1、病毒誘導(dǎo)的基因(jyn)沉默摘要(zhiyo):病毒誘導(dǎo)(yudo)基因沉默（Virus induced gene silencing ,VIGS）是近年發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象，是快速鑒定植物基因功能的一種反向遺傳學(xué)新技術(shù)，近年來成為植物基因功能研究的有力工具。文章從病毒誘導(dǎo)基因沉默的發(fā)現(xiàn)、類型、作用機(jī)制、優(yōu)勢及不足、影響條件及對發(fā)展前景的展望等方面進(jìn)行了綜述。關(guān)鍵詞:病毒誘導(dǎo)的基因沉默；機(jī)制；應(yīng)用；基因功能因功能RNA介導(dǎo)的基因沉默(RNA- mediated gene silencing)是一種通過核酸序列特異性的相互作用來抑制基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，它廣泛存在于各種生物中,在植物中稱

2、為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing , PTGS)1。病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus induced gene silencing ,VIGS)屬于轉(zhuǎn)錄后的基因沉默，指攜帶植物功能基因cDNA 片段的重組病毒，在侵染植物體后誘導(dǎo)植物發(fā)生基因沉默而出現(xiàn)表型突變，可以通過植物表型或生理指標(biāo)上的變化來反映該基因的功能.VIGS是20世紀(jì)90年代新興的一種技術(shù)，發(fā)展迅速，已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)諸多領(lǐng)域的研究。1 VIGS的建立與發(fā)展VIGS一詞最早出現(xiàn)于van Kammen2對病毒侵染后產(chǎn)生的回復(fù)現(xiàn)象的描述，現(xiàn)已成為描述應(yīng)用重組病毒抑制內(nèi)源基因表達(dá)的專

3、門詞匯3。最早的VIGS體系采用的病毒載體是典型的RNA病毒。1995年，Kumagai等人4在煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)上插入了一段八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase，PDS) cDNA片段，當(dāng)TMV重組病毒侵染煙草后，侵染植物的葉片變成白色，研究表明被感染植株產(chǎn)生的白化效應(yīng)是因為PDS mRNA水平顯著降低引起的。PDS是類胡蘿卜素合成途徑中的一個關(guān)鍵酶，而類胡蘿卜素在植物中具有光保護(hù)的作用，類胡蘿卜素合成途徑被阻斷導(dǎo)致植物光保護(hù)功能的喪失，從而引起白化效應(yīng)。1998年，Baulcombe研究組5在馬鈴薯X病毒(Potato X

4、 virus，PVX)基因組上同樣插入了一段PDS cDNA，重組病毒侵染植物后也出現(xiàn)了失去光保護(hù)作用的白化效應(yīng),由此他們提出VIGS可以有效地抑制植物內(nèi)源基因的表達(dá),從而可以利用病毒載體進(jìn)行未知基因的功能鑒定。2001年，Baulcombe研究組6又報道了以煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)為載體的VIGS體系，發(fā)現(xiàn)無論在抑制轉(zhuǎn)基因還是內(nèi)源基因的表達(dá)上，TRV載體誘導(dǎo)基因沉默的效率和持久性都優(yōu)于PVX載體，TRV本身產(chǎn)生的癥狀也輕于PVX。目前，TRV病毒載體已在番茄(Solanum lycopersicum)、煙草(Nicotinaspp.)、矮牽牛(Petu

5、nia hybrida)、辣椒(Capsicum spp.)、擬南芥和棉花(Gossypium spp.)等多種植物上被廣泛應(yīng)用。1998年, Robertson研究組6利用雙生病毒科的番茄金色花葉病毒(Tomato golden mosaic virus, TGMV)初步建立了以DNA病毒誘導(dǎo)的基因沉默來研究植物基因組功能的體系。利用TGMV的DNA-A為載體在本氏煙上先后成功誘導(dǎo)了鎂離子螯合酶的關(guān)鍵基因Su(Sulfur)和轉(zhuǎn)熒光蛋白基因(luc)發(fā)生沉默，從而在葉片上出現(xiàn)黃色突變表型和轉(zhuǎn)luc基因植株不再發(fā)出熒光。隨后,非洲木薯花葉病毒(African cassava mosaic vi

