1、3.1 莖尖分生組織培養(yǎng)的應(yīng)用3.1.1 形態(tài)建成研究莖尖分生組織培養(yǎng)取材便利,培養(yǎng)條件能嚴格控制, 十分有利于形態(tài)建成的研究.3.1.2 無病株的生產(chǎn) 迄今為止, 人們發(fā)現(xiàn)的植物病毒已超過500種, 無病毒苗的培養(yǎng)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中作用越來越大, 取得了良好的經(jīng)濟效益和社會效益.3.1.3 營養(yǎng)繁殖 莖尖組織培養(yǎng)可以嚴格控制和調(diào)節(jié)適宜的營養(yǎng)、激素濃度、溫度、光照等外部條件，使許多在常規(guī)條件下無法生長和繁殖的植物材料成功快速繁殖。3.1.4 應(yīng)用于育種 因莖尖遺傳性穩(wěn)定, 莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成熟, 因此該技術(shù)多用于常規(guī)方法繁殖困難的物種, 有性不親和基因與不育基因型的繁殖, 新雜交種的快速繁殖,

2、繁殖大批遺傳形狀一致的親本供大規(guī)模雜交制種。3.2 莖尖分生組織培養(yǎng)的方法3.2.1 材料的準備3.2.2 材料的消毒3.2.3 組織片的分離3.2.4 培養(yǎng)基3.2.5 培養(yǎng)條件3.3 脫毒苗培養(yǎng)和病毒檢測3.3.1 脫毒苗培養(yǎng)的意義 可以脫除嚴重患病毒病植物的病毒，恢復(fù)種性，提高產(chǎn)量和品質(zhì)。3.3.2 熱處理脫毒方法（1）脫毒原理：因為病毒和植物細胞對高溫的耐受性不同，高溫可阻止病毒擴散并抑制其增殖，使病毒濃度不斷降低，持續(xù)一段時間后，病毒將自行消失。（2）熱處理脫毒方法有二種：一中是溫湯浸漬處理；另一種是高溫空氣處理。3.3.3 莖尖培養(yǎng)脫毒(1)莖尖培養(yǎng)脫毒理論依據(jù)：植物細胞的全能性學(xué)

3、說，任何細胞都含有全套的遺傳信息，具有形成完整植株的能力；植物病毒在寄主體內(nèi)分布不均勻，莖尖部位病毒含量極低或不含病毒。 莖尖培養(yǎng)脫毒效果的好壞與莖尖大小呈負相關(guān)，切取的莖尖越小，脫毒效果越好；而培養(yǎng)莖尖成活率的高低則與莖尖大小呈正相關(guān)，切取莖尖越小，成活率越低。(2) 莖尖培養(yǎng)脫毒方法1)培養(yǎng)脫毒母株,獲得外植體2)選擇培養(yǎng)基MS適合大多數(shù)雙子葉植物培養(yǎng)；B5和N6培養(yǎng)基適合于大多數(shù)單子葉植物；White培養(yǎng)基適合于根的培養(yǎng)。3) 剝離和接種將消毒好的莖段或芽置超凈工作臺的雙目解剖鏡下，用解剖針剝離幼葉和葉原基，切取適當(dāng)大小，接種到芽分化培養(yǎng)基上。4) 繼代培養(yǎng)生根和快速繁殖將接種外植體置于

4、25度左右、光照度3000lx的實驗室中，光周期13-16h/d，培養(yǎng)2-3周成苗。苗高1-2cm高時，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，7-10天后生根，再繼代成壯苗后移栽。(3)莖尖培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)1）剝離適當(dāng)大小的莖尖一般剝離帶1-2個葉原基的莖尖即可獲得較好的脫毒效果。2）選擇合適培養(yǎng)基生長素/細胞分裂素的比值大于1時有利于根的形成，否則有利于芽的分化。3）給予適宜的環(huán)境條件莖尖培養(yǎng)脫毒的其他幾種方法：1）熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒2）微體嫁接脫毒3）抗病毒藥劑脫毒4）脫毒苗保存3.3.4 病毒的概念與形態(tài)(1) 概念 病毒是一種非細胞形態(tài)的必須在活細胞中才能增殖的專性寄生物, 是最小的生命實體, 是由一

