） 腫瘤的基因治療 傳統(tǒng)反義RNA技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷，不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長，而RNA干擾技術(shù)可以利用同一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很

18、高的保守序列這一特性，設(shè)計(jì)針對這一區(qū)段序列的雙鏈RNA分子，只使用一種雙鏈RNA即可以產(chǎn)生多個(gè)基因同時(shí)剔除的表型，也可以同時(shí)使用多種雙鏈RNA而將多個(gè)序列不相關(guān)的基因同時(shí)剔除。RNA干擾技術(shù)可用于治療有異常基因表達(dá)的惡性腫瘤。 K-RAS蛋白為腫瘤發(fā)生所必需，bcr/ab1融合基因與人白血病有關(guān)，用RNA干擾技術(shù)可以阻礙K-RAS蛋白的表達(dá)從而抑制腫瘤發(fā)生，或殺死有bcr/ab1的人白血病細(xì)胞系。 通過RNA干擾抑制某些內(nèi)源性基因的表達(dá)，能促進(jìn)白血病細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡或增加其對化療藥物的反應(yīng)性。 應(yīng)用RNA干擾技術(shù)成功地阻斷了MCF-7乳腺癌細(xì)胞中一種異常表達(dá)的與細(xì)胞增殖分化相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子基因

19、Sp1的功能。第三十九頁，講稿共四十六頁哦 （3） 病毒性疾病的基因治療 RNA干擾可以被看成是一種與免疫系統(tǒng)類似的防御機(jī)制。用siRNA抑制人類免疫缺陷病毒（HIV）某些基因的表達(dá)，如P24、Vif、nef、tat或rev，阻礙HIV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。用RNA干擾技術(shù)抑制HIV的受體（CD4）或輔助受體（CXCR4或CCR5）在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，可阻礙HIV感染細(xì)胞。也可通過RNA干擾抑制其他病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，如脊髓灰質(zhì)炎病毒、人乳頭狀瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等。第四十頁，講稿共四十六頁哦 siRNA在病毒感染的早期階段能有效地抑制病毒的復(fù)制，病毒感染能被針對病毒基因和相關(guān)宿主基因的siRNA所阻斷，RNA干擾技術(shù)將成為一種有效的抗病毒治療手段。這對于許多嚴(yán)重的病毒性疾病的防治具有十分重大的意