6、rus, ACMV)和棉花皺縮病毒(Cotton leaf crumple virus, CLCrV )載體相繼在木薯和棉花中得到成功應(yīng)用, 這可能將極大地促進(jìn)木薯和棉花的功能基因研究7,8。繼RNA病毒和DNA病毒作為載體的VIGS體系之后，Gossele等人9又發(fā)展了一種基于衛(wèi)星病毒的VIGS體系, 他們對伴隨TMVU2的衛(wèi)星病毒(STMV)基因組進(jìn)行了改造,使其具有插入外源片段的能力，通過在煙草上對PDS等13個植物內(nèi)源基因的測試結(jié)果表明，STMV載體能夠有效抑制這些基因的表達(dá)并呈現(xiàn)明顯的表型突變。由于衛(wèi)星病毒的基因組具有在植物中復(fù)制水平高以及本身基因組小，且在實驗中容易操作等特點，使其

7、成為一種優(yōu)良的候選沉默載體。2 VIGS的作用(zuyng)機(jī)制基因沉默(chnm)在生物中普遍存在，其作用表現(xiàn)在抵御病毒(bngd)、轉(zhuǎn)座子等外來核酸的入侵，識別并抑制外源基因表達(dá)，維持生物基因組穩(wěn)定性等（Baulcombe，2004）。VIGS作為基因沉默的特殊形式，是植物抗病毒侵染的一種自然機(jī)制。當(dāng)病毒或攜帶cDNA的病毒載體侵染植物后，在復(fù)制與表達(dá)過程中通常會形成雙鏈RNA（Double stranded RNA，dsRNA）形式的中間體。dsRNA作為基因沉默關(guān)鍵激發(fā)子，首先在細(xì)胞中被類似RNase 家族特異性核酸內(nèi)切酶Dicer類似物（如DCL4）切割成21 24 nt的小分子干擾

8、RNA（Small interfering RNA，siRNA）（Llave，2010）。siRNAs 在植物細(xì)胞內(nèi)被依賴RNA的RNA聚合酶1（RNA-dependent RNA polymerase 1，RDR1）、RDR2 或RDR6進(jìn)一步擴(kuò)增（Donaire et al.，2008），并以單鏈形式與Agronaute1（AGO1）蛋白等結(jié)合形成RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC），RISC 特異地與細(xì)胞質(zhì)中的同源RNA互作，導(dǎo)致同源RNA降解，從而發(fā)生轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默（Post-transcriptional gene s

9、ilencing，PTGS）（Brodersen et al.，2008；Qu & Morris，2008；Llave，2010）；RISC 特異地與細(xì)胞核內(nèi)同源DNA相互作用導(dǎo)致其被甲基化等修飾，從而發(fā)生轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默（Transcriptional gene silencing，TGS）（Zheng et al.2007；Llave，2010）。3 VIGS類型(lixng)3.1RNA病毒(bngd)誘導(dǎo)的基因沉默RNA病毒誘導(dǎo)的基因沉默是目前研究(ynji)比較深入的一種基因沉默。2001年，Ratcliff et al 10 報道了以煙草脆裂病毒( Tobacco rattle

10、virus, TRV)為載體的V IGS體系，并比較了TRV和PVX誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因GFP、轉(zhuǎn)基因GUS、內(nèi)源基因PDS、Rubisco小亞基和LEAFY開花基因發(fā)生基因沉默的效率和持續(xù)時間，研究發(fā)現(xiàn)無論在抑制轉(zhuǎn)基因還是內(nèi)源基因的表達(dá)上，TRV誘導(dǎo)基因沉默的效率和持續(xù)性都優(yōu)于PVX，同時，TRV產(chǎn)生的病毒癥狀也輕于PVX。2002年，Holzberg et al 11 以大麥條紋花葉病毒(Barley stripe mosaic virus, BSMV)為載體，首次在單子葉植物大麥上成功抑制了PDS基因的表達(dá)。2004年，又報道了以豌豆早枯病毒( Pea early browning virus，P

11、EBV)為載體的V IGS體系，這是第1個可應(yīng)用于豆科植物基因沉默的V IGS載體12。其中，TRV是應(yīng)用最廣的VIGS載體，被應(yīng)用于本氏煙、番茄、擬南芥和馬鈴薯等多種植物。該載體目前有3個版本，即最早由Ratcliff et al構(gòu)建的版本、Liu et al13改進(jìn)的版本pYL156和pYL279，以及Valen2tine et al14的TRV22b版本。其中，Liu et al的版本插入了雙倍CaMV35S啟動子，在C端插入了1個核酶，可導(dǎo)致更有效的病毒RNA的產(chǎn)生；而TRV22b與前2個版本的區(qū)別在于TRV22b保留了TRV RNA2中的2b基因序列。不同版本的TRV載體在適用植物范