5、種核酸和蛋白質(zhì)衣殼組成的非細胞形態(tài)的分子生物。（2） 病毒的形態(tài)植物病毒的基本形態(tài)為粒體(virion, virus particle)。大部分病毒的粒體為球狀（等軸粒體）、桿狀和線狀，少數(shù)為彈狀、桿菌狀和雙聯(lián)體狀等。線狀病毒一般長4801250nm，寬1013nm；桿狀病毒一般長130300nm，寬1520nm；桿菌狀病毒一般長58240nm，寬1819nm。球狀病毒為多面體，直徑1680nm。球形病毒的結(jié)構(gòu)球形病毒的結(jié)構(gòu)模式結(jié)構(gòu)圖植物病毒的各種形態(tài)常見形態(tài)有 桿形 線形 球形 彈形等(3) 植物病毒對生產(chǎn)的影響引起多種植物病害，大多數(shù)植物都不同程度地受到病毒的危害:茄科和十字花科植物上，有

6、50%的病害為病毒病；在煙草,馬鈴薯上病毒危害重要；在花卉上，病毒病使品質(zhì)和產(chǎn)量降低，甚至影響進出口；大麥黃矮病毒，曾使美國小麥損失6000萬美元，加拿大損失1700萬美元。(4) 植物病毒的組成成分植物病毒主要成分是核酸和蛋白質(zhì)，核酸在內(nèi)部，外部由蛋白質(zhì)包被，稱為外殼。合稱為核蛋白或核衣殼。有的病毒粒體中還含有少量的糖蛋白或脂類、水分等。類病毒則沒有蛋白質(zhì)外殼，僅為RNA的分子。核酸是病毒的核心，組成了病毒的遺傳信息組基因組(genome)，決定病毒的增殖、遺傳、變異和致病性。(5) 病毒核酸的比例 不同形態(tài)粒體的病毒中核酸的比例不同，一般說，球形粒體病毒的核酸含量高，占粒體重量的15 45

7、，長條形粒體病毒中核酸含量占5% 6；而在彈狀病毒中只占1左右。衛(wèi)星RNA 在某些多分體病毒中發(fā)現(xiàn)了小分子量的RNA，其與病毒RNA沒有同源性，單獨不能侵染，要依賴病毒的核酸才能侵染和增殖，這種核酸稱為衛(wèi)星RNA(satellite RNA，sRNA)，其依賴的病毒稱為輔助病毒。衛(wèi)星RNA與輔助病毒包被在同一衣殼內(nèi)，并能抑制輔助病毒的復(fù)制，降低其濃度并改變其致病力，利用sRNA與病毒的關(guān)系，可進行生物防治及基因工程抗病毒育種研究。病毒的其它組成成分除蛋白和核酸外，植物病毒含有的最大量的其它組分是水分，例如在西紅柿束矮病毒和蕪菁黃花葉病毒的結(jié)晶體中，水分的含量分別為47和58。 碳水化合物主要發(fā)

8、現(xiàn)在植物彈狀病毒科病毒中，以糖蛋白或脂類的形式存在于病毒的囊膜中。如西紅柿斑萎病毒合有7的碳水化合物。某些病毒粒體含多胺，主要是精胺和亞精胺，它們與核酸上的磷酸基團相互作用，為穩(wěn)定折迭的核酸分子。金屬離子也是許多病毒必須的，主要有鈣離子、鈉離子和鎂離子。這些金屬離子與衣殼蛋白亞基上的離子結(jié)合位點作用，穩(wěn)定衣殼蛋白與核酸的結(jié)合利用離子整合劑去掉這些金屬離子，往往導(dǎo)致病毒粒體膨脹，易受核酸酶的分解。3.3.5 植物病毒的侵染與傳播(1)植物病毒的侵染因病毒是極小的生命體,不能靠自身力量主動侵入植物細胞, 只能借助外力, 通過植物細胞的微傷或昆蟲刺吸式口器, 把病毒送入植物細胞內(nèi)。(2)植物病毒的傳

9、播 1) 介體傳播 蚜蟲傳播: 在蚜蟲介體中，大約有200種蚜蟲可傳播160多種植物病毒，有的蚜蟲只傳播2-3種病毒，有的可以傳播40-50種病毒(如蠶豆蚜和馬鈴薯蚜)，桃蚜甚至可以傳播100種以上的病毒。在這160多種植物病毒中，有的只由一種蚜蟲傳播，有的可由多種蚜蟲傳播，黃瓜花葉病毒甚至可以由75種蚜蟲傳播。 線蟲傳播：現(xiàn)存發(fā)現(xiàn)的介體線蟲均為外寄生類型線蟲,屬矛線目(Dorilaimida)，游離生活于土壤中。線蟲傳病毒集中在蠕傳病毒屬(Nepovirus)和煙草脆裂病毒屬(Tobravirus)中。 葉蟬和飛虱：在葉蟬亞目大約2000個屬15000種葉蟬中，只有21個屬中的49種是病毒的