12、圍以及可沉默植物組織等方面有顯著區(qū)別。Ratcliff et al的版本目前只用于本氏煙(Nicotiana benthamiana)和茄屬(Solanum )的3個種；而pYL156則除了應(yīng)用在本氏煙和茄屬的2個種外；還適用于番茄、煙草、辣椒等作物，但不能誘發(fā)馬鈴薯栽培品種卡拉產(chǎn)生有效的基因沉默15。而TRV22b則導(dǎo)致植物根部和頂端分生組織中產(chǎn)生比上述2種TRV更好的基因沉默效果。3.2其它病毒誘導(dǎo)(yudo)的基因沉默與上述(shngsh)RNA病毒類似, DNA病毒(bngd)也能誘導(dǎo)基因沉默。1998年，北卡羅那州立大學(xué)Robertson研究組16利用雙生病毒科的番茄金花葉病毒( T

13、omato golden mosaic virus, TGMV) DNA2A為載體，在本氏煙上成功誘導(dǎo)了鎂離子螯合酶關(guān)鍵基因Su ( Sulfur)和轉(zhuǎn)基因luc熒光蛋白基因沉默，從而初步建立了以DNA病毒誘導(dǎo)的基因沉默研究植物病毒功能的體系。但是TGMV DNA2A載體誘導(dǎo)基因沉默后的效率比較低，并且病毒本身會產(chǎn)生嚴(yán)重的病毒癥狀。因此在2001年，Robertson研究組17又報道了以TGMV DNA2B為載體的VIGS體系，該載體在基因沉默效率和持久性上都比DNA2A強(qiáng)，在植株中產(chǎn)生的病毒癥狀也有所減輕。2002年，Turnage et al18利用甘藍(lán)曲葉病毒(Cabbage leaf

14、curl virus, CbLCV)在擬南芥上成功建立了VIGS體系。非洲木薯花葉病毒(African cassava mosaic virus, ACMV)也是最近報道的VIGS載體。上述3種均為單鏈環(huán)形DNA病毒,由DNA2A和DNA2B 2種組分組成，已分別被應(yīng)用于本氏煙、擬南芥和木薯的基因沉默研究19。與RNA病毒類V IGS載體相比， DNA病毒類VIGS載體的優(yōu)點是侵染性克隆構(gòu)建簡單，無需轉(zhuǎn)錄，穩(wěn)定，易于操作，但基因沉默效果不如RNA病毒類VIGS載體。以RNA病毒(bngd)和DNA病毒為載體的VIGS體系(tx)建立后，2002年，Gossele et al20對TMVU2的衛(wèi)

15、星(wixng)病毒(Tobacco mosaic satellite virus, TMSV)基因組進(jìn)行改造，使其具有插入外源片段的能力，從而建立了一種基于衛(wèi)星病毒的V IGS體系。該體系能有效地抑制煙草PDS等13個植物內(nèi)源基因的表達(dá)并呈現(xiàn)明顯的突變表型。2004年，陶小榮等21在對中國番茄黃曲葉病毒( Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV)的研究中，分離和鑒定了一種新型的DNA衛(wèi)星分子(DNA)，并對DNA上的C1基因進(jìn)行了缺失和引入多克隆位點(multiple cloning sites, MCS)，將其改造成為一種DNA衛(wèi)星載體。該

16、載體可以有效地抑制轉(zhuǎn)基因GFP的表達(dá)，也可以高效地抑制內(nèi)源基因PDS和Su的表達(dá)，可應(yīng)用于多種茄科植物的VIGS分析21 - 24 。同時，該載體自身基因組小，載體構(gòu)建操作相對容易，且對高溫不敏感，非常適用于維管束組織特異性表達(dá)基因的VIGS分析 23, 24 。VIGS有關(guān)的實驗方法4.1 VIGS環(huán)境條件的控制成功的基因沉默依賴于病毒在植物體內(nèi)的傳播和植物生長之間的相互作用，而這2個方面都受到環(huán)境條件的影響(Burch-Smith等2004)。對于病毒的傳播和有效的沉默，溫度是最重要的影響因子之一。而對于不同的植物，有效沉默所需要的溫度也可能不同。例如，用TRV 感染番茄，較好的沉默表型在

17、22 或更低的溫度下發(fā)生；而用TRV感染煙草，合適的溫度則在25 左右(Burch-Smith等2004；Ekengren等2003；Liu等2002a；Nethra 等2006)。目前的研究證明，植物培養(yǎng)室(growth chamber)是進(jìn)行VIGS 實驗較為理想的選擇，而控溫較差和溫度波動大的溫室不適宜于做VIGS實驗。另外，F(xiàn)u等(2006)發(fā)現(xiàn)，低溫和低濕的條件可以增強(qiáng)基因沉默的強(qiáng)度和延長沉默的持續(xù)時間。4.2 設(shè)計(shj)合理的實驗對照對于(duy)每個VIGS實驗(shyn)，都必須要有合適的對照來監(jiān)控沉默的效果。陽性對照通常采用八氫番茄紅素脫氫酶( phytoene desa

18、turase，PDS)基因的沉默，因為PDS沉默能引起沉默區(qū)域發(fā)生光漂白，并迅速產(chǎn)生可見的表型(Kumagai 1995)。也有一些研究選用鎂離子螯合酶(magnesium chelatase)基因作為陽性對照(Kjemtrup等1998；Peele等2001)。實驗中，為了說明病毒自身是否會引起表型，還必須用空病毒載體接種植物作為陰性對照。另一方面，陰性對照也可以顯示接種技術(shù)對植物生長的影響。我們在實驗中觀察到，較強(qiáng)烈的接種處理對植物自身生長可能會產(chǎn)生一定的影響，如真空滲透處理番茄幼苗10 d左右的時間內(nèi)，對番茄植株的生長具有較明顯的抑制。如果陰性對照(空病毒載體接種的植物)出現(xiàn)非正常的表型

19、，往往還需要添加新的陰性對照，即以不含病毒載體的水或侵染緩沖液采用相應(yīng)的接種技術(shù)處理植株。以便明確非正常的表型是來自于病毒自身的原因，還是由于接種方式引起的，從而可以進(jìn)一步選擇合適的方法或優(yōu)化條件來消除此不利影響。另外，陰性對照對后繼的沉默檢測也是必不可少的，所有的檢測都應(yīng)該以接種空病毒載體的陰性對照材料作為檢測的陰性對照。5病毒誘導(dǎo)基因沉默（VIGS）的優(yōu)缺點隨著基因組計劃的實施,越來越多的未知基因功能有待進(jìn)一步鑒定。在篩選植物功能基因上，一般是通過T2DNA和轉(zhuǎn)座隨機(jī)插入植物基因組獲得突變體，預(yù)期從表型突變上來篩選相關(guān)功能基因。在擬南芥系統(tǒng)上，這是一種篩選基因、鑒定功能的有效方法，但其周期

20、長、工作量大、過程繁瑣，而且完全依賴于轉(zhuǎn)基因體系的成熟。VIGS研究基因組功能的優(yōu)點在于周期短、成本較低、可在不同的遺傳背景下生效，一般從構(gòu)建重組載體到農(nóng)桿菌浸潤接種植物進(jìn)行功能鑒定只需幾個星期時間，因此既節(jié)省時間又節(jié)省人力和物力，可以較大規(guī)模進(jìn)行基因組序列的功能鑒定。在篩選植物功能基因上，傳統(tǒng)的方法是通過植物表型突變篩選基因。VIGS可以對成熟期的植物進(jìn)行誘導(dǎo)并產(chǎn)生表型突變，從而對致死基因的功能進(jìn)行研究。 對多基因家族的基因功能進(jìn)行研究，傳統(tǒng)的插入突變通常只能導(dǎo)致1個多基因家族中1個成員突變，其功能可以通過其它成員來彌補(bǔ)，可能不產(chǎn)生預(yù)期的表型，從而無法研究家族成員的功能。而VIGS可以解決這

21、些問題，它可使序列差異為10% -20%的同源基因發(fā)生沉默，只要選取所有家族成員的高保守區(qū)，就能沉默整個家族成員。VIGS能夠快速用于比較物種間多個基因的功能，例如用TRV-VIGS載體研究MAPK和COLL在番茄抗細(xì)菌反應(yīng)和本氏煙抗病毒反應(yīng)中的功能。盡管VIGS有諸多的優(yōu)點，但是這種方法也存在一些弊端和不足。主要表現(xiàn)在: (1) VIGS很少能夠完全地抑制一個基因的功能。對于某些靶基因，雖然有部分的沉默，但是未沉默的基因有可能產(chǎn)生足夠的功能蛋白，因此并不能觀察到典型的沉默表型；(2)如果沒有全基因組序列或是足夠的EST信息，通過VIGS將不可避免地遇到基因家族中功能冗余的干擾；(3)大部分的