10、傳播介體。介體的寄主主要是禾本科植物，重要的作物病害如水稻矮縮病、小麥叢矮病和玉米粗縮病等。土壤中的介體：現(xiàn)已明確除了TMV可在土壤中存活較久外，土壤本身并不傳毒，主要是土壤中的線蟲或真菌傳播病毒。病毒侵染植物以后，在活細胞內(nèi)增殖后代病毒需要兩個步驟： (1)病毒核酸的復(fù)制(replication) 從親代向子代病毒傳送核酸性狀的過程，即病毒的基因傳遞 (2)病毒核酸信息的表達植物病毒增殖復(fù)制的主要步驟侵入活細胞并脫殼核酸復(fù)制和基因表達病毒粒體的裝配擴散轉(zhuǎn)移植物病毒的復(fù)制概況示意圖2)接觸傳播無性繁殖材料和嫁接傳播:由于病毒系統(tǒng)侵染的特點，在植物體內(nèi)除生長點外各部位均可帶毒，在以球莖、塊根、接

11、穗芽為繁殖的作物中特別重要，如馬鈴薯、大蒜、郁金香、蘋果樹等，如母株受侵染則無一幸免。這些無性繁殖材料都可以帶毒，故成為重要的檢疫對象。嫁接是園藝上非常普通的農(nóng)事措施之一，也是證明疑難病原物侵染性的重要方法之一。嫁接可以傳播任何種類的病毒、植物菌原體和類病毒病害。種子和花粉傳播:隨著研究發(fā)展及檢測技術(shù)水平的提高，已報道種傳的病毒及其寄主植物種類大為增加，現(xiàn)在估計約15的已知病毒可以種傳。種子帶毒的危害主要表現(xiàn)在早期侵染和遠距離傳播，早期侵染提供初侵染來源，在田間形成發(fā)病中心；尤其是和蚜蟲非持久性傳毒方式結(jié)合極有可能造成嚴重危害。種傳病毒的寄主以豆科、葫蘆科、菊科植物為多，而茄科植物卻很少。 由

12、花粉直接傳播的病毒數(shù)量并不多，現(xiàn)在知道的有十幾種，但多數(shù)是木本寄主，如危害櫻桃的桃環(huán)斑病毒、櫻桃卷葉病毒；危害懸鉤子的懸鉤子環(huán)斑病毒、黑懸鉤子潛隱病毒、懸鉤子叢矮病毒以及酸櫻桃黃化病毒等。這些花粉也可以由蜜蜂攜帶傳播。植物病毒在植株體內(nèi)的轉(zhuǎn)移3.3.6 病毒的檢測植物病毒的鑒定與檢測方法:(1)指示植物法 利用病毒在其他植物上產(chǎn)生的枯斑作為鑒別病毒種類的標準，也叫枯斑和空斑測定法。 有的植物對污染物非常敏感。如牽?；ㄖ泻谢ㄇ嗨兀撋卦趬A性溶液中為藍色，在酸性溶液中為紅色，故從早晨至晚上，隨著二氧化碳含量增加，牽?；ɑㄉ珡乃{變紅。牽?；词菍諝庵卸趸紳舛鹊闹甘局参铩Ｑ┧蓪Χ趸蚝头瘹浜苊舾?，當(dāng)空氣中存在這兩種氣體時，其葉片就會出現(xiàn)枯黃現(xiàn)象。紫鴨跖草在低強度的輻射后，花色即由藍色變成粉紅，這種植物可以作為測量輻射強度的“指示劑”。 (2)抗血清鑒定法 抗體是動物在外來抗原的刺激下產(chǎn)生的一種免疫球蛋白。抗體主要存在于血清中，含有抗體的血清稱為抗血清。因不同病毒的血清具有特異性，因此用已知病毒的抗血清即可鑒定未知病毒的種類。 抗血清也是植物病毒鑒定中最有用的方法之一。(3)電子顯微鏡鑒定法 電子顯微鏡分辨力可達0.5nm。比生物學(xué)鑒定更直觀，鑒定速度快。(4)酶聯(lián)免疫測定法具有極高的靈敏度、特異性強、安全快速和容易觀察結(jié)果的優(yōu)點。3.3.7