22、VIGS表型不具遺傳性，所以無法應(yīng)用于種子萌發(fā)或在幼苗生長早期表達(dá)的功能基因研究；(4)基因沉默的效率或是沉默的表型并不是非常穩(wěn)定。在不同的實驗和不同的植株中，結(jié)果可能并不完全一致，解決這個問題的方法一般是在實驗中設(shè)置一個沉默后可見表型的標(biāo)記基因作為陽性對照。另外VIGS的病毒載體有限且有些病毒載體本身也能在植物的生長過程中出現(xiàn)某些癥狀或在生理上產(chǎn)生一些變化，因此在分析VIGS沉默表型時，要注意這些因素對突變表型的干擾。因而進(jìn)一步了解病毒與宿主的相互作用機(jī)制，從更深水平上認(rèn)識沉默過程中載體與目的基因的變化規(guī)律對于VIGS系統(tǒng)在植物基因功能上的研究具有非常重要的意義。6 前景(qinjng)展望

23、VIGS已成為研究基因沉默的熱點，同時也是研究植物基因功能和植物抗病毒的一種(y zhn)有力手段。VIGS載體(zit)在VIGS技術(shù)實施過程中起著重要的作用。VIGS作為植物基因功能鑒定的一種反向遺傳學(xué)新技術(shù)，與轉(zhuǎn)基因、基因敲除、反義抑制等基因功能研究方法相比，不需要繁雜的突變體篩選及轉(zhuǎn)基因植株的獲取，操作簡便，獲得表型快，成本低廉。同時，VIGS具有高通量的優(yōu)勢，且能夠應(yīng)用于細(xì)胞基本功能或發(fā)育早期相關(guān)基因的功能鑒定。因此，VIGS技術(shù)一經(jīng)誕生便得到了廣泛的應(yīng)用。其中，植物抗性相關(guān)基因的功能鑒定是VIGS技術(shù)應(yīng)用的熱點之一，包括抗病毒、真菌、細(xì)菌、昆蟲相關(guān)基因，以及逆境抗性相關(guān)基因等。VI

24、GS技術(shù)不需要轉(zhuǎn)基因，因而在發(fā)育相關(guān)基因研究上具有優(yōu)勢，被認(rèn)為是植物苗期致死相關(guān)基因功能鑒定的最佳手段。迄今已利用VIGS技術(shù)鑒定分析了蝴蝶蘭及罌粟的花形態(tài)建成、棉花纖維發(fā)育、果實成熟及篩管發(fā)育相關(guān)基因等。利用VIGS還研究鑒定了植物許多代謝途徑相關(guān)的功能基因，其中包括植物甾醇及吡咯生物合成、光合作用代謝途徑、纖維素及木質(zhì)素合成、淀粉代謝等相關(guān)基因。VIGS也可廣泛(gungfn)用于大規(guī)模篩選，以鑒定感興趣的表型和基因序列(xli)的功能。隨著VIGS作用機(jī)制深入研究、病毒(bngd)載體的不斷開發(fā)和利用、適用物種的逐漸增多、以及掌握該技術(shù)研究人員的不斷增加，VIGS將成為基因功能研究和植物

25、功能基因?qū)W研究的最有效工具。雖然VIGS技術(shù)短短幾年中取得較大的發(fā)展，但此種技術(shù)目前仍然存在一定的缺陷:(1) VIGS引起目標(biāo)基因的沉默特征不具有遺傳性;(2)如何獲得目標(biāo)基因的系統(tǒng)性沉默仍然是VIGS技術(shù)目前需要解決的問題;(3)沉默持續(xù)的時間問題。目前的研究發(fā)現(xiàn)，VIGS持續(xù)的時間可達(dá)到23個月這對于生長周期較長的植物顯然還不夠;(4)第四，目前最穩(wěn)定和最有效的VIGS載體都有一定的宿主范圍限制，其中絕大部分都只是在煙草和茄科植物(如番茄)中應(yīng)用;(5)病毒載體如何有效地接種入植物體內(nèi)，并產(chǎn)生較強(qiáng)的沉默效果，是VIGS 技術(shù)實驗操作中的關(guān)鍵性步驟。接種過程中的多種因素都可能影響接種效果，

26、如接種方式、農(nóng)桿菌的活性及濃度、緩沖液的類型等。針對不同的植物和病毒載體，探索出相應(yīng)的有效接種方法將是VIGS技術(shù)應(yīng)用中需要解決的問題。雖然VIGS 技術(shù)目前還存著一些問題，但隨著VIGS技術(shù)研究的深入必將得到逐步完善。相信VIGS技術(shù)必將在更多的植物物種中得到應(yīng)用，并將成為植物功能基因組學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的技術(shù)。參考文獻(xiàn)1 VO INNET O. RNA silencing as a plant immune system against viruses J. Trends Genet, 2001, 17 (8):449 - 459.2 vanKammen A. Virus-induced g

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